張璨，施李楊，戴建武

（1晨熙新創(chuàng)生物科技（鎮(zhèn)江）有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212000；2湖南大學生物學院，湖南 長沙 410000；3中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所，北京 100101）

1 細胞培養(yǎng)肉

“人造肉”指借助生物技術(shù)手段在體外合成的非自然產(chǎn)生的肉類。目前根據(jù)制造原料的不同，可將“人造肉”分成“素肉”和“真肉”，即由大豆等植物蛋白加工而成的植物蛋白肉和通過培養(yǎng)動物細胞后制造出的細胞培養(yǎng)肉（cultured meat）［1］。植物蛋白肉發(fā)展較早，且由于植物蛋白來源廣泛、加工工藝相對成熟，已經(jīng)實現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)。但與傳統(tǒng)肉制品相比其在外觀、風味、口感與營養(yǎng)等方面仍然存在較大差距。相比之下，細胞培養(yǎng)肉從外觀、成分到口感都和真正的肉有很多相似之處。其源于動物細胞，含有多種植物蛋白所沒有的必需氨基酸，且經(jīng)過人工定向誘導，還可以精準控制營養(yǎng)成分，制造低脂、高蛋白、低膽固醇和高鈣肉制品，以滿足不同人群的健康需求，因此亦是未來發(fā)展的主要方向。細胞培養(yǎng)肉的研究工作始于21世紀初，當時美國國家航空航天局（NASA）資助了一項以食用為目的的細胞培養(yǎng)肉研究，以解決未來太空飛行和空間站肉類的可持續(xù)供應問題［2］。

目前，大眾可能對細胞培養(yǎng)肉存在很多困惑，一方面人們對新鮮事物保持謹慎懷疑態(tài)度，另一方面現(xiàn)有傳統(tǒng)動物肉口感好且成本低，為什么要開發(fā)細胞培養(yǎng)肉呢？據(jù)統(tǒng)計，畜牧業(yè)和肉類加工業(yè)是溫室氣體排放的主要來源，其中二氧化碳、甲烷和一氧化二氮的排放量分別占總排放量的9%、39%和65%，排放量甚至超過了交通運輸業(yè)［3］。而且依賴畜牧業(yè)的傳統(tǒng)肉類生產(chǎn)會消耗大量土地、糧食作物、水和能源等自然資源［4］?，F(xiàn)階段傳統(tǒng)肉類產(chǎn)能已接近極值，然而據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）預測，隨著全球人口數(shù)量持續(xù)增加，到2050年全球肉類需求和消費量將增長70%［5］，我國肉制品的供給缺口到2030年預計將達到3804萬噸。肉類過度消耗還將造成動物福利缺失［6］。與此同時，伴隨中產(chǎn)階級的崛起和城市化水平提高，消費者開始追尋更健康的蛋白質(zhì)食品。傳統(tǒng)養(yǎng)殖業(yè)的肉類存在一定食品安全問題，例如沙門氏桿菌、大腸桿菌等細菌的污染以及禽流感、非洲豬瘟、瘋牛病等動物疫病的感染［7］。因此，家禽養(yǎng)殖常涉及激素和抗生素等藥物的使用，使人們可能遭受耐藥菌的威脅，存在健康隱患。心血管疾病、糖尿病和結(jié)直腸癌也與過度食用紅肉和加工肉類有關(guān)［8-9］?；诖爽F(xiàn)狀，開發(fā)細胞培養(yǎng)肉可以有效降低傳統(tǒng)畜牧業(yè)生產(chǎn)對環(huán)境的負面影響，緩解肉類消費的供求矛盾，減少人類對傳統(tǒng)肉類的依賴，避免因肉制品攝入過多導致的潛在營養(yǎng)健康危害［10-11］。

基于細胞培養(yǎng)肉各方面的優(yōu)勢，使其未來擁有巨大的市場前景。根據(jù)美國市場調(diào)查咨詢公司MarketsAndMarkets的調(diào)查報告，培養(yǎng)肉將以每年15.7%的復合年增長率增長，預計從2023年的64億美元增長到2028年的100億美元。然而，現(xiàn)階段制造細胞培養(yǎng)肉的條件要求極為嚴苛，造成研制成本高昂，故大部仍停留在實驗室階段。2013年荷蘭馬斯特里赫特大學的Mark Post研發(fā)了全球第一個人造牛肉漢堡，并在英國倫敦進行試吃，引起大眾的廣泛關(guān)注。漢堡中的牛肉是研發(fā)人員經(jīng)過3個月時間從牛肌肉中提取干細胞后培育得到的約5盎司肉餅，其成本造價超過32萬美元（約200萬人民幣）［12］。隨后經(jīng)過2年的技術(shù)發(fā)展，人造漢堡肉餅成本已經(jīng)由最初的32萬美元降低到了11美元左右［13］。盡管現(xiàn)階段細胞培養(yǎng)肉造價仍高于傳統(tǒng)肉類，但得益于生物技術(shù)的快速發(fā)展，其生產(chǎn)成本仍有大幅降低的空間，倘若將來能提高性價比實現(xiàn)批量生產(chǎn)，提供口感逼真、營養(yǎng)豐富、衛(wèi)生安全的科技培養(yǎng)肉，必將掀起一場食物革命，使其成為人們生活中的常態(tài)綠色食品［14］。近年隨著組織工程技術(shù)、先進制造技術(shù)和大數(shù)據(jù)分析等技術(shù)的發(fā)展，也為培養(yǎng)肉行業(yè)發(fā)展帶來新的契機。尤其在中國市場，受國內(nèi)豬肉產(chǎn)能不足等因素影響，2020年肉類進口量為991萬噸［15］，因此我國細胞培養(yǎng)肉市場的發(fā)展空間巨大，發(fā)展細胞培養(yǎng)肉也對優(yōu)化我國農(nóng)業(yè)的綜合利用率、促進肉類產(chǎn)品多元化、提升國人身體素質(zhì)具有重要意義。

