李磊，高鑫，齊宏斌，李超，路福平，3，毛淑紅，3，秦慧民，3

（1工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；3工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

塑料類(lèi)產(chǎn)品是人類(lèi)生產(chǎn)和生活的必需品，為人類(lèi)的日常生活帶來(lái)了諸多便利，因其成本低、絕緣性好、可塑性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)被廣泛使用。由于人類(lèi)對(duì)塑料的需求急劇上升，在過(guò)去25年里，全球塑料產(chǎn)量翻了兩倍［1］。Borrelle等對(duì)173個(gè)國(guó)家的塑料使用進(jìn)行定量評(píng)估，2016年全球廢棄塑料量有1900萬(wàn)～2300萬(wàn)噸，到2030年預(yù)計(jì)達(dá)到5300萬(wàn)噸/年［2］。同時(shí)，國(guó)內(nèi)塑料的生產(chǎn)與處理情況亦日益嚴(yán)重，2020全年塑料丟棄量高達(dá)3840萬(wàn)噸（圖1）。由于不合理處置，大多數(shù)的塑料垃圾被傾倒在陸地和海洋中。早在21世紀(jì)初，塑料就占到海洋垃圾的60%～80%，某些地區(qū)甚至高達(dá)90%～95%［3］。顯然“白色污染”已經(jīng)成為一種全球的威脅，嚴(yán)重影響到全球海洋及生態(tài)系統(tǒng)。此外，廢棄在陸地上的塑料暴露在氧氣和強(qiáng)烈的陽(yáng)光下，經(jīng)過(guò)衰變和裂解會(huì)形成微塑料，被鳥(niǎo)類(lèi)和魚(yú)類(lèi)誤食后，通過(guò)食物鏈被人體攝入從而帶來(lái)極大的危害［4］。

圖1 2020年中國(guó)塑料生產(chǎn)及處理情況Fig.1 Plastic production and processing in China in 2020(The data in the figure come from the National Bureau of Statistics.In 2020,the output of plastic products in China was 76.032 million tons,and the consumption of plastics was 90.877 million tons.Compared with 2019,this was a 12.2%increase.Plastic waste was 38.4 million tons.Green recycling accounts for 17.6%of the total waste)

從塑料加工生產(chǎn)的原材料來(lái)看，由天然或者生物大分子組成的高聚物可作為天然塑料，這類(lèi)塑料雖然能被微生物降解，但是占比較?。?］，僅占塑料市場(chǎng)的25%～30%左右；另一類(lèi)是單體經(jīng)聚合反應(yīng)形成的高分子聚合物合成塑料，這類(lèi)塑料種類(lèi)繁多、廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，但很難被降解。塑料產(chǎn)品中使用較為廣泛的聚對(duì)苯二甲酸乙二酯（polyethylene terephthalate，PET），是由對(duì)苯二甲酸二甲酯與乙二醇酯交換或以對(duì)苯二甲酸與乙二醇酯化先合成對(duì)苯二甲酸雙羥乙酯，再經(jīng)縮聚反應(yīng)形成，屬于結(jié)晶型飽和聚酯，根據(jù)所用領(lǐng)域的不同對(duì)PET結(jié)晶度調(diào)整；2013年全球產(chǎn)量高達(dá)5600萬(wàn)噸［6］。因其成本低、耐用性好以及優(yōu)良的食品包裝性能，PET成為最受歡迎的塑料之一，全球有一半以上的合成纖維和塑料瓶屬于PET。PET塑料的骨架上存在芳香化合物對(duì)苯二甲酸（TPA）難以被降解，因此，PET塑料的回收方式及有效降解成為其綠色發(fā)展的卡脖子問(wèn)題。

傳統(tǒng)的PET處理的方法主要包括填埋、回收、焚燒、化學(xué)降解等［7-8］，還會(huì)造成降級(jí)使用、工藝復(fù)雜、二次污染大等問(wèn)題，利用新興的合成生物學(xué)技術(shù)手段探索塑料的生物降解能避開(kāi)這些缺點(diǎn)，通過(guò)代謝將其轉(zhuǎn)化為水、二氧化碳、生物質(zhì)等進(jìn)入地球循環(huán)系統(tǒng)；20多年來(lái)，對(duì)PET生物降解的研究一直是全球熱門(mén)問(wèn)題［5］。大多數(shù)可生物降解的塑料都是聚酯塑料，盡管PET主鏈中含有對(duì)苯二甲酸酯以及PET的半結(jié)晶性質(zhì)會(huì)影響自身降解，但在利用生物降解方面潛力依然很大。利用微生物代謝或者多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)將PET解聚成單體，同時(shí)也可進(jìn)一步反應(yīng)生成高附加值產(chǎn)品；通過(guò)對(duì)酶元件和新型改良PET材料利用計(jì)算機(jī)模擬進(jìn)行“雙向改造”，達(dá)到預(yù)期的降解效果。本文重點(diǎn)綜述了包括宏基因組學(xué)在內(nèi)的多種酶的篩選與挖掘方法、PET的雙向改造以及相關(guān)酶的計(jì)算機(jī)智能設(shè)計(jì)與改造情況，同時(shí)還總結(jié)了降解PET的微生物和酶的研究進(jìn)展。

1 塑料降解微生物及新酶基因篩選與挖掘方法

過(guò)去幾十年間用于挖掘微生物和新酶基因的常規(guī)培養(yǎng)方法一直被延用，利用該方法發(fā)現(xiàn)了迄今大多數(shù)的塑料降解酶，但這種方法限制了挖掘新的塑料降解酶的篩選速度［9-12］。首先選取環(huán)境樣本，在塑料作為唯一碳源的培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)，分離出可利用塑料的功能性菌株，再進(jìn)行全基因組測(cè)序和基因文庫(kù)構(gòu)建，然后通過(guò)克隆篩選，選出可降解塑料的優(yōu)良微生物菌株，并鑒定相關(guān)酶系，進(jìn)行序列比對(duì)追溯其同源性，最后對(duì)該微生物改良馴化或?qū)γ高M(jìn)行表征［圖2（b）］［13］。但這種方法限制了挖掘新的塑料降解酶的篩選速度，據(jù)估計(jì)地球上只有不到1%的微生物被培養(yǎng)，大數(shù)據(jù)時(shí)代新型挖掘方法的綜合利用改變了這一現(xiàn)狀，大大拓寬了塑料降解酶的篩選范圍［14］。

圖2 塑料降解酶篩選與挖掘方法Fig.2 Schematic diagram of screening and mining methods for plastic-degrading enzymes

