麻 凱，劉 江，王亞卉，池華博文，項(xiàng)敏泓

作者單位：1(200062)中國(guó)上海市，上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院眼科；2(200082)中國(guó)上海市，上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院眼科

0引言

結(jié)膜松弛癥(conjunctivochalasis，CCH)是臨床常見(jiàn)的眼表疾病，它是由于球結(jié)膜過(guò)度松弛和(或)下瞼緣張力升高，致使松弛的球結(jié)膜堆積在眼球與下瞼緣、內(nèi)眥部、外眥部之間形成皺褶，引起眼表淚液學(xué)微環(huán)境異常，常伴有眼部干澀、異物感、溢淚等不適癥狀的一種年齡相關(guān)性眼病，影響患者的視覺(jué)和生活質(zhì)量[1-3]。目前對(duì)結(jié)膜松弛癥的發(fā)病機(jī)制尚無(wú)明確定論，學(xué)者認(rèn)為結(jié)膜松弛癥主要與結(jié)膜組織中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)兩者之間的失衡[4-5]、彈力纖維降解[6]、細(xì)胞衰老[7-9]等致病因素有關(guān)。成纖維細(xì)胞是疏松結(jié)締組織中的主要細(xì)胞，它不僅合成和分泌多種膠原蛋白和彈性蛋白，生成膠原纖維、網(wǎng)狀纖維和彈性纖維，還能分泌細(xì)胞外基質(zhì)，是結(jié)膜組織中的重要成分之一[10-12]。自 De Falco等[13]報(bào)道體外成功提取人Tenon囊原代成纖維細(xì)胞以來(lái)，關(guān)于CCH的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)入了新的階段。但結(jié)膜成纖維細(xì)胞的原代提取及穩(wěn)定傳代對(duì)于初學(xué)者而言仍較為棘手，失敗率相對(duì)較高，因此有必要建立一種更加完善和高效的培養(yǎng)方法。本研究旨在通過(guò)原代培養(yǎng)、純化及鑒定，觀察不同培養(yǎng)時(shí)期內(nèi)CCH球結(jié)膜成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況及形態(tài)學(xué)變化，明確其生長(zhǎng)周期，以期體外獲得穩(wěn)定、一致的CCH球結(jié)膜成纖維細(xì)胞，從而為CCH發(fā)病機(jī)制的研究及尋求切實(shí)有效的治療方法搭建平臺(tái)。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本收集結(jié)膜組織取自2021-03/06于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院眼科確診為CCH Ⅲ級(jí)[14]且符合手術(shù)指征的患者6例10眼，年齡65～83(平均74.35±1.57)歲，其中2例3眼合并糖尿病病史。納入患者均行詳細(xì)的眼部檢查和手術(shù)評(píng)估，排除青光眼、瞼緣炎、角結(jié)膜疾病(結(jié)膜炎、角膜炎、角結(jié)膜腫瘤等)、淚囊炎、淚道阻塞等其他眼部疾病，由同一術(shù)者采用經(jīng)典的松弛結(jié)膜新月形切除術(shù)進(jìn)行手術(shù)[15]。本研究已通過(guò)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.PTEC-A-2021-14-1)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.1.2主要試劑及儀器DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)；青霉素-鏈霉素溶液、0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體(ab137332)(英國(guó)Abcom公司)；4%多聚甲醛固定液、免疫染色通透液(Triton X-100)、抗熒光淬滅封片液、山羊血清、Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)二抗(A0208)(上海碧云天生物科技有限公司)。CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)；超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰公司)；倒置光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀公司)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Bmg Labtech公司)；熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司)；高精確電子分析天平(德國(guó)Sartorious公司)。