自2013年全球第一個人造牛肉漢堡公開試吃后，國內(nèi)外已涌現(xiàn)出一批致力于細胞培養(yǎng)肉研發(fā)的公司，并取得了一系列突破性進展。如2019年3月，日本著名食品企業(yè)日清食品控股公司與東京大學合作，通過培養(yǎng)牛肌肉干細胞成功生產(chǎn)出約1 cm3的肌肉組織［16］。2019年11月，南京農(nóng)業(yè)大學周光宏教授團隊［17］通過培養(yǎng)豬肌肉干細胞20 d后，獲得了中國第一塊細胞培養(yǎng)肉。2021年8月，日本大阪大學研究團隊［18］結(jié)合細胞培養(yǎng)和3D打印技術(shù)構(gòu)建3種牛細胞纖維，成功制作出直徑5 mm、長度10 mm的牛排。2020年，美國初創(chuàng)企業(yè)Eat Just公司的細胞培養(yǎng)雞肉產(chǎn)品在新加坡獲批上市，且該產(chǎn)品已在約1880家餐廳中使用，極大促進了細胞培養(yǎng)肉市場的發(fā)展。2021年6月，以色列食品公司Future Meat建立了世界上第一個工業(yè)細胞培養(yǎng)肉設施，并且開始商業(yè)化生產(chǎn)細胞培養(yǎng)肉［19］?，F(xiàn)階段，我國關(guān)于細胞培養(yǎng)肉的專利相對較少，但近年越來越多的公司和研究者加入細胞培養(yǎng)肉開發(fā)的行列。

2 細胞培養(yǎng)肉生產(chǎn)流程

根據(jù)肌肉細胞的發(fā)育生物學過程，通過細胞系或從動物身上提取原代干細胞，擴增后結(jié)合生物材料分化成肌肉細胞，然后融合形成肌管并進一步形成肌肉纖維就可以制造出培養(yǎng)肉。因此常規(guī)細胞培養(yǎng)肉的生產(chǎn)流程包括種子細胞分離、細胞大規(guī)模培養(yǎng)和細胞成肌分化幾個階段（圖1）［20］。

圖1 細胞培養(yǎng)肉生產(chǎn)流程Fig.1 Production flow chart of cultured meat.

2.1 種子細胞的分離

細胞培養(yǎng)肉生產(chǎn)的首要任務是選擇并分離合適的種子細胞。理想的細胞培養(yǎng)肉種子細胞應該具備以下條件：易于獲取，能在體外持續(xù)增殖，并有較高的肌肉分化效率。目前常用的種子細胞主要包括細胞系或原代細胞。細胞系一般指可連續(xù)傳代的細胞，常通過基因工程或化學方法誘導細胞基因突變，使其具有無限增殖能力［21］。雖然基因改造可以提高細胞增殖能力，減少對組織樣本的依賴。但細胞系遺傳和表型的不穩(wěn)定性等問題還需解決，并且在食品領(lǐng)域基因修飾細胞的使用也存在較大爭議，在歐盟國家更是完全被禁止［22］。原代細胞通常是干細胞，包括胚胎干細胞、誘導多能干細胞和肌肉干細胞（也稱肌衛(wèi)星細胞）等，其中從肌肉組織中提取的肌衛(wèi)星細胞應用最多。

肌衛(wèi)星細胞位于肌纖維膜和基底膜之間，由于位置特殊，使得其很難從肌肉組織中分離出來，容易摻雜其他細胞，如成纖維細胞、內(nèi)皮細胞和血細胞等。與醫(yī)學研究中對細胞的純度、代數(shù)等要求嚴苛不同，細胞培養(yǎng)肉作為一種食品而非醫(yī)療產(chǎn)品，其對細胞的純度要求不像生物醫(yī)學應用所需的那么高。目前常用的肌衛(wèi)星細胞原代分離方法主要有3種：酶消化法、組織塊法和單根肌纖維分離法。酶消化法，通常借助單一或混合的膠原酶、中性蛋白酶和蛋白酶K等消化酶對剪碎的肌肉組織進行消化，去除細胞外基質(zhì)獲得肌衛(wèi)星細胞［23］。為了提高組織消化效率，酶消化法常需用多種酶混合作用，容易造成對細胞的損傷［24］。組織塊法，通常是把肌肉剪成約1 mm3大小的組織塊后將其貼附于培養(yǎng)皿底部，加入少量培養(yǎng)基后置于細胞培養(yǎng)箱中，幾天后肌衛(wèi)星細胞便會從組織塊邊緣爬出。此種方法對材料和試劑要求低，成本低，但相對耗時，得到的細胞量較少，純度相對較高。改良的組織塊法則首先用酶消化肌肉得到分散的肌纖維后，再將肌纖維進行貼壁培養(yǎng)，幾天后肌衛(wèi)星細胞便會從肌纖維里爬出，此法相對更高效省時。單肌纖維分離法是1977年由Bekoff和Betz提出來的基于肌衛(wèi)星細胞的自發(fā)遷移特性分離肌衛(wèi)星細胞的方法［25］，此方法優(yōu)勢在于可以清楚觀察衛(wèi)星細胞自肌纖維中遷移、增殖的過程［26-27］。此法一般將肌肉組織剪成約1 cm2的小塊后，利用膠原酶消化分離完整的單根肌纖維，而后將單根肌纖維貼附于培養(yǎng)皿底部待細胞從纖維中爬出并由圓形變?yōu)樗笮伍_始大量增殖后，移除單根肌纖維，繼續(xù)培養(yǎng)最終獲得足量肌衛(wèi)星細胞。