1.1 宏基因組學(xué)法

近年來(lái)，宏基因組學(xué)方法已經(jīng)成為探索微生物的有力工具，這是一種在基因組水平上分析微生物群落的戰(zhàn)略方法，從污染環(huán)境中識(shí)別和篩選宏基因組在宏基因組研究中至關(guān)重要；宏基因組學(xué)法的使用有助于從環(huán)境樣本中發(fā)現(xiàn)新基因，對(duì)功能和系統(tǒng)發(fā)育基因進(jìn)行大規(guī)模表征，以及分離以前未培養(yǎng)但無(wú)處不在群體的成員，提高了研究微生物群落及其復(fù)雜性和動(dòng)態(tài)的分辨率，以揭示其遺傳潛力和功能多樣性［15-16］。應(yīng)用該技術(shù)手段，現(xiàn)已從多種宏基因組樣本中篩選出很多能編碼降解各種類(lèi)型塑料的基因［圖2（a）］。

在利用宏基因組學(xué)法篩選過(guò)程中，通常以序列為基礎(chǔ)或者以功能為基礎(chǔ)進(jìn)行篩選，以序列為基礎(chǔ)的篩選是通過(guò)對(duì)生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列同源性以及功能基因比較來(lái)篩選目的基因［17］，但是已知的塑料降解酶生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)的大小和功能基因標(biāo)注的水平的缺陷限制了篩選和挖掘；序列同源性的大小只能作為參考，并不能保證兩種降解酶活性的相似性，需要通過(guò)對(duì)其功能和酶學(xué)性質(zhì)的表征來(lái)驗(yàn)證，也可能會(huì)因?yàn)樾蛄邢嗨菩暂^差而遺漏一些新的塑料降解酶［18］。Sulaiman等［19］以序列為基礎(chǔ)從放線菌的宏基因組文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)了一種葉枝堆肥-角質(zhì)酶（LCC），在pH 8.0、50℃條件下，其活性很高，并得出了嗜熱放線菌是PET水解酶最有前途的微生物來(lái)源的結(jié)論。LCC不僅可以作為理解PET降解酶分子機(jī)制的良好模型，而且還可能適用于表面改良和PET降解。Gaytán等［20］從垃圾填埋場(chǎng)衍生的宏基因組中檢索到了許多與編碼具有降解聚氨酯（PU）塑料活性的已知酶的基因序列相似的基因序列。

以功能為基礎(chǔ)篩選時(shí)從基因文庫(kù)出發(fā)查找所需表型并檢測(cè)其活性，在挖掘新酶方面遠(yuǎn)超于序列篩選，挖掘全新的酶基因組時(shí)，這些酶的序列與現(xiàn)有的同源酶差異較大，因此高通量篩選方法將會(huì)大大提高篩選速率［21-22］。替代表達(dá)系統(tǒng)可用于確保功能性酶表達(dá)，例如具有二硫鍵的塑料降解酶的功能性表達(dá)不適合在普通大腸桿菌中構(gòu)建，需要在畢赤酵母中構(gòu)建［23］。質(zhì)粒文庫(kù)因其覆蓋范圍小不適合功能篩選，而基因文庫(kù)的規(guī)模和覆蓋范圍在功能篩選方面起重要作用。此外，噬菌體來(lái)源的基因文庫(kù)篩選的有毒塑料降解酶不僅有利于在大腸桿菌中異源表達(dá)，而且有利于酶學(xué)性質(zhì)的表征。Danso等［24］使用hiddenMarkov模型算法，從宏基因數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)504個(gè)可能的PET水解酶候選基因進(jìn)行挖掘，篩選出4種候選酶，并異源表達(dá)驗(yàn)證了這些酶的功能，最后篩選出PET水解酶（PET2），證實(shí)了這種算法的有效性。通過(guò)從堆肥中構(gòu)建宏基因組文庫(kù)，篩選并異源表達(dá)了新型酯酶EstC7，EstC7表現(xiàn)出突出的活性和對(duì)聚已二酸/對(duì)苯二甲酸丁二酯（PBAT）芳香酯鍵水解的強(qiáng)烈偏好，這也說(shuō)明從極端自然生態(tài)系統(tǒng)的微生物中挖掘新型水解酶的巨大潛力［25］。

宏基因組樣本來(lái)源在塑料降解酶的挖掘中起著決定性作用，這些樣本中的微生物構(gòu)成了用于生物修復(fù)的巨大酶庫(kù)，其中絕大多數(shù)的微生物存在于高度復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)中［26］。通過(guò)對(duì)全球海陸環(huán)境的宏基因組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)編碼PET水解酶的基因分布廣泛，但具有低頻性，說(shuō)明此類(lèi)PET水解酶在環(huán)境中自然進(jìn)化較慢。相比于自然環(huán)境，在聚合物含量高的地方發(fā)現(xiàn)塑料降解酶的概率更大，Mayumi等［27］利用靶向宏基因組學(xué)篩選降解酶，將微生物在塑料產(chǎn)品中孵育，分離出酶學(xué)性質(zhì)好的解聚酶。Jacquin等［28］提出了塑料圈“plastisphere”的概念，即：微生物在這里適者生存，利用環(huán)境即可篩選。但此類(lèi)基因文庫(kù)還需進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。最近，科學(xué)家將宏基因組學(xué)挖掘方法與13C同位素標(biāo)記法共用，可以直接研究酶或微生物對(duì)塑料的降解過(guò)程［29］。

1.2 蛋白質(zhì)組學(xué)法

蛋白質(zhì)組學(xué)可以對(duì)蛋白質(zhì)直接檢測(cè)和量化表達(dá)，在廣泛的微生物種群中用于生物技術(shù)應(yīng)用的新酶挖掘方面表現(xiàn)出巨大潛力［30］。Schneider等［31］利用蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)真菌產(chǎn)生的生物降解酶進(jìn)行定性和定量分析，揭示真菌和細(xì)菌在垃圾分解過(guò)程中的各自作用；蛋白質(zhì)組學(xué)在生物聚合物降解酶挖掘中的可行性已經(jīng)被證明，激發(fā)了研究者應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)挖掘生物降解酶的動(dòng)力。利用蛋白質(zhì)組學(xué)挖掘塑料降解酶首先將微生物置于含有塑料的培養(yǎng)基里生長(zhǎng)，因?yàn)樗芰峡梢圆煌潭鹊卣T導(dǎo)功能微生物表達(dá)具有塑料水解活性的酶，蛋白質(zhì)組學(xué)之所以廣泛用于塑料降解酶的挖掘是由于相關(guān)微生物和塑料一起孵育時(shí)，會(huì)刺激塑料降解酶的表達(dá)［32］；然后微生物培養(yǎng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)被提取并消化成小肽進(jìn)行測(cè)序，利用生物信息學(xué)分析進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定，由于塑料無(wú)法進(jìn)入微生物體內(nèi)，參與解聚的酶需要釋放到體外，所以胞外蛋白是塑料降解酶篩選的主要目標(biāo)；最后對(duì)篩選的目標(biāo)酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析、酶動(dòng)力學(xué)表征等［圖2（c）］；Tesei等［33］把PBAT作為黑色真菌（Knufia chersonesos）的唯一碳源，對(duì)分泌類(lèi)聚酯酶進(jìn)行篩選，蛋白質(zhì)組學(xué)揭示了多種組成型表達(dá)的蛋白質(zhì)，并對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。Zadjelovic等［34］利用蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺乏的海洋微生物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)了有生物降解能力的α/β水解酶，這種酯酶的異源過(guò)表達(dá)證明了水解天然和合成聚酯的非凡能力。通過(guò)對(duì)假產(chǎn)堿假單胞菌（Pseudomonas pseudoalcaligenes）分泌蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)篩選鑒定，發(fā)現(xiàn)了新型酯酶PpEst，這是首次利用蛋白質(zhì)組學(xué)篩選鑒定PBAT降解酶的報(bào)告［35］。Jhong等［36］在抗微生物肽（AMP）的挖掘中，從大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)出發(fā)，為AMP提供全面的功能和物理化學(xué)分析，通過(guò)對(duì)AMP數(shù)據(jù)庫(kù)中AMP-蛋白質(zhì)相互作用的信息的分析、“神秘”區(qū)域檢測(cè)的抗菌效力分析、AMP目標(biāo)物種的注釋以及轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集進(jìn)行檢測(cè)，以期對(duì)AMP進(jìn)行功能分析和發(fā)現(xiàn)新抗菌藥物。這些研究為蛋白質(zhì)組學(xué)挖掘塑料降解酶提供了堅(jiān)實(shí)的理論研究基礎(chǔ)和重要參考。