1.2方法

1.2.1原代細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)菌條件下取手術(shù)切除的松弛結(jié)膜組織，生理鹽水沖洗祛除血污，立即放入裝有完全培養(yǎng)基的1.5mL EP管中，低溫保存，采用組織塊貼壁法行原代球結(jié)膜成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)。超凈工作臺(tái)中用眼科顯微剪修剪結(jié)膜組織約1mm×1mm大小，移入25cm2培養(yǎng)瓶中，將結(jié)膜組織平鋪于培養(yǎng)瓶底，待其微微干燥時(shí)，貼壁緩緩加入5mL含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素、1%生長(zhǎng)因子的DMEM完全培養(yǎng)液，勿使組織浮起。將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每2～3d換液1次，倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.2細(xì)胞傳代觀察CCH球結(jié)膜成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)特性，組織貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)到第8d時(shí)行消化、傳代。超凈工作臺(tái)中取出培養(yǎng)瓶，棄去培養(yǎng)基，加入1mL PBS洗滌，輕輕晃動(dòng)，棄去PBS，再加入1mL 0.25%胰蛋白酶(EDTA)后靜置2min，倒置顯微鏡下觀察。當(dāng)細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)回縮，細(xì)胞變圓呈球形，細(xì)胞連接松散或有成片的細(xì)胞浮起時(shí)，表示消化時(shí)間適合，立即加入1mL完全培養(yǎng)基終止消化。離心管離心，見(jiàn)其底部乳白色細(xì)胞團(tuán)塊，棄去上清液，加入1mL完全培養(yǎng)基，輕輕吹打制成均勻的細(xì)胞懸液，接種于6孔板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中。每2～3d換液1次，待細(xì)胞鋪滿瓶底后再用同樣方法消化傳代。

1.2.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察倒置顯微鏡下定期觀察，記錄CCH結(jié)膜組織貼壁后第1、2、3、5、7、9、12、15d細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)及形態(tài)變化，注意防止污染，控制拍照觀察時(shí)間，以防離開(kāi)培養(yǎng)箱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)進(jìn)而影響細(xì)胞生長(zhǎng)。

1.2.4細(xì)胞鑒定取第4～5代生長(zhǎng)良好的CCH結(jié)膜成纖維細(xì)胞行胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞懸液，常規(guī)鋪板培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁時(shí)行免疫熒光染色。吸出原培養(yǎng)液，加入PBS溶液輕輕晃動(dòng)，洗3遍，每次3min，室溫下加入4%多聚甲醛固定20min，PBS溶液洗滌，0.5% Triton X-100溶液破膜30min，5%山羊血清封閉，加入Vimentin單克隆抗體(1∶500)，4℃冰箱孵育過(guò)夜；次日PBS洗滌后，加入Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)二抗(1∶500)室溫避光孵育60min，PBS洗滌3次，DAPI染核5min，甘油明膠進(jìn)行封片，熒光顯微鏡下拍照。

2結(jié)果

2.1CCH成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察第1d，CCH結(jié)膜組織周?chē)屑?xì)胞逸出，表現(xiàn)為膠狀樣逸出帶，細(xì)胞較小，緊密排列，圓形或橢圓形，呈鋪路石樣分布，細(xì)胞輪廓不清晰；第2d，組織周?chē)z狀樣細(xì)胞逸出帶較前明顯擴(kuò)大，細(xì)胞融合成片并彼此連接成網(wǎng)狀，大小不一，排列不規(guī)則；第3d，細(xì)胞逸出帶較前進(jìn)一步擴(kuò)大，組織邊緣細(xì)胞生長(zhǎng)較密集，細(xì)胞平行排列呈束帶狀、放射狀，周?chē)?xì)胞分布相對(duì)疏松，部分細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或多角形，可見(jiàn)偽足形成并向外逐漸伸展；第5d，細(xì)胞輪廓逐漸清晰，可見(jiàn)卵圓形細(xì)胞核，細(xì)胞核邊界清楚，細(xì)胞從組織周?chē)蕧u狀生長(zhǎng)爬出，島中心的細(xì)胞排列較緊密，多呈編織狀、魚(yú)群狀排列；周?chē)?xì)胞排列相對(duì)疏松，相互交織成網(wǎng)狀，有較大的細(xì)胞間隙，長(zhǎng)梭形細(xì)胞形態(tài)逐漸明顯；第7d，結(jié)膜組織透亮度高，細(xì)胞分布均勻，數(shù)目較多，胞體大小適中，細(xì)胞核明顯甚至雙核，細(xì)胞質(zhì)清晰無(wú)空泡，細(xì)胞輪廓清晰、飽滿，形態(tài)規(guī)則；第9d，組織塊顏色加深，但未見(jiàn)黑化，細(xì)胞形態(tài)較模糊，細(xì)胞表面可見(jiàn)混濁、顆粒狀及深黃色的碎屑，其為細(xì)胞的分泌物或衰老的細(xì)胞器；第12d，組織塊邊緣部分黑化，組織周?chē)梢?jiàn)折光性較強(qiáng)的細(xì)胞碎片，細(xì)胞排列相對(duì)疏松，體積大而扁平，形狀不規(guī)則，細(xì)胞漿內(nèi)可見(jiàn)空泡與顆粒，細(xì)胞透亮度降低；第15d，組織塊完全黑化，細(xì)胞老化，邊界模糊，細(xì)胞扁平呈鋪展?fàn)钌L(zhǎng)，細(xì)胞漿內(nèi)有大量顆粒狀物質(zhì)和小泡產(chǎn)生，部分細(xì)胞開(kāi)始從培養(yǎng)瓶底脫落，細(xì)胞之間出現(xiàn)較大空隙(圖1)。