然而，無論以上哪種方法，都很難分離得到較純的肌衛(wèi)星細胞。早期研究常借助Percoll密度梯度離心法純化肌衛(wèi)星細胞，雖然在一定程度上可以實現(xiàn)肌衛(wèi)星細胞的富集，但此方法體系的重復性和分離的細胞純度仍存在較大的不穩(wěn)定性［28］。與之相比，磁珠分選或者流式細胞分選則是根據(jù)肌衛(wèi)星細胞特有的表面標志物將其從一群混合細胞中進行分離純化，得到的細胞相對純度較高，但成本也較高。此類方法的有效和可靠性很大程度依賴于肌衛(wèi)星細胞的表面標志物的發(fā)現(xiàn)和鑒定，比如人、豬和牛的心肌干細胞一般通過CD56、CD29陽性和CD31、CD45陰性組合進行富集分選［29］。然而目前有許多種屬動物的肌衛(wèi)星細胞標志物尚待明確，而且抗體和磁珠價格昂貴，它們的使用對于規(guī)?；募毎囵B(yǎng)肉生產(chǎn)而言會導致成本顯著增加。未來開發(fā)更經(jīng)濟有效的肌衛(wèi)星細胞分離技術(shù)，制定特異性的分離條件，選擇性地促進肌衛(wèi)星細胞生長或者選擇性地抑制其他類型的細胞生長將為細胞培養(yǎng)肉規(guī)?；a(chǎn)提供堅實基礎(chǔ)。

2.2 細胞大規(guī)模培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)肉的生產(chǎn)需要大量分化的肌肉細胞來形成組織。因此，細胞大規(guī)模擴增是細胞培養(yǎng)肉商業(yè)化面臨的重大挑戰(zhàn)。發(fā)展高效、安全、規(guī)?；募毎笠?guī)模擴增體系，有效降低細胞培養(yǎng)肉的生產(chǎn)成本顯得尤為重要［30］。肌衛(wèi)星細胞體外擴增培養(yǎng)需要同時維持細胞的增殖能力和肌肉分化能力，然而由于體外培養(yǎng)環(huán)境和體內(nèi)生理環(huán)境存在差異，干細胞體外擴增過程中會出現(xiàn)細胞增殖能力減弱甚至衰老的現(xiàn)象。研究顯示，即使在適宜的體外環(huán)境，經(jīng)過三次傳代培養(yǎng)Pax7陽性的肌衛(wèi)星細胞也會從剛分離的接近100%迅速降低到只有30%～50%［31］。目前，研究人員已經(jīng)開發(fā)了一系列小分子和合適細胞外基質(zhì)環(huán)境等促進肌衛(wèi)星細胞體外擴增表型維持。比如Xu等［32］通過篩選2400種化合物小分子，發(fā)現(xiàn)腺苷酸環(huán)化酶激活劑forskolin可通過提高環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平促進肌衛(wèi)星細胞的增殖。Ding等［33］發(fā)現(xiàn)在牛肌衛(wèi)星細胞體外增殖的過程中使用p38抑制劑（SB203580），可以提高牛肌衛(wèi)星細胞增殖能力和PAX7表達，而且解除抑制后肌衛(wèi)星細胞分化成肌肉細胞的能力也有改善。Judson等［34］還發(fā)現(xiàn)通過使用組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（PFI-2）可以促進β-catenin入核并促進肌肉相關(guān)基因表達，維持人肌衛(wèi)星細胞體外培養(yǎng)表型。此外，通過模擬肌肉生理的組織硬度，將肌衛(wèi)星細胞培養(yǎng)在硬度合適的基質(zhì)或水凝膠里也能顯著增強肌衛(wèi)星細胞的增殖活性并保持擴增過程中肌衛(wèi)星細胞的表型［35-36］。

細胞大規(guī)模培養(yǎng)除了需要促進細胞增殖和維持表型外，采用低成本和安全的培養(yǎng)基也至關(guān)重要［37］。細胞培養(yǎng)常用培養(yǎng)基中都含有血清，而血清售價極高，且其中的動物源成分復雜未知，批次間差異大，有病毒感染風險和監(jiān)管難度大等問題，因此不適用于細胞培養(yǎng)肉的生產(chǎn)應用。無血清培養(yǎng)體系組分清晰明確、易于分離以及質(zhì)控更為安全可靠，開發(fā)無動物源成分的培養(yǎng)基是保證細胞擴大培養(yǎng)過程可控的有效途徑［38］。目前已有針對胚胎干細胞和間充質(zhì)干細胞的無血清培養(yǎng)基［39-40］。針對如何開發(fā)無血清培養(yǎng)基，van der Valk等［41］曾提出了“金字塔”模型。在這個模型中，從底部往頂部分別包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、基質(zhì)包被的培養(yǎng)皿、生長因子、激素類物質(zhì)、β-巰基乙醇、脂類和維生素等。底部一般是通用性強的成分，越往金字塔頂部，其作為無血清培養(yǎng)基成分的特異性越高。目前針對肌衛(wèi)星細胞的無血清培養(yǎng)基的開發(fā)也提示適當濃度的睪酮激素和類胰島素生長因子可以促進成肌細胞增殖［42-43］。有研究報道在F-12培養(yǎng)基中添加胎球蛋白、胰島素和地塞米松后構(gòu)建的無血清培養(yǎng)基對肌衛(wèi)星細胞的增殖作用能夠達到與傳統(tǒng)10%馬血清培養(yǎng)基相似的效果［44］。但對于細胞培養(yǎng)肉而言，使用無動物源的添加成分，并且將小鼠和人的無血清培養(yǎng)體系應用到畜禽動物細胞上，并進一步優(yōu)化到食品生產(chǎn)領(lǐng)域，仍是巨大的挑戰(zhàn)。最為理想的細胞培養(yǎng)肉培養(yǎng)基應該是無動物源、符合食品安全要求、滿足成本效益、供應鏈穩(wěn)定可靠且能保證細胞擴增性能維持、符合監(jiān)管要求。