由于生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)規(guī)模的局限性以及高純度蛋白質(zhì)提取困難，利用蛋白質(zhì)組學(xué)從復(fù)雜環(huán)境樣品中挖掘塑料降解酶仍然具有挑戰(zhàn)性；盡管近年來(lái)蛋白質(zhì)組學(xué)引導(dǎo)的塑料降解酶挖掘被廣泛應(yīng)用，但該挖掘方法仍然處于起步階段，目前所有的報(bào)道都是對(duì)單微生物的誘導(dǎo)培養(yǎng)。

2 塑料降解酶與微生物的研究現(xiàn)狀

PET是通過(guò)酯鍵聚合而成的水解型塑料，但由于產(chǎn)品的結(jié)晶程度不同，對(duì)其內(nèi)部酯鍵的水解難易程度也不同［37］；現(xiàn)已篩選出多種具有降解PET性能的微生物和酶，微生物分泌的胞外解聚酶對(duì)酯鍵進(jìn)行水解，把PET降解成小分子聚合物，然后被微生物進(jìn)一步分解成水和二氧化碳。酶對(duì)PET降解時(shí)，要考慮5個(gè)因素：①最適反應(yīng)溫度最好超過(guò)玻璃化溫度（Tg）；②吸水性與溫度、結(jié)晶度和聚合物鏈的取向高度相關(guān)；③結(jié)晶度；④聚合物鏈的取向是否有序；⑤表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，這取決于聚合物鏈的結(jié)晶度和取向。一些來(lái)自真菌和放線菌的脂肪酶、酯酶［38］以及角質(zhì)酶［39］被報(bào)道，這些酶具有水解非晶態(tài)PET及修飾PET膜表面的功能，酯酶作用于短鏈酰基酯，角質(zhì)酶作用于中鏈?；ィǜ哌_(dá)C8～C10），而脂肪酶作用于中長(zhǎng)鏈酰基酯。

2.1 角質(zhì)酶

天然或合成的脂肪族聚酯產(chǎn)品如PET、對(duì)苯二甲酸丁二醇酯-己二酸共聚物（BAT）在室溫下可被各種酯鍵水解酶水解，Müller等［40］首次報(bào)道了PET可被聚酯酶水解的可能。真菌角質(zhì)酶包括來(lái)自植物病原菌、非植物病原真菌以及放線菌的角質(zhì)酶，Kleeberg等［41］首次純化了來(lái)自真菌和嗜熱子囊菌（Thermobifida fusca）的蛋白，該酶可以解聚BAT，并確定了蛋白的氨基酸序列。隨后Baker等［42］對(duì)聚酯降解進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)角質(zhì)酶在聚酯的水解中起著重要作用。胡小平等［43］從嗜熱芽孢桿菌屬中分離出聚脂酶，并且從嗜熱菌（Thermobifida albaAHK119）中克隆出一個(gè)新的角質(zhì)酶，由兩個(gè)串聯(lián)角質(zhì)酶基因組成。Ribitsch等［44］從T.albaDSM43185克隆出角質(zhì)酶；此外，Acero等［45］在嗜熱菌（Thermobifida cellulosilyticaDSM44535）里發(fā)現(xiàn)了編碼角質(zhì)酶（Tc_Cut1、Tc_Cut2）的基因，其蛋白質(zhì)的氨基酸序列與此前在T.fuscaNTU22中發(fā)現(xiàn)的角質(zhì)酶Tfu_0883和Tfu_0882相同，科研人員還測(cè)定了角質(zhì)酶的活性，Tc_Cut1的活性大于Tc_Cut2，在50℃下，Tc_Cut1對(duì)37%結(jié)晶度的PET水解作用可以持續(xù)120 h。迄今為止報(bào)道的所有嗜熱菌屬都存在串聯(lián)角質(zhì)酶基因，雖然同源性較高，但活性差異很大，即便是來(lái)源于不同種屬的角質(zhì)酶基因也有很高的同源性，角質(zhì)酶的起源種屬可能是嗜熱菌屬，擁有聚酯降解性角質(zhì)酶的種屬在傳代過(guò)程中不斷進(jìn)化從而產(chǎn)生了差異。特異腐質(zhì)菌（Humicola insolens）（HiC）、門(mén)多薩假單胞菌（Pseudomonas mendocina）和腐皮鐮孢菌（Fusarium solani）來(lái)源的角質(zhì)酶被用來(lái)催化低結(jié)晶度的PET，HiC在70℃下反應(yīng)96 h轉(zhuǎn)化率可達(dá)到100%，而另外兩種酶在50℃下就會(huì)失活［46］。綠圓跳蟲(chóng)（Sminthurus viridisAHK190）來(lái)源的角質(zhì)酶（Cut190）突變體Cut190/Q138A（Cut190/S226P/R228S/Q138A）在65℃下反應(yīng)15 h可將結(jié)晶度為14.1%的PET超纖維完全水解［47］；包括HiC在內(nèi)的很多角質(zhì)酶已經(jīng)被報(bào)道有水解結(jié)晶度較大PET的能力，這說(shuō)明高結(jié)晶度的PET有被水解的潛力。來(lái)源于植物堆肥的角質(zhì)酶LCC在70℃條件下催化24 h，可降解25%無(wú)定形PET薄膜，LCC與TfH聚酯 水 解 酶 有 一 定 的 同 源 性［48］，而T.fuscaDSM43793來(lái)源的角質(zhì)酶TfH在55℃條件下催化3周，可使結(jié)晶度為10%的PET膜質(zhì)量損失50%［49］（表1）。角質(zhì)酶的獨(dú)特性質(zhì)取決于這些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)缺乏覆蓋在活性位點(diǎn)的蓋子，所以活性位點(diǎn)經(jīng)常暴露在溶液中，PET水解是聚合物鏈的靈活性和角質(zhì)酶結(jié)構(gòu)相互作用的結(jié)果。