圖1 不同時(shí)期CCH球結(jié)膜成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 A、B：第1d，組織周?chē)屑?xì)胞爬出，細(xì)胞較小，緊密排列，呈鋪路石樣分布；C、D：第2d，細(xì)胞較前明顯增多，細(xì)胞融合成片并彼此連接成網(wǎng)狀；E、F：第3d，細(xì)胞較前進(jìn)一步增多，組織邊緣細(xì)胞生長(zhǎng)密集，周邊相對(duì)稀疏；G、H：第5d，細(xì)胞輪廓逐漸清晰，邊緣細(xì)胞有較大的間隙，長(zhǎng)梭形細(xì)胞形態(tài)逐漸明顯；I、J：第7d，細(xì)胞分布均勻，數(shù)目較多，胞體大小適中，輪廓清晰，形態(tài)規(guī)則；K、L：第9d，組織塊顏色加深，細(xì)胞表面見(jiàn)混濁、顆粒狀及深黃色的碎屑堆積；M、N：第12d，組織塊邊緣部分黑化，胞體大而扁平，細(xì)胞漿內(nèi)可見(jiàn)空泡與顆粒；O、P：第15d，組織塊完全黑化，部分細(xì)胞從培養(yǎng)瓶底脫落，細(xì)胞間出現(xiàn)較大空隙。

2.2傳代后CCH球結(jié)膜成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察傳代后細(xì)胞呈細(xì)長(zhǎng)梭形、扁平星狀或多突的紡錘形，中間稍寬大，兩頭相對(duì)細(xì)小，有卵圓形的細(xì)胞核，伴向外伸出2～3個(gè)長(zhǎng)短不同的細(xì)長(zhǎng)突起，細(xì)胞密度均勻，排列規(guī)則，大小基本一致(圖2)。

球結(jié)膜成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)的主要方法有組織塊貼壁法和酶消化法[16-17]。酶消化法多選擇胰蛋白酶或胰蛋圖2 傳代后CCH球結(jié)膜成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 A：第4代CCH球結(jié)膜成纖維細(xì)胞；B：第5代CCH球結(jié)膜成纖維細(xì)胞。

2.3CCH球結(jié)膜成纖維細(xì)胞免疫熒光鑒定對(duì)球結(jié)膜成纖維細(xì)胞標(biāo)記性蛋白Vimentin進(jìn)行免疫熒光染色鑒定，結(jié)果顯示球結(jié)膜成纖維細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)可見(jiàn)綠色熒光，呈陽(yáng)性反應(yīng)，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光(圖3)。

圖3 CCH球結(jié)膜成纖維細(xì)胞標(biāo)記性蛋白免疫熒光染色 A：Vimentin免疫熒光染色；B：細(xì)胞核DAPI染色；C：Merged。

