樊 芳，田凈凈，趙智華，馬清敏，李科軍，賈志旸

作者單位：1(050000)中國(guó)河北省石家莊市，河北省人民醫(yī)院眼科；2(050000)中國(guó)河北省石家莊市，河北省胸科醫(yī)院眼科

0引言

青光眼是全球重要的致盲性眼病[1]，我國(guó)青光眼的患病人數(shù)也在逐年增加。目前阻止青光眼進(jìn)展唯一有效的方法是控制眼壓。在藥物和激光不能有效降低眼壓的情況下，抗青光眼手術(shù)是控制眼壓的重要手段。盡管近年來(lái)有很多非濾過(guò)道依賴(lài)性手術(shù)的有效性被證實(shí)，但青光眼濾過(guò)性手術(shù)(glaucoma filtration surgery，GFS)目前仍然是臨床上控制眼壓的經(jīng)典術(shù)式。該手術(shù)能有效控制眼壓，但術(shù)后濾過(guò)區(qū)域纖維增殖是導(dǎo)致手術(shù)失敗的主要原因。雖然術(shù)中應(yīng)用抗代謝藥物可以控制濾過(guò)區(qū)域瘢痕化，提高手術(shù)成功率，但同時(shí)也增加了患者眼表?yè)p傷及濾過(guò)泡滲漏等并發(fā)癥出現(xiàn)的概率[2-4]。因此，GFS術(shù)中或術(shù)后尋找一種有效且安全的方法，能夠控制術(shù)后瘢痕形成且不增加其他并發(fā)癥發(fā)生率，是值得研究的問(wèn)題。K-115是一種新型降眼壓藥物，可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞骨架作用減少小梁網(wǎng)阻力，增加小梁網(wǎng)房水流出速率，對(duì)開(kāi)角型青光眼有明確的降眼壓效果[5-6]。研究證實(shí)，除了降眼壓作用外， K-115也參與調(diào)控GFS術(shù)后瘢痕化過(guò)程，但是其相關(guān)調(diào)控機(jī)制并不完全清楚[7]。自噬是細(xì)胞受到外界刺激后，增強(qiáng)自身的吞噬功能，降解細(xì)胞自身有害物質(zhì)，維持細(xì)胞自身穩(wěn)態(tài)的代謝途徑。在肝腎等器官纖維化疾病中自噬已被證實(shí)具有重要的調(diào)控作用[8-10]。本研究旨在探討K-115調(diào)控GFS術(shù)后瘢痕化是否受到細(xì)胞自噬功能的影響。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本收集標(biāo)本取自2018-09/2019-09于河北省人民醫(yī)院眼科行青光眼手術(shù)患者的Tenon囊組織，采用組織塊法進(jìn)行人Tenon囊成纖維細(xì)胞(human Tenon’s finroblasts，HTFs)的原代及傳代培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)遵循《赫爾辛基宣言》，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)河北省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)[批準(zhǔn)號(hào)：2017科倫審第(05)號(hào)]，詳細(xì)告知患者實(shí)驗(yàn)方案，取得患者同意并簽署知情同意書(shū)。

1.1.2主要試劑和儀器設(shè)備培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、Hanks液(美國(guó)Gibco公司)，CCK-8試劑盒(日本Dojindo公司)， 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)(美國(guó)Peprotech公司)，K-115(美國(guó)MCE公司)，EMbed 812包埋試劑盒(美國(guó)Electron Microscopy Sciences，公司)， Hoechst 33342/PI雙染試劑盒(北京Solarbio公司)。倒置相差顯微鏡(HF100F，日本Nikon公司)，自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(Mustikan，芬蘭Labsystem公司)，透射電子顯微鏡(HT7700，日本Hitachi公司)，切片機(jī)(UC7，德國(guó)Leica公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和處理在組織塊接種后3～7d可見(jiàn)原代HTFs從組織塊邊緣游出，約2wk達(dá)到80%～90%融合，急性傳代培養(yǎng)，經(jīng)免疫組織化學(xué)法鑒定可見(jiàn)波形蛋白陽(yáng)性表達(dá)，角蛋白表達(dá)陰性。取第3～6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞分為4組：(1)對(duì)照組：加入溶劑二甲基亞砜(DMSO)處理；(2)TGF-β1組：加入10μg/L TGF-β1處理24h；(3)TGF-β1+5 K-115組：5μmol/L K-115預(yù)處理2h后，加入10μg/L TGF-β1處理24h；(4)TGF-β1+10 K-115組：10μmol/L K-115預(yù)處理2h后，加入10μg/L TGF-β1處理24h。由于無(wú)血清饑餓是誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的刺激因素，故本研究未采用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，以排除無(wú)血清饑餓對(duì)細(xì)胞自噬水平的影響。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。

1.2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力參考試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟，對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HTFs以5×103/孔接種于96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞分組處理結(jié)束后，每孔中加入CCK-8溶液，孵育2h后應(yīng)用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)量吸光度。為研究單獨(dú)應(yīng)用K-115對(duì)細(xì)胞增殖的影響，這部分研究增加了僅添加5μmol/L K-115的5 K-115組和僅添加10μmol/L K-115的10 K-115組。