表1 PET降解酶研究進(jìn)展Tab.1 Research progress of PET degrading enzymes

2.2 酯酶與脂肪酶

酯酶是與對(duì)硝基苯酚（p-NP）的短鏈?；ケ憩F(xiàn)出更高的活性的一類(lèi)酶，被認(rèn)為優(yōu)先水解PET的非定形區(qū)域，結(jié)晶度的增加會(huì)限制聚合物鏈的擺動(dòng)，并降低酶對(duì)聚合物鏈攻擊概率；Ribitsch等［50］從嗜鹽耐熱雙歧桿菌（Thermobifida halotoleransDSM44931）發(fā)現(xiàn)了可降解PET的酯酶，可在50℃條件下與PET相互作用，并且與放線菌來(lái)源的角質(zhì)酶有高度同源性。嗜熱鏈霉菌（Thermobifida insolens）產(chǎn)生一種分子量大約為20～21 kDa的脂肪酶在pH 8.5、80℃下展現(xiàn)出最大活性，該酶的活性位點(diǎn)由Ser140、Asp195和His208組 成，T.insolens的 結(jié) 構(gòu) 與F.solani的 酶 有較高的同源性［51-52］。嗜熱絲狀真菌的脂肪酶由269個(gè)氨基酸組成，分子量為31.7 kDa，其蛋白結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解［53］。米曲霉（Aspergillus oryzae）產(chǎn)生的脂肪酶被對(duì)苯二甲酸雙酯（BHET）誘導(dǎo)后，可水解對(duì)苯二甲酸二乙酯（DP），并且提高該酶對(duì)PET的親和力［54］。

2.3 PET水解酶

PET水解酶與許多來(lái)自非嗜熱細(xì)菌的水解酶（PET降解能力尚未見(jiàn)報(bào)道）具有65%以上的序列同源性，其中來(lái)自德氏嗜酸菌（Acidovorax delafieldiiBS-3）的解聚酶顯示出最高同源性（82%）［55］。Yoshida等［56］將Ideonella sakaiensis在結(jié)晶度為1.9%的PET上進(jìn)行培養(yǎng)，可在30℃下生長(zhǎng)40 d，并從中克隆出PET水解酶（PETase）基因，PETase與放線菌來(lái)源的角質(zhì)酶有45%～53%的氨基酸序列相同，I.sakaiensis來(lái)源的PETase（IsPETase）在迄今為止報(bào)道的所有PET降解酶中在溫和條件下具有最高的PET降解活性，在30℃下僅需3周即可完全降解PET，但其低熱穩(wěn)定性限制了有效和實(shí)用的PET酶促降解能力。

盡管PET降解酶類(lèi)的挖掘和研究處于剛剛起步階段，但是在晶體解析催化機(jī)理方面發(fā)展卻很迅速，目前已經(jīng)有多類(lèi)酶的結(jié)構(gòu)被解析，在定向改造方面發(fā)揮了極大的作用?？蒲腥藛T已經(jīng)對(duì)I.sakaiensis來(lái)源的PETase晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了報(bào)道，PETase屬于典型的α/β-水解酶折疊類(lèi)型，包含1個(gè)扭曲的中央β-折疊，由9個(gè)β-鏈組成，中間夾有6個(gè)α-螺旋，經(jīng)過(guò)與其他角質(zhì)酶的同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)PETase的催化三聯(lián)體為S131-H242-D177，PETase的活性口袋比其他角質(zhì)酶的更寬，所以PET可以輕易進(jìn)入PETase的活性位點(diǎn)，科研人員還對(duì)底物結(jié)合和催化機(jī)制進(jìn)行了研究［57-59］。郭瑞庭等通過(guò)對(duì)PETase晶體結(jié)構(gòu)與底物和產(chǎn)物類(lèi)似物復(fù)合體的結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)PETase中W156在同源酶對(duì)應(yīng)位點(diǎn)是高度保守的，而PETase的W156可以展現(xiàn)出多個(gè)擺動(dòng)構(gòu)象，185位點(diǎn)的殘基會(huì)影響W156自身的靈活性，進(jìn)而影響底物結(jié)合模式［60］；此外還分析了PETase與底物和產(chǎn)物類(lèi)似物的結(jié)合，推動(dòng)了對(duì)PETase反應(yīng)機(jī)理的理解，PET主要通過(guò)疏水相互作用與口袋結(jié)合，PET的羰基位于催化中心，其中O原子面向氧陰離子孔，W156處于B構(gòu)象（S185）時(shí)可為PET的TPA部分提供T堆積力，通過(guò)發(fā)生經(jīng)典水解反應(yīng)，連續(xù)形成?；钢虚g體，水分子進(jìn)行第2次親核攻擊以裂解酯鍵，其余苯甲酸基與W156發(fā)生較強(qiáng)的π堆疊作用，底物被分解并最終從活性中心釋放出來(lái)。Perz等［61］從肉毒梭菌（Clostridium botulinumATCC3502）克隆了兩個(gè)編碼酯酶（Cbotu_EstA、Cbotu_EstB）的基因，而且還得到了酶Cbotu_EstA的晶體結(jié)構(gòu)。晶體結(jié)構(gòu)的解析在同源性的追溯方面也意義重大，T.albaAHK119來(lái)源的Est119角質(zhì)酶晶體結(jié)構(gòu)被解析，科研人員將Est119序列與水解角質(zhì)的酯酶進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)芳香聚酯酶屬于角質(zhì)酶家族［62］。Est119還與鏈霉菌（Streptomyces exfoliates）來(lái)源的脂肪酶結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)分析，通過(guò)結(jié)構(gòu)比對(duì)發(fā)現(xiàn)Est119是一種α/β水解酶，9條β鏈被8條α螺旋包圍，并發(fā)現(xiàn)該酶是一種沒(méi)有蓋子的角質(zhì)酶。通過(guò)對(duì)晶體結(jié)構(gòu)分析，還可以得到輔因子對(duì)活性及其空間構(gòu)象的影響；S.viridisAHK190來(lái)源的角質(zhì)酶突變體Cut190-S176A與Ca2+結(jié)合后得到非活性形式的晶體結(jié)構(gòu)，分析Cut190的底物識(shí)別機(jī)制，并且通過(guò)突變分析了Ca2+的作用；Ca2+在第1位點(diǎn)（Ser76、Ala78、Phe81和Asn133）的結(jié)合是Cut190獨(dú)有的，這直接關(guān)系到酶的激活與否，但第2位點(diǎn)（Glu220、Asp250和Glu296）的結(jié)合在Est119和其他角質(zhì)酶中很常見(jiàn)，影響著酶的熱穩(wěn)定性［63-64］。Bollinger等發(fā)現(xiàn)并解析了能降解PET的聚酯水解酶（PE-H），該酶為α/β水解酶折疊類(lèi)型，中間由9條β鏈組成，兩側(cè)有7個(gè)α螺旋，PE-H中有兩個(gè)二硫鍵，連接C214-C251和C258-C302，該結(jié)構(gòu)在Ⅱ型PET降解酶中較為常見(jiàn)，高度保守的殘基S171、D217、H249構(gòu)成了PE-H的催化三聯(lián)體［65］。