規(guī)?；a(chǎn)中，除了需要提供合適的細胞培養(yǎng)環(huán)境和培養(yǎng)基外，生物反應器作為動物細胞大規(guī)模高密度培養(yǎng)的平臺，也是細胞培養(yǎng)肉種子細胞擴增規(guī)?；?、自動化必不可少的設備。傳統(tǒng)二維培養(yǎng)因其比表面積較低，不能對培養(yǎng)條件進行實時監(jiān)測，傳代過程煩瑣等一系列不足不適合用于細胞的擴大培養(yǎng)。生物反應器可以根據(jù)細胞的生長特性，模仿天然組織結(jié)構(gòu)的生長環(huán)境，實時監(jiān)控細胞狀態(tài)，實現(xiàn)體外細胞規(guī)?；瘮U增。近年隨著工程技術(shù)的發(fā)展，動物細胞培養(yǎng)的生物反應器種類越來越多，如攪拌式、鼓泡式、氣升式，以及動物組織培養(yǎng)最常使用的三維支架+灌注式等［45］。攪拌式生物反應器因其結(jié)構(gòu)簡單、易于操作，是目前應用最廣泛的一種生物反應器，但反應器內(nèi)部流體的混合、剪切應力容易造成細胞早衰或死亡［46］。減小灌流速度可以降低剪切力對細胞的損害，但也容易造成反應器內(nèi)溫度、pH和溶氧不均一，影響營養(yǎng)物質(zhì)傳輸，并造成代謝廢物局部累積［46］，因此不是最佳的細胞擴增系統(tǒng)。由于肌衛(wèi)星細胞本身的貼壁生長特性，在利用生物反應器進行擴大培養(yǎng)時可結(jié)合三維支架或微載體。利用支架或載體表面積大、細胞承載量高、成本相對低廉等特點，與生物反應器聯(lián)合應用，制造出填充床式細胞生物反應器，實現(xiàn)動物細胞的高密度培養(yǎng)［47］。填充床式細胞生物反應器的優(yōu)點是對細胞剪切力小、細胞截留效率高，但在進行規(guī)模化放大時，由于載體被積壓填入籃框內(nèi)，使載體和細胞的分離困難，也不便中間取樣觀察，因此在實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)時仍有很多問題尚待解決［48］。有關(guān)生物材料用于細胞擴增相關(guān)內(nèi)容，下文將更詳細介紹。未來用于肌衛(wèi)星細胞擴增的生物反應器需要具備自動化誘導培養(yǎng)、擴增、成像、下游分化等功能，提供細胞擴增時的過程數(shù)據(jù)、代謝變化、蛋白組數(shù)據(jù)等，在降低干細胞生產(chǎn)成本的同時提高細胞質(zhì)量，尤其開發(fā)低剪切力、混合效率高的反應器也是重點之一。

2.3 細胞成肌分化

獲得足夠數(shù)量的種子細胞后，如何模擬動物肌肉組織生長環(huán)境，促進干細胞肌肉系分化，培養(yǎng)出復雜的肌肉組織是現(xiàn)階段細胞培養(yǎng)肉生產(chǎn)的另一個挑戰(zhàn)。一般來說，用低濃度的馬血清培養(yǎng)肌衛(wèi)星細胞可以促進其向肌肉細胞分化，但制備細胞培養(yǎng)肉則需要建立更經(jīng)濟有效且符合食品要求的肌肉分化體系。為了更好模擬真實肉類的組成，人們也嘗試將肉類中含有的多種細胞（如脂肪細胞）共培養(yǎng)，因為脂肪含量對肉類的口感、風味、嫩度和緊實度等都有影響［49］。此外，某些特定的細胞因子也對干細胞的肌肉系分化起非常重要的作用。比如通過IGF-1配制的無血清分化培養(yǎng)基，可以通過PI3K/Akt信號通路促進干細胞體外肌肉系分化［43］。鳶尾素可以通過激活I(lǐng)L-6促進成肌肉分化和肌管融合［50］。機械拉力和電刺激也能促進肌細胞分化和肌管成熟［51］。而細胞培養(yǎng)肉生產(chǎn)的最終目標是在體外培養(yǎng)出與真實肌肉組織相同的肌肉組織，近年，隨著組織工程的發(fā)展，為探索干細胞分化形成大塊肌肉組織提供了有效手段［52］。通過模擬肌肉體內(nèi)發(fā)育和生長環(huán)境，將種子細胞接種到能提供三維環(huán)境的支架材料上，使其生長、分化、發(fā)育成肌肉細胞，再通過肌肉細胞間的融合形成多核肌管，多核肌管進一步分化為肌纖維，就能得到類似肌肉形態(tài)和生理特征的人造肌肉組織［53］。