2.4原代培養(yǎng)失敗的CCH球結(jié)膜成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)部分原代培養(yǎng)的結(jié)膜組織貼壁良好但未見(jiàn)細(xì)胞從組織周?chē)莱觯x取原代培養(yǎng)失敗的不同時(shí)間點(diǎn)觀察組織形態(tài)學(xué)變化見(jiàn)圖4。

圖4 CCH球結(jié)膜成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)失敗的形態(tài)學(xué)觀察 A：第1d，組織貼壁，組織周?chē)匆?jiàn)細(xì)胞爬出；B：第3d，組織形態(tài)較前未見(jiàn)明顯變化，周?chē)匆?jiàn)細(xì)胞爬出；C：第7d，組織呈棕黃色，組織周?chē)匆?jiàn)細(xì)胞爬出；D：第15d，組織塊完全黑化，組織失去活性。

3討論

白酶與膠原酶聯(lián)合消化，但酶處理組織時(shí)間和酶濃度難以掌控，消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或酶濃度過(guò)高均可導(dǎo)致細(xì)胞活性下降，進(jìn)而影響細(xì)胞的爬出與貼壁，且酶消化解離細(xì)胞的過(guò)程中容易導(dǎo)致細(xì)胞壁破損，使原代細(xì)胞狀態(tài)受到影響，對(duì)細(xì)胞生物學(xué)特性損傷較大，不利于細(xì)胞的傳代與后續(xù)實(shí)驗(yàn)[18]。而組織塊貼壁法簡(jiǎn)單易行，只需1～2mm2大小組織即可獲取大量穩(wěn)定的成纖維原代細(xì)胞，同時(shí)又可避免消化酶對(duì)細(xì)胞的化學(xué)損傷，培養(yǎng)的細(xì)胞均質(zhì)性與穩(wěn)定性較好，也避免由于酶的長(zhǎng)時(shí)間作用造成細(xì)胞損傷或遺傳特性改變。通過(guò)差速貼壁消化祛除結(jié)膜成纖維細(xì)胞中混合的結(jié)膜上皮細(xì)胞，傳至3代及以上即可得到純度相對(duì)較高且穩(wěn)定的結(jié)膜成纖維細(xì)胞系[19-20]。既往研究主要確定了合適的細(xì)胞培養(yǎng)基及細(xì)胞鑒定方法，但對(duì)于原代成纖維細(xì)胞的傳代時(shí)間及不同時(shí)期的形態(tài)學(xué)觀察尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)過(guò)程中，因細(xì)胞增殖生長(zhǎng)達(dá)到一定密度后，細(xì)胞之間會(huì)出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象，細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂速度會(huì)逐漸減慢甚至停止，如不及時(shí)進(jìn)行消化和傳代，細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)衰老甚至死亡。原代細(xì)胞消化傳代的頻率和時(shí)間間隔與接種細(xì)胞的種類、細(xì)胞生物學(xué)特性以及培養(yǎng)基性質(zhì)等多種因素有關(guān)[21-22]。本研究通過(guò)組織塊貼壁法對(duì)CCH結(jié)膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)CCH球結(jié)膜組織接種于培養(yǎng)瓶24h后即可見(jiàn)組織周?chē)屑?xì)胞逸出；第2～7d為球結(jié)膜成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，此時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞輪廓逐漸清晰，分布逐漸均勻，數(shù)目逐漸增多，中心生長(zhǎng)的細(xì)胞排列相對(duì)緊密，呈放射狀、柵欄狀及魚(yú)群樣生長(zhǎng)；周?chē)?xì)胞排列較疏松，細(xì)胞呈紡錘形、扁平狀分布；第9～15d為細(xì)胞生長(zhǎng)的平臺(tái)期，細(xì)胞增長(zhǎng)緩慢，排列疏松，體積變大，形狀扁平，呈圓盤(pán)狀分布，部分細(xì)胞從培養(yǎng)瓶底部脫落，細(xì)胞之間出現(xiàn)較大空隙，且結(jié)膜組織透亮度逐漸降低，顏色加深，至組織塊黑化。與既往皮膚及肝臟成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)特性的研究相一致，符合成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)規(guī)律[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，組織貼壁后細(xì)胞平均生長(zhǎng)時(shí)間為第8d時(shí)行消化傳代，傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)速度較快，形態(tài)規(guī)則，呈典型細(xì)長(zhǎng)梭形，并伴有2～3個(gè)長(zhǎng)短不一的突起，與目前所公認(rèn)的成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)相符[25]。因此，根據(jù)上述球結(jié)膜成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)周期及消化傳代后的生長(zhǎng)狀況，原代細(xì)胞培養(yǎng)至第8d時(shí)行消化傳代，可獲得最佳的細(xì)胞狀態(tài)，且細(xì)胞數(shù)目相對(duì)較多，細(xì)胞的生物學(xué)特性能較穩(wěn)定地傳遞下來(lái)，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞數(shù)量要求。