2.4 塑料降解微生物的鑒定

Yoshida等［56］從 環(huán) 境 中 的PET上 篩 選 出I.sakaiensis201-F6，該菌可以把PET作為碳源和能源物質(zhì)，生成無(wú)害的TPA和乙二醇（EG）。Fusarium oxysporum和F.solani是可以生長(zhǎng)在含有PET的培養(yǎng)基中的絲狀真菌，但是研究者并沒(méi)有對(duì)其生長(zhǎng)水平進(jìn)行檢測(cè)［66-67］。De Castro團(tuán)隊(duì)［68］對(duì)環(huán)境中降解PET的微生物篩選時(shí)，發(fā)現(xiàn)H.insolens具有很好降解PET的潛能，并且與南極假絲酵母協(xié)同作用比單獨(dú)使用轉(zhuǎn)化效率高2.2倍。Streptomyces scabies中的基因sub1編碼的蛋白可降解PET生成TPA，在添加Triton后其活性明顯增強(qiáng)，且37℃下至少穩(wěn)定20 d［69］。Farzi等［70］評(píng)估了鏈霉菌屬對(duì)PET的降解和動(dòng)力學(xué)表征，利用GC-MS分析了生物降解過(guò)程（圖3）。在海洋微生物Pseudomonas aestusnigriVGXO14T基因組中鑒定出的新型羧酸酯水解酶有聚酯降解能力，可在30℃下對(duì)無(wú)定形PET降解［65］。Beaulieu等［71］篩選的S.scabies具有顯著的穩(wěn)定性和降解PET的能力。此外，P.citrinum、T.reesei以及B.cepacia被鑒定出也具有降解PET的能力［72-74］（表2）。

表2 PET降解微生物研究進(jìn)展Tab.2 Research progress of microorganisms in PET degradation

圖3 微生物降解PET過(guò)程Fig.3 Process of microbial PET degradation

3 雙向改造

塑料工業(yè)應(yīng)用的目的是讓降解最大化、污染最小化，雙向改造基于工業(yè)應(yīng)用的思想，對(duì)可塑性降解酶和可降解塑料進(jìn)行同步改造，以期獲得高效產(chǎn)品。在雙向改造過(guò)程中，不僅可以從酶制劑自身出發(fā)對(duì)自身進(jìn)行改造和設(shè)計(jì)，還可以在保證塑料產(chǎn)品適用性的前提下，對(duì)其原材料進(jìn)行綠色設(shè)計(jì)，從而達(dá)到工業(yè)應(yīng)用的要求。

3.1 PET降解酶的改造升級(jí)

塑料降解酶因穩(wěn)定性差、催化效率低等原因限制了其規(guī)?；a(chǎn)與應(yīng)用［75-77］，通過(guò)利用包括人工智能、同源模擬、液滴微流控在內(nèi)的現(xiàn)代生物技術(shù)、半理性設(shè)計(jì)、隨機(jī)突變等來(lái)克服PET降解酶現(xiàn)存的這些弊端，也可應(yīng)用多酶共固定化、級(jí)聯(lián)反應(yīng)技術(shù)來(lái)提高產(chǎn)率，使其應(yīng)用于規(guī)?；a(chǎn)。

3.1.1 PET降解酶的傳統(tǒng)改良方法

利用基因隨機(jī)突變和重組方法對(duì)酶進(jìn)行定向進(jìn)化，然后與酶理性修飾方法相結(jié)合，通過(guò)各種組合選擇出適合的方法來(lái)避免定向進(jìn)化和理性設(shè)計(jì)的限制，液滴微流控的技術(shù)手段極大提高了隨機(jī)突變篩選效率；全細(xì)胞催化、金屬離子的存在、共固定化以及多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)［78］等方面在提高PET降解酶活性也有積極作用。

杜文斌等開(kāi)發(fā)了一種熒光液滴分選（FADS）管道，可用于對(duì)PET降解微生物或酶的高通量篩選，也可廣泛用于發(fā)現(xiàn)新的PET降解微生物和各種環(huán)境中的酶以及定向進(jìn)化［79］。通過(guò)利用定點(diǎn)誘變對(duì)嗜熱細(xì)菌T.fusca來(lái)源的角質(zhì)酶基因進(jìn)行基因修飾，獲得的雙重突變體G132A/T101A改善了酶的疏水性和底物結(jié)合位點(diǎn)，使得突變體催化PET的活性大大提高［80］。對(duì)Fusarium solanipisi來(lái)源的角質(zhì)酶（FsC）進(jìn)行基因改造時(shí)，利用丙氨酸替代活性中心位點(diǎn)附近的氨基酸殘基，擴(kuò)大了底物結(jié)合口袋，突變體FsC-L81A對(duì)PET的水解活性提高了5倍［81］。王澤方等把PETase導(dǎo)入到畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)，再分泌到細(xì)胞表面進(jìn)行全細(xì)胞催化，發(fā)現(xiàn)PETase的催化效率是游離酶的36倍，且pH和熱穩(wěn)定性都有顯著提高［82］。Carniel等［83］發(fā)現(xiàn)南極假絲酵母脂肪酶（CALB）和角質(zhì)酶（HiC）共同存在情況下會(huì)促進(jìn)PET水解，雙酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)會(huì)加速PET的水解生成TPA。