3 用于細胞培養(yǎng)肉生物材料支架的技術(shù)要求

從材料學的視角，肉是一種多組分、多層次結(jié)構(gòu)、各向異性的復雜生物材料。因此從仿生學角度，借助生物支架開發(fā)形態(tài)結(jié)構(gòu)與質(zhì)地組織接近真實肉類的高質(zhì)量細胞培養(yǎng)肉將是生產(chǎn)細胞培養(yǎng)肉的最佳選擇。開發(fā)食品安全級、能降解、多孔隙的非動物來源或動物源的生物材料支架，是優(yōu)化細胞培養(yǎng)肉形態(tài)結(jié)構(gòu)和口感質(zhì)地的關(guān)鍵［54］。目前，用于細胞培養(yǎng)肉生產(chǎn)的支架材料根據(jù)其成分的可食用性分為不可食用和可食用支架。不可食用支架的材料一般是具有特殊功能特性的生物材料，可促進細胞的增殖分化和蛋白合成等，但在細胞分化培養(yǎng)完成后需要與培養(yǎng)肉進行分離。而不可食用支架尚存在回收困難、成本高、穩(wěn)定性不足等問題。可食用支架的組成一般是一些天然材料，具有可食用性，培養(yǎng)后無需去除，所以是目前細胞培養(yǎng)肉支架的研究熱點。理想的細胞培養(yǎng)肉生物支架應具有合適的比表面積，為細胞提供足夠的黏附和生長空間。具有類似肌肉生理狀態(tài)下的平行拓撲結(jié)構(gòu)，能輔助形成細胞組織紋理及微觀結(jié)構(gòu)，維持肌肉組織三維結(jié)構(gòu)。由于肌肉細胞生理情況下具有自發(fā)收縮的特性，因此，支架材料應有一定的力學性能，可機械拉伸，能夠在外界拉力的調(diào)控下為細胞分化提供適當力學刺激。此外，為了保證支架內(nèi)的細胞有足夠營養(yǎng)和氧氣供給，支架需要疏松多孔，確保培養(yǎng)基和氧氣滲透。為了實現(xiàn)細胞培養(yǎng)肉的商業(yè)化生產(chǎn)，支架材料還要易獲得，且成本低。

4 用于細胞培養(yǎng)肉的生物材料支架分類

肌衛(wèi)星細胞和其他被用于細胞培養(yǎng)肉的種子細胞都屬貼壁細胞。生物支架能為種子細胞的黏附、增殖和分化提供空間結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)肌肉組織三維培養(yǎng)和制造，因此生物支架對具有組織結(jié)構(gòu)的細胞培養(yǎng)肉產(chǎn)品（如肉排和肉塊）的生產(chǎn)至關(guān)重要［55］。從形式分類，目前適用于細胞培養(yǎng)的生物支架主要包括微載體、多孔支架和水凝膠3類。

4.1 微載體

微載體是直徑在60～250 μm的微球，早在20世紀60年代，van Wezel等［56］率先將貼壁細胞培養(yǎng)于DEAE-Sephadex A 50微球上。相較于傳統(tǒng)單層細胞培養(yǎng)技術(shù)，微載體為貼壁細胞提供了更大的培養(yǎng)表面積，使細胞產(chǎn)量大大增加。多種類型微載體已被成功開發(fā)，并被用于包括成纖維細胞、間充質(zhì)干細胞、胚胎干細胞和誘導多能干細胞等不同類型細胞的擴大培養(yǎng)。目前商業(yè)化微載體主要由各類天然和合成高分子制得，如葡聚糖（Cytodex 1/3）、明 膠（Cultispher）、纖 維 素（Cytopore）、聚 乙 烯（Cytoline）、聚 苯 乙 烯（SynthemaxⅡ、SoloHill、Hillex），以上微載體多應用于疫苗/藥物開發(fā)和生物醫(yī)用領(lǐng)域，且大部分高分子不可食用或來源于動物組織［57］。微載體可作為肌肉細胞黏附和增殖的臨時性基質(zhì)，雖然上述商業(yè)化微載體在不考慮成本的情況下可用于細胞培養(yǎng)肉產(chǎn)業(yè)，但需其能與處于不同加工階段的肌肉細胞分離，在這種情況下微載體基質(zhì)可為非食用型高分子。若微載體和細胞的分離有較大困難或分離成本過高，則需微載體在培養(yǎng)肉生物加工過程中能被降解或溶解，也可直接將含細胞微載體加工進入培養(yǎng)肉內(nèi)，這種情況下需其具有可食用性［58］。荷蘭馬斯特里赫特大學的Post教授課題組［59］證實原代提取的牛成肌細胞可在3種微載體擴大培養(yǎng)，為商業(yè)化牛肉細胞培養(yǎng)奠定一定基礎(chǔ)，但依賴酶消化技術(shù)將細胞和微載體分離價格昂貴，很難在利潤空間有限的細胞培養(yǎng)肉行業(yè)推廣［圖2（a）］。Modern Meadow公司設計了基于果膠和卡豆素A的一種可食用型微載體，該公司致力于為生物醫(yī)藥和細胞培養(yǎng)肉領(lǐng)域提供非動物源性生物支架材料［63］。

圖2 （a）成肌細胞在三種商業(yè)化微載體上的生長情況；（b）脫細胞菠菜葉支架用于肌肉干細胞培養(yǎng)［60］；（c）商業(yè)化大豆組織蛋白結(jié)構(gòu)及肌肉細胞黏附［61］；（d）凝膠纖維束結(jié)合電刺激制備具有高度整齊排列肌管的肌肉組織［62］；（e）水凝膠結(jié)合懸浮生物打印技術(shù)成功組裝人工牛排［18］Fig.2(a)Myoblasts seeded on three commercial microcarriers;(b)Decellularized spinach leaf scaffold for satellite cell culture[60];(c)Structure of commercial textured soy protein scaffold and muscle cell adhesion[61];(d)Fabrication of muscle tissues with highly aligned myotubes using hydrogel fiber together with electrical stimulation method[62];(e)Hydrogel combining with suspension bioprinting technology successfully assembles artificial steak[18]