1.2.3劃痕試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HTFs以4×105/孔接種于六孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后應(yīng)用10μL Tip頭在六孔板中做垂直劃痕，以PBS沖洗去除細(xì)胞殘片后，按上述分組方法處理細(xì)胞，置于相差顯微鏡下觀察并記錄劃痕距離后再置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后于相差顯微鏡再次觀察并記錄劃痕距離，計(jì)算遷移距離百分?jǐn)?shù)，遷移距離百分?jǐn)?shù)=24h劃痕寬度/0h劃痕寬度×100%。

1.2.4透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬小體按上述分組方法處理細(xì)胞后用0.1mol/L碳酸氫鈉(pH7.4)緩沖液配制的3%戊二醛固定HTFs 1h，然后0.1mol/L磷酸緩沖液配制的1%鍔酸避光室溫固定HTFs 2h。用分級(jí)醇脫水后，將細(xì)胞滲透包埋于EMbed 812包埋劑中，并在60℃下聚合48h。樹(shù)脂塊在切片機(jī)上制作切片后用醋酸鈾酰和鉛染色，并于透射電子顯微鏡下觀察。本研究增加了自噬抑制劑3-MA作為自噬陰性對(duì)照組即TGF-β1+3-MA組，采用5mmol/L 3-MA預(yù)處理細(xì)胞2h后，加入10μg/L TGF-β1處理24h，并增加了自噬激動(dòng)劑雷帕霉素作為自噬陽(yáng)性對(duì)照組即TGF-β1+Rap組，采用100nmol/L雷帕霉素預(yù)處理細(xì)胞2h后，加入10μg/L TGF-β1處理24h。

1.2.5Hoechst33342染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HTFs接種于6孔板，按上述分組方法處理細(xì)胞，并用PBS將處理過(guò)的細(xì)胞充分洗滌2～3次。將1mL細(xì)胞染色緩沖液、5μL Hoechst 33342染色液、5μL PI染色液依次加入各孔中，輕輕搖勻，然后在4℃冰箱中孵育30min。用PBS溶液洗滌1次，置于熒光顯微鏡下觀察。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞增殖能力CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組、TGF-β1組、TGF-β1+5 K-115組、TGF-β1+10 K-115組、5K-115組、10 K-115組吸光度值分別為0.98±0.04、1.31±0.06、1.20±0.03、1.00±0.08、0.89±0.06、0.91±0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=56.78，P<0.001)。與對(duì)照組相比，TGF-β1組細(xì)胞增殖能力顯著增加(P<0.01)；與TGF-β1組相比，TGF-β1+5 K-115組和TGF-β1+10 K-115組細(xì)胞增殖能力均降低(P<0.01)，見(jiàn)圖1。此外，與對(duì)照組相比，5、10μmol/L K-115均對(duì)細(xì)胞增殖存在一定的抑制作用(P=0.013、0.043)。

圖1 K-115對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HTFs增殖的影響 bP<0.01 vs 對(duì)照組；dP<0.01 vs TGF-β1組。

2.2細(xì)胞遷移能力劃痕24h后，對(duì)照組、TGF-β1組、TGF-β1+5 K-115組、TGF-β1+10 K-115組細(xì)胞遷移距離百分?jǐn)?shù)分別為22.86%±3.05%、4.39%±3.32%、44.56%±4.87%、58.24±4.15%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=110.32，P<0.001)。與對(duì)照組相比，TGF-β1組細(xì)胞遷移能力顯著增加(P<0.01)；與TGF-β1組相比，TGF-β1+5 K-115組和TGF-β1+10 K-115組細(xì)胞遷移能力均降低(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

圖2 K-115對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HTFs遷移的影響。

2.3細(xì)胞自噬情況透射電子顯微鏡觀察顯示，與對(duì)照組相比TGF-β1組細(xì)胞內(nèi)自噬小體的數(shù)量增加，TGF-β1+5 K-115組、TGF-β1+10 K-115組較TGF-β1組細(xì)胞內(nèi)自噬小體數(shù)量進(jìn)一步增加，自噬激動(dòng)劑雷帕霉素(陽(yáng)性對(duì)照組)顯著促進(jìn)了TGF-β1誘導(dǎo)的HTFs自噬，而自噬抑制劑3-MA(陰性對(duì)照組)則阻斷了TGF-β1誘導(dǎo)的HTFs自噬，見(jiàn)圖3。

圖3 K-115對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HTFs自噬的影響 A：對(duì)照組；B：TGF-β1組；C：TGF-β1+5 K-115組；D：TGF-β1+10 K-115組；E：TGF-β1+3-MA組；F：TGF-β1+Rap組。紅色箭頭示自噬小體。

2.4細(xì)胞凋亡情況Hoechst 33342/PI染色結(jié)果顯示，各處理組幾乎均看不到PI陽(yáng)性細(xì)胞，同時(shí)未見(jiàn)明顯的強(qiáng)藍(lán)色熒光，提示各組細(xì)胞凋亡水平無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖4。