金屬離子的添加會(huì)影響酶的熱穩(wěn)定性，盡管在α-淀粉酶中已經(jīng)探索了Ca2+誘導(dǎo)酶的熱穩(wěn)定性和活性，但對(duì)降解PET角質(zhì)酶的機(jī)制仍然知之甚少。Miyakawa等［84］首次發(fā)現(xiàn)了降解PET角質(zhì)酶中Ca2+對(duì)于酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和活性的影響，并對(duì)S.viridisAHK190來(lái)源的角質(zhì)酶突變體Cut190-S226P進(jìn)行研究，研究了Ca2+結(jié)合以及自由態(tài)下的突變體結(jié)構(gòu)，并發(fā)現(xiàn)了該突變體較好的熱穩(wěn)定性。Sulaiman等［48］也發(fā)現(xiàn)了在添加了Ca2+和Mg2+后，這些角質(zhì)酶的活性和熱穩(wěn)定性增加。向聚酯水解酶TfH、BTA2、Tfu_0882、Tf_Cut1和Tf_Cut2添 加Ca2+、Mg2+時(shí)，這些聚酯水解酶的熔點(diǎn)溫度提高了10.8～14.1℃［85］。在Clostridium botulinum來(lái) 源 的 酯 酶（Cbotu_EstA）中發(fā)現(xiàn)了與Zn2+結(jié)合相關(guān)的結(jié)構(gòu)域，并發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)域附近的殘基突變不會(huì)改變鋅的結(jié)合能力，如突變體Cbotu_EstA-S199A不僅沒(méi)有改變鋅的結(jié)合能力，反而催化活性提高了7倍［86］。科研人員分析了不同的二價(jià)陽(yáng)離子（Zn2+、Mn2+和Mg2+）對(duì)聚酯水解酶Cut190與Ca2+相比的活性和熱穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)Zn2+可以很容易地取代Ca2+，但Cut190在Zn2+存在下的酶活性非常低［87］。除金屬離子外，磷酸根離子也可以提高PET降解酶的熱穩(wěn)定性［40］。

3.1.2基于PET降解酶結(jié)構(gòu)的改造

在所有對(duì)酶修飾的措施中，從酶結(jié)構(gòu)解析基礎(chǔ)上進(jìn)行改造以提高其活性的研究較為普遍；Austin等［88］將PETase的結(jié)構(gòu)與T.fusca來(lái)源的角質(zhì)酶結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)PETase結(jié)合位點(diǎn)附近存在多個(gè)裂隙，會(huì)影響底物與酶的結(jié)合，將PETase兩個(gè)活性位點(diǎn)殘基突變?yōu)榻琴|(zhì)酶中保守的結(jié)合裂縫氨基酸殘基，縮小了PETase結(jié)合位點(diǎn)的裂隙大小，從而改善了PET的降解［圖4（a）］。Son等［89］基于結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)對(duì)I.sakaiensis來(lái)源的IsPETase進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造，通過(guò)使用分子對(duì)接把IsPETase與4種PETase進(jìn)行比對(duì)，獲得使Loop環(huán)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定的三重突變體S121E/D186H/R280A，該酶的熔點(diǎn)溫度提高了8.81℃，PET降解活性在40℃下提高了14倍；他們繼續(xù)對(duì)IsPETase結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，獲得四重突變體S121E/D186H/S242T/N246D，該突變體較野生型相比底物結(jié)合位點(diǎn)得到了優(yōu)化，在37℃下，突變體的活性比野生型提高58倍［90］。Maurer等［91］從T.cellulosilytica來(lái)源的角質(zhì)酶（Thc_Cut1）結(jié)構(gòu)出發(fā)進(jìn)行改造，拓展了Thc_Cut1的底物譜，使得該酶可以解聚人工尼龍和聚酰胺。

圖4 PET降解酶基于結(jié)構(gòu)的改造Fig.4 Structure-based modification of PET degrading enzyme

通過(guò)對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造是提高酶熱穩(wěn)定性的一種方法。Nakamura等［92］利用同源模擬工具對(duì)PET降解酶PET2的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)，最終發(fā)現(xiàn)對(duì)表面電荷進(jìn)行修飾突變成帶正電荷的氨基酸、添加二硫鍵以及提高骨架穩(wěn)定性，可以使PET2 7M（7重突變體）的熔點(diǎn)溫度從69℃提高到75.7℃［圖4（b）］。Marty等使用分子對(duì)接和酶表面分析來(lái)研究底物結(jié)合模式，最后發(fā)現(xiàn)把二硫鍵加入LCC中去取締金屬離子結(jié)合位點(diǎn)附近的氨基酸殘基，使得LCC的熔點(diǎn)溫度提高了9.8℃［93］。將二硫鍵引入到聚酯水解酶Tf_Cut2催化位點(diǎn)附近，Tf_Cut2的熔點(diǎn)溫度提高了25℃，半失活溫度提高了17℃，并且在70℃處理48 h，該酶的催化效率較原來(lái)提高了1倍［94］。在PET降解酶中引入疏水蛋白來(lái)改變酶的結(jié)構(gòu)以及酶與底物的結(jié)合能力已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于這類(lèi)研究中。Ribitsch等［95］把水解PET的角質(zhì)酶與疏水蛋白融合來(lái)改變活性中心的構(gòu)象，疏水蛋白是一種可以改變表面物理化學(xué)性質(zhì)的小真菌蛋白，可以顯著提高角質(zhì)酶對(duì)PET的水解水平，說(shuō)明偶聯(lián)疏水蛋白或者兩性分子可以提高酶分子疏水性。孫巖等對(duì)PETase進(jìn)行了廣泛的分子模擬來(lái)分析酶的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化和酶與底物的相互作用，把活性位點(diǎn)附近的殘基突變成谷氨酸和賴(lài)氨酸，會(huì)改變酶的表面電荷分配，使得其活性位點(diǎn)附近的疏水性增大，從而提高了底物與酶的結(jié)合效率［96］。劉兵等［97］將PETase的結(jié)構(gòu)與F.solani來(lái)源的角質(zhì)酶進(jìn)行催化三聯(lián)體位點(diǎn)結(jié)構(gòu)的比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)BHET對(duì)PETase的催化三聯(lián)體存在明顯競(jìng)爭(zhēng)，利用PETase與BHET的分子對(duì)接證實(shí)了以上觀點(diǎn)，提供了PETase改造的理論研究基礎(chǔ)。Ren等［98］通過(guò)利用分子模擬工具比對(duì)T.fuscaKW3來(lái)源的Tf_Cut2和LCC結(jié)構(gòu)，把第62位的氨基酸換成LCC對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基，發(fā)現(xiàn)Tf_Cut2-G62A與對(duì)苯二甲酸單酯（MHET）結(jié)合效率大大降低，水解PET的活性提高了2.7倍；因?yàn)镻ET降解酶除了會(huì)與PET結(jié)合外，該類(lèi)酶的水解產(chǎn)物BHET和MHET也會(huì)與PET競(jìng)爭(zhēng)酶的活性中心，從而抑制PET降解。郭瑞庭團(tuán)隊(duì)［60］解析了一種來(lái)自PET消耗型微生物I.sakaiensis的新型PETase以及與底物和產(chǎn)物類(lèi)似物復(fù)合體的結(jié)構(gòu)。通過(guò)結(jié)構(gòu)分析，誘變和活性測(cè)量，提出了底物結(jié)合模式，并闡明了對(duì)催化至關(guān)重要的特征，為PETase在塑料生物轉(zhuǎn)化中的進(jìn)一步工程設(shè)計(jì)和應(yīng)用提供指導(dǎo)。