4.2 多孔支架

多孔支架是指具有互相連通的微米級孔狀結(jié)構(gòu)生物材料，又稱海綿支架，支架的多孔結(jié)構(gòu)提供細胞黏附和增殖的空間，又能及時運輸細胞生長所需養(yǎng)料和代謝廢物［64］。多孔支架能提供種子細胞所需的力學支撐，為肌肉組織制造和細胞外基質(zhì)沉積提供場所［65］?？墒秤玫拿摷毎げ巳~多孔支架具有獨特的微血管樣結(jié)構(gòu)，已被用于原代牛肌衛(wèi)星細胞培養(yǎng)，14 d的培養(yǎng)結(jié)果顯示肌衛(wèi)星細胞的存活率可達99%，其中25%的細胞可表達肌球蛋白重鏈，以上結(jié)果表明菠菜葉脫細胞可作為細胞培養(yǎng)肉用三維支架，且具有成本低易獲取等優(yōu)點［60］［圖2（b）］。以色列理工學院的Levenberg教授課題組［61］以商業(yè)化大豆組織蛋白（一種大豆榨油剩下的脫脂油渣加工成型的產(chǎn)品），作為細胞培養(yǎng)肉多孔支架，可通過改變植物蛋白組分和加工工藝調(diào)控支架孔徑、營養(yǎng)成分、質(zhì)地和彈性性能以滿足培養(yǎng)肉要求［圖2（c）］。牛肌衛(wèi)星細胞能在該支架上黏附和增殖，并可通過調(diào)控細胞培養(yǎng)基成分以及利用細胞共培養(yǎng)技術(shù)促進肌肉發(fā)生和細胞外基質(zhì)的快速沉積。最近，渥太華大學的Pelling教授課題組［66］制備了一種多孔面包瓤支架材料，該面包支架在4周的細胞培養(yǎng)過程中結(jié)構(gòu)完成，多種細胞可在該支架上黏附和增殖，無細胞毒性，細胞無顯著氧化應激反應。此外，小鼠成肌細胞（C2C12）可在面包支架上分化，并逐步融合成肌肉纖維，說明面包支架具有用于細胞培養(yǎng)肉的巨大潛力，由于面包支架制備過程未使用酵母，可有效避免外源雜細胞對培養(yǎng)肉的污染。

4.3 水凝膠

水凝膠是親水性高分子通過物理或/和化學交聯(lián)形成的一種三維網(wǎng)絡生物材料［67］。大部分肌肉組織細胞都存在于細胞外基質(zhì)（ECM），水凝膠結(jié)構(gòu)和ECM高度相似，因此水凝膠是一種非常理想的細胞培養(yǎng)肉支架材料。用于細胞培養(yǎng)的水凝膠材料需具有良好的細胞相容性，且培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)和信號分子可滲透過水凝膠到達細胞，可通過調(diào)節(jié)高分子濃度、活性交聯(lián)點數(shù)量、交聯(lián)方式等調(diào)節(jié)水凝膠的滲透動力學［68-70］。除以上水凝膠理化特點外，水凝膠的力學性能如剛度對細胞黏度、遷移、增殖和分化影響巨大，在設計細胞培養(yǎng)肉水凝膠支架時也需重點考慮［71-72］。東京大學Takeuchi教授課題組［62］將原代提取的牛肌細胞種植于膠原或fibrin-matrigel凝膠纖維束中結(jié)合電刺激進行14 d細胞培養(yǎng)，成功制備出具有長軸方向排列肌小管的三維培養(yǎng)肉，這是科學家第一次成功培育出具有高度整齊排列肌管的肌肉組織［圖2（d）］。大阪大學科學家Kang等［18］使用肌腱凝膠結(jié)合懸浮生物打印技術(shù)成功制備了包括42根肌肉纖維、28根脂肪組織、2根毛細血管的牛排狀肉組織，免疫組織染色結(jié)果顯示該培養(yǎng)肉中肌纖有序排列［圖2（e）］。

5 細胞培養(yǎng)肉用高分子材料

用于細胞培養(yǎng)肉的微載體、多孔材料和水凝膠等生物支架的主體結(jié)構(gòu)為天然或合成高分子。與用于生物醫(yī)藥的生物支架要求相比，用于細胞農(nóng)業(yè)的高分子需具有良好的細胞相容性、可食用性、易加工、可烹飪、成本低、可大規(guī)模生出等特點。在這一部分著重介紹能在細胞培養(yǎng)肉中能被使用的高分子原材料。

5.1 蛋白類高分子

膠原是一種是存在于動物結(jié)締組織中的天然蛋白高分子，是ECM的主要組成成分，具有很強的伸展能力，已經(jīng)在組織工程領(lǐng)域廣泛應用，并被證實能促進肌肉細胞遷移、增殖和成肌分化［73］。大量文獻證實膠原支架可用于生物人工肌肉的制備，并能實現(xiàn)肌肉收縮，而在合成高分子支架上則很難實現(xiàn)這一功能［10，74-77］。因此，膠原蛋白可用于在實驗室階段細胞培養(yǎng)肉的前期研發(fā)，但膠原蛋白需從動物體內(nèi)提取，在細胞培養(yǎng)肉大規(guī)模商業(yè)化階段則被限制使用。最近，明膠（膠原蛋白水解產(chǎn)物）也被用于制備細胞培養(yǎng)肉，通過擠出-交聯(lián)成型技術(shù)制備明膠纖維，并將牛大動脈平滑肌細胞和兔骨骼肌成纖維細胞種植其上，雖然能重建部分肌肉組織形態(tài)，但缺乏成熟可收縮肌肉結(jié)構(gòu)［78］。Jiang等［79］開發(fā)了一種無毒交聯(lián)技術(shù)，制備了玉米朊紡絲納米纖維支架，其能為成纖維細胞黏附和生長提供支持。