Vimentin是成纖維細(xì)胞特異性高表達(dá)的一種蛋白，廣泛參與組織與細(xì)胞的修復(fù)和再生，包括細(xì)胞增殖、遷移、細(xì)胞外基質(zhì)重塑及免疫反應(yīng)等[26]。因此，Vimentin可作為成纖維細(xì)胞的一種標(biāo)志性蛋白，并通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行成纖維細(xì)胞的鑒定[27-28]。Budel等[29]通過(guò)細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)成纖維細(xì)胞標(biāo)志性蛋白Vimentin染色呈綠色，DAPI染核呈藍(lán)色，證實(shí)為成纖維細(xì)胞。本研究通過(guò)免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)CCH球結(jié)膜成纖維細(xì)胞標(biāo)志性蛋白Vimentin染色結(jié)果為陽(yáng)性，且符合成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，證明本研究通過(guò)組織塊貼壁法所提的原代細(xì)胞為球結(jié)膜成纖維細(xì)胞。

然而，CCH球結(jié)膜成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)過(guò)程并非一帆風(fēng)順，實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)組織塊貼壁良好但始終未見(jiàn)細(xì)胞爬出。分析其失敗的原因可能有以下幾點(diǎn)：(1)患者年齡相對(duì)較大且合并多種基礎(chǔ)疾病，如糖尿病等，結(jié)膜組織活性相對(duì)較低；(2)取材后結(jié)膜組織塊未及時(shí)放入含培養(yǎng)基的EP管中低溫保存，暴露空氣中時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使組織失去活性；(3)平鋪組織操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，組織過(guò)于干燥，脫水而失去活性；(4)實(shí)驗(yàn)操作不規(guī)范，結(jié)膜組織取材后未及時(shí)清洗致組織污染，影響細(xì)胞爬出；(5)未及時(shí)更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的有害代謝性物質(zhì)堆積阻礙細(xì)胞爬出。 成纖維細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中經(jīng)歷多次失敗，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)得出：(1)取材盡量選取相對(duì)年輕且無(wú)基礎(chǔ)代謝性疾病(如糖尿病等)的患者；(2)取材后，無(wú)菌生理鹽水沖洗結(jié)膜組織以祛除血污，并立即放入含完全培養(yǎng)基的EP管中冷藏，否則組織活性降低影響成纖維細(xì)胞的爬出；(3)超凈工作臺(tái)中盡快完成結(jié)膜組織貼壁，勿使組織過(guò)于干燥，貼壁后緩緩加入完全培養(yǎng)基，以覆蓋組織為宜；(4) 貼壁后12h內(nèi)盡量不要移動(dòng)培養(yǎng)瓶，以免晃動(dòng)引起組織塊漂浮，24h后可取出觀察并拍照記錄。如此操作，即可獲得均一、穩(wěn)定的原代球結(jié)膜成纖維細(xì)胞。

綜上，本研究采用組織塊貼壁法分離提取原代CCH球結(jié)膜成纖維細(xì)胞，通過(guò)觀察成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)周期發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞爬出平均時(shí)間為第8d時(shí)行消化傳代最優(yōu)，并通過(guò)差速貼壁法純化成纖維細(xì)胞可獲得穩(wěn)定、一致的CCH球結(jié)膜成纖維細(xì)胞，為CCH發(fā)病機(jī)制的研究及尋找切實(shí)有效的治療方法創(chuàng)造了良好的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。