3.1.3 PET降解酶的人工智能設(shè)計(jì)

近年來(lái)，大數(shù)據(jù)時(shí)代人工智能的發(fā)展，很大程度上減少了實(shí)驗(yàn)重復(fù)操作的工作量，并且比傳統(tǒng)的方法更加高效、準(zhǔn)確；計(jì)算機(jī)穩(wěn)定性設(shè)計(jì)方法在過(guò)去的20年里從選擇性地解決邊際穩(wěn)定性的某些方面的方法開(kāi)始，發(fā)展到現(xiàn)在更加全面，人工智能設(shè)計(jì)通過(guò)將系統(tǒng)發(fā)育分析與原子設(shè)計(jì)相結(jié)合，在保持蛋白質(zhì)主要分子活性的同時(shí)，溶解性、熱穩(wěn)定性和抗聚集性也有了顯著改善［99］。

盡管在氨基酸序列的從頭設(shè)計(jì)方面取得了重大突破，但當(dāng)前的計(jì)算機(jī)蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)仍存在明顯的局限性，為了克服這些短板，需要計(jì)算模型來(lái)補(bǔ)充當(dāng)前的模型和實(shí)驗(yàn)工具來(lái)為理論提供廣泛的反饋。劉海燕等開(kāi)發(fā)了一種用于蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)能量函數(shù)模型，補(bǔ)充和完善了已有模型的缺點(diǎn)［100］。Guerois等［101］開(kāi)發(fā)了一種計(jì)算機(jī)算法——FOLDEF，可以快速定量估計(jì)蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物穩(wěn)定性的相互作用，該能量函數(shù)使用最少的計(jì)算資源，因此可以很容易地用于蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)算法以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和折疊途徑預(yù)測(cè)領(lǐng)域。Meng等開(kāi)發(fā)了一種新的突變?cè)O(shè)計(jì)工具——Premuse，用來(lái)整合基于自然序列進(jìn)化的首選突變序列比對(duì)和定量選擇，使用Premue對(duì)I.sakaiensis201-F6來(lái)源的IsPETase進(jìn)行計(jì)算，最后從1486個(gè)同源序列中篩選出雙點(diǎn)突變體W159H/F229Y，在40℃下，PET的降解活性增加了近40倍［102］。崔穎璐等［103］設(shè)計(jì)了一個(gè)蛋白質(zhì)工程的貪婪累積策略——GRAPE，利用聚類(lèi)算法和貪婪算法優(yōu)點(diǎn)，大幅規(guī)避了不同突變位點(diǎn)間的負(fù)協(xié)同作用，短時(shí)間內(nèi)最大限度地探索序列空間疊加路徑，提高了來(lái)自I.sakaiensis的PETase的熱穩(wěn)定性，通過(guò)聚類(lèi)分析結(jié)合計(jì)算得出有益突變的貪婪積累，重新設(shè)計(jì)出一種變體DuraPETase，該突變體的表觀熔融溫度較野生型提高31℃，可以在溫和條件下將2 g/L微塑料完全生物降解為水溶性產(chǎn)物。Marty團(tuán)隊(duì)利用計(jì)算機(jī)輔助酶工程技術(shù)，對(duì)PET水解酶LCC重新設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了在不到10 h的時(shí)間內(nèi)將酶催化的PET解聚，提高了90%的轉(zhuǎn)化率［93］。Knott等［104］從對(duì)苯二甲酸單酯水解酶（MHETase）的結(jié)構(gòu)、生化和生物信息學(xué)的方法出發(fā)，利用計(jì)算機(jī)分析MHETase與PETase的協(xié)同作用，研究了該酶體系對(duì)PET的催化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)雙酶體系下的水解效率比只有PETase存在情況下提高了3倍，這給雙酶PET降解系統(tǒng)提高了研究方向?？蒲腥藛T通過(guò)動(dòng)力學(xué)模擬和分子分層計(jì)算方法（ONIOM）分析了MHETase的催化機(jī)制，利用高理論水平和廣泛抽樣的結(jié)合生成了穩(wěn)健的計(jì)算預(yù)測(cè)，這些信息可以更詳細(xì)了解MHETase催化功能以及開(kāi)發(fā)更高活性的突變體［105］。

智能計(jì)算已經(jīng)發(fā)展到以原子級(jí)精度進(jìn)行從頭設(shè)計(jì)各種結(jié)構(gòu)的地步，迄今為止，幾乎所有的蛋白質(zhì)工程都涉及對(duì)天然蛋白質(zhì)的修飾［106］（圖5）。一系列的計(jì)算設(shè)計(jì)模型在實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)出極大利好，在蛋白質(zhì)改造領(lǐng)域擁有廣闊前景。

圖5 智能計(jì)算策略Fig.5 Schematic diagram of smart-computing strategy

3.2 PET原材料的綠色設(shè)計(jì)

塑料制品因耐用而被廣泛使用，但自身降解也變成極大的挑戰(zhàn)，絕大多數(shù)塑料即使被降解后也逃離不了被填埋的命運(yùn)，號(hào)稱(chēng)可“生物降解”塑料最后也和普通塑料一樣降解不徹底，最后也被填埋進(jìn)入生態(tài)環(huán)境，給人類(lèi)健康帶來(lái)隱患。Xu等為了制造出真正可降解、不留隱患的塑料，所以直接將能降解塑料的聚酯酶作為原料，添加到塑料生產(chǎn)的過(guò)程中，將數(shù)十億個(gè)被包裹起來(lái)的酶與塑料樹(shù)脂珠進(jìn)行混合，用于塑料生產(chǎn)，只要加上水和熱量，這些酶就會(huì)發(fā)揮功效降解塑料，說(shuō)明通過(guò)使用具有活性位點(diǎn)暴露在表面的酶來(lái)設(shè)計(jì)酶-保護(hù)劑-聚合物的復(fù)合物是可行的［107］。利用這一技術(shù)所生產(chǎn)出的新型塑料，98%可降解成小分子，且不會(huì)產(chǎn)生微塑料等對(duì)環(huán)境有害的物質(zhì)。通過(guò)把合成PET的石油基原材料TPA、EG等轉(zhuǎn)變成生物質(zhì)來(lái)源的原料，最后合成生物PET（Bio-PET），不僅減少了對(duì)原始PET的依賴(lài)，也提高了Bio-PET降解率。目前已知的途徑都不能利用中間體直接生產(chǎn)TPA，但是有科學(xué)家提出莽草酸途徑可用于生產(chǎn)對(duì)甲苯甲酸，隨后將其轉(zhuǎn)化為T(mén)PA［108］。更加可持續(xù)、環(huán)保的原材料木質(zhì)素可以作為原料，利用生物乙醇途徑生產(chǎn)Bio-PET的原材料［109］。Lee等［110］還發(fā)現(xiàn)利用對(duì)二甲苯可實(shí)現(xiàn)TPA的生物合成。EG占Bio-PET聚合物重量的30%，很多科學(xué)家利用微生物從可再生植物原料中獲得了EG［111］；和TPA一樣，EG也能利用生物質(zhì)直接獲得，可以通過(guò)纖維素脫水、木糖醇?xì)浣夂蛷U棄秸稈加氫而形成［112］?？蒲腥藛T利用塑料薄膜A（30%淀粉、70%塑料和添加劑）和塑料薄膜B（95%以上塑料、少量添加劑）作為底物研究黃粉蟲(chóng)（yellow meal worms）對(duì)改良塑料的降解，發(fā)現(xiàn)A類(lèi)塑料在25 d內(nèi)被完全降解［113］；Ganesan等應(yīng)用酶嵌入聚合物的表面澆注方法，把南極念珠菌脂肪酶包埋在塑料薄膜中，嵌入了2%～8%重量脂肪酶的聚己內(nèi)酯（PCL）塑料薄膜，隨著脂肪酶含量和孵育天數(shù)的增加，塑料薄膜的失重增加［114］。通過(guò)將薄膜分割成更小的碎片，加速嵌入酶降解的速度，這可作為微塑料生物降解的模型實(shí)驗(yàn)，具有特定嵌入酶和包埋法生產(chǎn)的各種可生物降解塑料將有助于解決全球環(huán)境問(wèn)題，這些方法也可以為PET的綠色設(shè)計(jì)所借鑒。