植物蛋白由于其價格低、易獲取、易加工性等優(yōu)點，將會成為細胞培養(yǎng)肉支架材料的重要來源。目前能被加工成生物支架的植物蛋白主要包括大豆蛋白和玉米朊。大豆蛋白具有較高的細胞相容性以及和ECM基質(zhì)類似的生化特性，被用于細胞培養(yǎng)肉開發(fā)。前述Levenberg教授課題組即利用大豆蛋白材料制備可食用可烹飪的人造牛肉［61］。玉米朊是一種可溶于乙醇的植物蛋白，具有良好的細胞相容性，可被加工成多種類型的生物支架。Qu等［80］發(fā)現(xiàn)玉米朊多孔支架能促進人間充質(zhì)干細胞的黏附、增殖以及成體外骨分化。以上研究都充分說明，玉米朊是一種非常有潛力的可用于細胞培養(yǎng)肉的高分子材料。植物源蛋白高分子通常缺乏足夠的力學強度且易降解，可通過在加工過程中使用無毒交聯(lián)劑或者向其中復合剛性強、降解時間長的其他高分子［81］。

5.2 多糖類高分子

多糖是由多個單糖分子脫水聚合形成的高分子，以糖苷鍵連接而成，結(jié)構(gòu)多為直鏈或者有分支的長鏈，可從動物、植物和微生物中提取獲得。具有良好細胞相容性且已在組織工程大量應用的多糖分子主要包括糖胺聚糖、殼聚糖、海藻酸、纖維素等。在再生醫(yī)學領(lǐng)域，透明質(zhì)酸（一種可從細菌發(fā)酵獲取的糖胺聚糖）已經(jīng)開發(fā)成多種水凝膠支架，用于促進組織修復和包裹動物干細胞［82］。透明質(zhì)酸分子缺乏和絕大多數(shù)動物細胞黏附受體，難以用于肌肉細胞的擴大培養(yǎng)，但可作為輔料用于細胞培養(yǎng)肉的后期加工。殼聚糖是一種從蝦殼和螃蟹殼中獲取的線性多糖，結(jié)構(gòu)為氨基葡萄糖（脫乙酰單位）和N-乙酰葡糖胺（乙酰單位）隨機分布，并通過β-（1→4）糖苷鍵組合而成。利用殼聚糖和膠原經(jīng)電噴霧技術(shù)制備復合水凝膠微載體，C2C12細胞可在其上黏附并快速生長，由于殼聚糖/膠原微球具有可食性，可將載有細胞的微載體進行加工制成人造肉產(chǎn)品［83］。Park等［84］使用殼聚糖基多孔納米纖維膜支架給C2C12細胞遞送藻藍素，可有效減少細胞培養(yǎng)肉制備中培養(yǎng)基中血清的使用，可大幅降低生產(chǎn)成本，為實現(xiàn)細胞培養(yǎng)的工業(yè)化奠定基礎(chǔ)。從海草中提取的海藻酸是一種自然界中含量巨大的可再生多糖高分子，當在二價陽離子（如Ca2+）存在下迅速形成物理交聯(lián)凝膠。因為該凝膠是在非冷凍的低溫條件下成形的，因此海藻酸尤其適用于烘肉卷、肉丸以及海鮮刺身的生產(chǎn)加工，且食品級海藻酸每公斤約10美元，滿足細胞培養(yǎng)肉中生物材料的低成本要求［85］。Schuster等［86］制備了一種具有毛細管結(jié)構(gòu)的海藻酸凝膠支架材料，可引導C2C12細胞的取向排列生長。纖維素是一種線性多糖，被認為是最可持續(xù)的高分子，來自于植物細胞壁，修飾和未修飾的纖維素支架被應用于細胞培養(yǎng)［87-88］。利用纖維素制備的商業(yè)化微載體材料（Cytopore）被用于中國倉鼠卵巢（CHO）細胞的擴大培養(yǎng)，在疫苗生產(chǎn)中已得到廣泛使用，在肌肉細胞懸浮培養(yǎng)體系中可借用這一技術(shù)實現(xiàn)培養(yǎng)肉的快速獲得。Dugan等［89］通過硫酸水解法制備纖維素納米晶須，利用旋轉(zhuǎn)涂抹技術(shù)制備納米晶須表面，并將C2C12細胞種植于納米纖維素表面，結(jié)果顯示細胞黏附于纖維素材料表面，取向納米晶須表面可促進成肌分化。

圖3 細胞培養(yǎng)肉用高分子材料Fig.3 Polymer materials for cell culture meat

6 細胞培養(yǎng)肉用生物支架的工程化設計

大規(guī)模哺乳動物細胞培養(yǎng)技術(shù)已在生物醫(yī)藥和細胞治療領(lǐng)域得到應用，細胞培養(yǎng)肉面臨著真正制造一塊肌肉組織而不是一團細胞漿糊的挑戰(zhàn)，在這一部分將重點討論細胞培養(yǎng)用生物支架的設計與工程化制備思路，以期制造結(jié)構(gòu)仿真的細胞培養(yǎng)肉。