圖4 K-115對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HTFs凋亡的影響。

3討論

K-115作為一種Rho蛋白激酶的抑制劑，主要通過(guò)調(diào)控細(xì)胞骨架拉伸小梁網(wǎng)進(jìn)而起到調(diào)控眼壓的作用。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)K-115可以阻斷TGF-β2誘導(dǎo)的人結(jié)膜成纖維細(xì)胞活化及膠原表達(dá)[7]。另有研究證實(shí)局部應(yīng)用Rho蛋白激酶抑制劑AMA0526可以通過(guò)抑制膠原組織在濾過(guò)通道的沉積提高實(shí)驗(yàn)性濾過(guò)手術(shù)的效果[13]。與本研究發(fā)現(xiàn)的K-115可能參與調(diào)控濾過(guò)道瘢痕形成的結(jié)論相似。但是針對(duì)涉及Rho蛋白激酶抑制劑這一類(lèi)藥物調(diào)控GFS術(shù)后瘢痕形成的機(jī)制目前還沒(méi)有定論，有研究證實(shí)Rho蛋白激酶抑制劑Y-27632通過(guò)調(diào)控TGF-β和MAPK通路抑制GFS術(shù)后瘢痕形成[14]，但是細(xì)胞因子系統(tǒng)作用錯(cuò)綜復(fù)雜，是否有其他機(jī)制參與仍需要進(jìn)一步研究。

GFS術(shù)后濾過(guò)道瘢痕形成是影響手術(shù)成功率的主要原因。以往研究顯示，在瘢痕形成進(jìn)程中HTFs起著重要作用，在多種因素的誘導(dǎo)下，HTFs會(huì)被誘導(dǎo)活化，活化后細(xì)胞的增殖及遷移能力增強(qiáng)，進(jìn)而加速傷口愈合，促進(jìn)濾過(guò)道的瘢痕形成[11]。在這些刺激因素中TGF-β是促進(jìn)局部傷口愈合，誘導(dǎo)HTFs活化的重要因子[12]。本研究應(yīng)用TGF-β1誘導(dǎo)HTFs活化，建立濾過(guò)道瘢痕化的細(xì)胞模型，進(jìn)一步觀察K-115對(duì)細(xì)胞增殖及活化的影響。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示K-115可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，同時(shí)劃痕試驗(yàn)提示K-115可以降低TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移，提示K-115可能通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、遷移能力進(jìn)而調(diào)控HTFs的活化增殖能力。

本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1組細(xì)胞內(nèi)自噬小體數(shù)量較對(duì)照組增加，提示在刺激因素TGF-β1的作用下，細(xì)胞通過(guò)增加自身的自噬能力維持細(xì)胞的穩(wěn)定狀態(tài)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)K-115處理組細(xì)胞內(nèi)自噬小體數(shù)量較TGF-β1組進(jìn)一步增多，這與抗代謝藥物雷帕霉素誘導(dǎo)的HTFs內(nèi)自噬小體增多的現(xiàn)象一致，提示K-115可以增強(qiáng)細(xì)胞的自噬能力。自噬是維持自身穩(wěn)定性的生物學(xué)現(xiàn)象，廣泛存在于人體的各個(gè)器官。研究證實(shí)，細(xì)胞的自噬作用在調(diào)控器官纖維化的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，細(xì)胞自噬功能缺陷會(huì)導(dǎo)致局部膠原大量沉積，促進(jìn)瘢痕形成，對(duì)細(xì)胞自噬功能的調(diào)控在肝、肺、腎等器官纖維化性疾病的治療中已經(jīng)顯示出了巨大的潛力[9-11]。自噬在青光眼中的作用也愈來(lái)愈受關(guān)注，雖然目前的研究多集中在小梁網(wǎng)細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[15-18]，但也有部分研究顯示不同藥物可以通過(guò)自噬通路調(diào)控GFS術(shù)后的瘢痕化過(guò)程[19-21]。本研究結(jié)果提示K-115可以增加TGF-β1刺激而誘導(dǎo)的HTFs自噬，這種自噬功能的增強(qiáng)在維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)及抑制細(xì)胞活化方面具有一定的作用，K-115可能參與調(diào)控維持HTFs的穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而抑制HTFs的活化增殖及遷移能力。此外，本研究中Hoechst 33342/PI染色實(shí)驗(yàn)未顯示K-115導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，這和以往抗代謝藥物誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的抗瘢痕機(jī)制不同，為K-115抗瘢痕特性的作用機(jī)制提供了參考，但這種抗瘢痕機(jī)制還有待進(jìn)一步在體實(shí)驗(yàn)的研究證實(shí)。

綜上，本研究結(jié)果證實(shí)K-115具有調(diào)控HTFs活化的能力，提示其具有調(diào)節(jié)GFS相關(guān)結(jié)膜下瘢痕形成的潛在療效，有望成為一種新的抗瘢痕藥物，由于該藥物是一種局部應(yīng)用的降眼壓藥物，如果抗瘢痕效果能夠得到明確，將成為一種更為簡(jiǎn)單便捷的抗瘢痕臨床治療策略。