4 前景與展望

近年來(lái)，科研人員發(fā)現(xiàn)了許多可降解PET的酶和微生物，在PET的酶法降解與催化機(jī)制方面取得了重大進(jìn)展［115-117］，合成生物學(xué)和蛋白質(zhì)工程的快速發(fā)展為發(fā)現(xiàn)、表征和修飾PET降解酶提供了一系列強(qiáng)大的工具，包括Toulouse White Biotechnology（TWB）在內(nèi)的多家公司已經(jīng)具備完整的PET降解工業(yè)鏈。盡管降解技術(shù)和資源發(fā)展迅猛，但聚酯水解酶對(duì)PET的有效水解仍然為生物催化PET廢物回收技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展提出了許多挑戰(zhàn)，現(xiàn)存許多問(wèn)題還有待突破：PET水解酶只能水解非晶體部分，而對(duì)于晶體部分的水解效率極低，所以還無(wú)法降解高結(jié)晶度的產(chǎn)品；從PET塑料到高附加值產(chǎn)品高效轉(zhuǎn)化的代謝路徑還有待構(gòu)建，另外還有一系列問(wèn)題需進(jìn)一步解決。

（1）開(kāi)發(fā)新型PET聚酯水解酶篩選方法：目前基于瓊脂平板的篩選方法靈敏度和通量相對(duì)較低，所以需要開(kāi)發(fā)高效的高通量篩選方法來(lái)更高效和準(zhǔn)確地識(shí)別新的塑料降解酶，如液滴微流控的分選手段極大推動(dòng)了新酶挖掘和突變體的篩選，這一技術(shù)手段的更新將有望從源頭上解決高晶體產(chǎn)品的降解工作；人工智能在挖掘微生物和酶方面也有很大潛能，以Python爬蟲(chóng)為代表，目前，該應(yīng)用主要集中在公眾熱點(diǎn)問(wèn)題的分析中，但這一技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)使得Python網(wǎng)絡(luò)爬蟲(chóng)在文獻(xiàn)分析中顯現(xiàn)出巨大優(yōu)勢(shì)。這一技術(shù)手段無(wú)疑將為塑料降解微生物及新酶基因篩選與挖掘提供重要的參考價(jià)值。

（2）PET聚酯水解酶結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系解析：因?yàn)閷?duì)塑料降解酶的結(jié)構(gòu)與功能的理解相對(duì)缺乏，所以現(xiàn)在的很多合理的設(shè)計(jì)方法都是經(jīng)驗(yàn)性的，精確預(yù)測(cè)突變位點(diǎn)還很困難，計(jì)算機(jī)輔助模擬和人工智能的發(fā)展可能會(huì)對(duì)酶結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的認(rèn)識(shí)不斷增加，有望以更具預(yù)測(cè)性和精確性的方式指導(dǎo)PET聚酯水解酶的改造工作。

（3）多酶催化/全細(xì)胞催化體系構(gòu)建：PET在被降解過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生BHET和MHET等中間產(chǎn)物，會(huì)與PET競(jìng)爭(zhēng)酶的底物結(jié)合位點(diǎn)，影響酶的降解效率，發(fā)展多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)和共固定化技術(shù)不僅可以做到高效降解，還可以在酶的循環(huán)利用方面取得重大突破；全細(xì)胞體系的構(gòu)建可以很大程度上提高降解酶的pH和穩(wěn)定性，尋找合適的宿主微生物在應(yīng)對(duì)工業(yè)塑料降解環(huán)境中發(fā)揮高效降解將有很大前景。

（4）構(gòu)建高附加值產(chǎn)品轉(zhuǎn)化代謝路徑：因?yàn)樗芰辖Y(jié)構(gòu)復(fù)雜和解聚條件差異性等原因?qū)е陆饩郛a(chǎn)物眾多從而產(chǎn)生二次污染，現(xiàn)有技術(shù)還不能做到PET綠色回收，建立高附加值產(chǎn)品轉(zhuǎn)化代謝路徑不僅可以做到保護(hù)生態(tài)環(huán)境，而且能帶動(dòng)經(jīng)濟(jì)循環(huán)發(fā)展，通過(guò)定向挖掘可以利用解聚產(chǎn)物的微生物，如何應(yīng)用合成生物學(xué)構(gòu)建合適的代謝路徑，將有望做到真正的零污染、高回收。

（5）可降解塑料的研發(fā)創(chuàng)新：現(xiàn)行塑料降解條件苛刻、降解過(guò)程復(fù)雜等諸多因素影響降解效果，尤其是對(duì)于高結(jié)晶度的產(chǎn)品，在不改變實(shí)用性的前提下，尋找合適的方式向塑料中添加碳源等添加劑、基于仿生思想設(shè)計(jì)新型可降解塑料在此后的塑料降解研究中也可作為一個(gè)探索方向。

（6）其他方面的創(chuàng)新突破：目前PET降解酶可在大腸桿菌、畢赤酵母等宿主中進(jìn)行可溶性表達(dá)，但是PETase等水解酶異源表達(dá)水平還較低，利用現(xiàn)代生物技術(shù)克服異源表達(dá)中蛋白質(zhì)之間的相互作用有望突破這一瓶頸；利用傳統(tǒng)的物理化學(xué)誘變手段來(lái)篩選具有特殊功能的塑料降解菌也是一個(gè)研究方向；此外，可以開(kāi)發(fā)對(duì)PET的預(yù)處理方式來(lái)改善提高降解效率。