6.1 細胞黏附

有些支架材料高分子具有天然的細胞黏附功能，例如膠原和明膠等。相反，另外一些高分子材料如糖胺聚糖、海藻酸、纖維素等則需通過理化修飾實現(xiàn)細胞黏附功能。最常用的促細胞黏附策略是在高分子材料上物理或者化學結(jié)合細胞黏附基序，以使細胞膜相關(guān)蛋白能識別高分子并黏附于其上。精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸（RGD）序列是應用最廣泛的細胞黏附單元，能與細胞膜上整合素蛋白αVβ3結(jié)合。修飾有RGD序列海藻酸水凝膠能 促 進C2C12細 胞在 支架 上 的 黏 附［90］。Chandler等［91］使用3T3-L1前體脂肪細胞證實，與對照組相比，修飾有RGD序列的海藻酸支架材料能增加平均細胞數(shù)量以及總細胞區(qū)域。RGD序列還可結(jié)合纖維素結(jié)合區(qū)域（CBD）用以增加特定支架材料功能，例如，CBD-RGD復合物當加入到細菌纖維支架上后能增加人微血管內(nèi)皮細胞和小鼠胚胎成纖維細胞的黏附和活性［92］。以上CBD序列可在參與纖維素降解和暴露纖維素底物催化基序的植物酶復合物中發(fā)現(xiàn)，通過將這些結(jié)構(gòu)域與哺乳動物細胞黏附基序相結(jié)合，可用于改善植物源生物支架的功能。纖連蛋白結(jié)構(gòu)域脯氨酸-組氨酸-絲氨酸-精氨酸-天冬酰胺序列（PHSRN）也被證明可以改善支架材料的黏合性能［93］。此外，使用層粘連蛋白衍生結(jié)構(gòu)域，異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸序列（IKVAV）修飾透明質(zhì)酸水凝膠材料，可促進小鼠肌原性祖細胞黏附及上調(diào)肌原因子MyoD1和Pax7的表達［94］。

6.2 線性排列

體內(nèi)的肌肉纖維通常以規(guī)則線性排列的模式存在，這種排列有助于肉的獨特質(zhì)地形成。除了纖維排列對肉紋理感知的直接影響外，排列還能影響肌肉細胞分化、成熟和基因表達。使用各向異性的三維支架或二維基底誘導肌纖維排列最為常見［95］。在肌肉組織工程領(lǐng)域，可通過各向異性生物材料誘導肌肉細胞線性排列，例如使用靜電紡絲制備的取向納米纖維可誘導肌肉細胞線性排列［96］。與隨機取向的靜電紡絲纖維相比，在取向排列的纖維支架上培養(yǎng)的肌肉細胞的肌管不僅能沿纖維方向排列，而且在分化培養(yǎng)基中形成肌管的長度也增加1倍［97］。支架纖維的長度對肌細胞排列至關(guān)重要，短（約20μm）纖維促進細胞的球形聚集，而較長（約1 cm）的纖維能夠產(chǎn)生排列良好的組織［78］。和肌肉組織工程類似，在設計細胞培養(yǎng)肉用生物支架時需考慮生物支架的線性排列特點，但靜電紡絲技術(shù)價格昂貴，且效率低，無法滿足培養(yǎng)肉大規(guī)模生產(chǎn)要求。取向冷凍技術(shù)可大規(guī)?？焖僦苽涓飨虍愋陨锊牧?，值得科學家進行深入研究［98］。

7 展望

雖然動物來源肉類的生產(chǎn)經(jīng)過幾千年發(fā)展已基本能滿足人們需求，但為消除畜牧業(yè)生產(chǎn)對環(huán)境造成的污染，細胞培養(yǎng)肉的研發(fā)和生產(chǎn)仍越來越受到科研人員、企業(yè)家和政府部門的關(guān)注。本文從細胞培養(yǎng)肉技術(shù)出發(fā)，重點綜述細胞培養(yǎng)肉的發(fā)展歷程，細胞培養(yǎng)肉生產(chǎn)流程，可用于培養(yǎng)肉的生物材料支架的特點、類型、高分子材料以及工程化制備方法等內(nèi)容。相較于組織工程支架，細胞培養(yǎng)肉支架的成本控制以及可食用性要求將被重點考慮，是細胞培養(yǎng)肉能否產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵因素之一。利用微載體的超高比表面積可大規(guī)模培養(yǎng)種子細胞；多孔支架在模擬肌肉組織各向異性結(jié)構(gòu)特點中起關(guān)鍵作用，能促進種子細胞向肌纖維分化；水凝膠具有和ECM相似的結(jié)構(gòu)，可結(jié)合外界刺激和3D打印等技術(shù)構(gòu)建肌肉組織的復雜結(jié)構(gòu)。細胞培養(yǎng)肉產(chǎn)業(yè)最終目標是擺脫利用家畜制備肉類現(xiàn)狀，利用可持續(xù)策略為人類提供優(yōu)質(zhì)替代蛋白，因此家畜來源的高分子如膠原和明膠制備的生物材料支架需要謹慎使用，未來科學家應重點開發(fā)基于植物源高分子（大豆蛋白、玉米蛋白、海藻酸、纖維素等）的生物材料支架。此外，結(jié)構(gòu)仿真、營養(yǎng)可控和口感真實的細胞培養(yǎng)肉是該領(lǐng)域技術(shù)難點之一，組建跨材料、化學、細胞生物學、畜牧學和營養(yǎng)科學的多學科聯(lián)合攻關(guān)團隊有望解決以上挑戰(zhàn)。