鄭雯， 鐘亞丹， 王炫， 劉慧婷， 楊斌， 劉軍

1.南方醫(yī)科大學皮膚病醫(yī)院，廣東 廣州 510091；2.佛山市第一人民醫(yī)院，廣東 佛山 528010

人胚胎干細胞(human embryonic stem cell，hESCs)是早期胚胎或原始性腺中分離出來的一類細胞，具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和多向分化的特性，能被誘導分化成機體內幾乎所有的細胞類型[1-2]?；讓咏琴|形成細胞(basal keratinocyte)位于表皮最底層細胞，可通過不斷自我更新，分化為角質層的無細胞核鱗狀細胞，維持表皮的屏障作用[3-4]。目前認為，基底層角質形成細胞屬于表皮干細胞的一類，具有增殖與分化的潛能，對維持表皮的穩(wěn)態(tài)具有重要作用[5]?；讓咏琴|形成細胞表達角蛋白14(keratin 14，K14)和角蛋白5(keratin 5，K5)，對維持細胞骨架結構的穩(wěn)定發(fā)揮重要的作用，K5和K14均可作為基底層角質形成細胞的標志物[6-8]。但現(xiàn)有的技術方法難以將基底層角質形成細胞分離培養(yǎng)，且尚無利用標志物成功分離培養(yǎng)基底層角質形成細胞技術的相關報道，其研究和應用都受到限制。

CRISPR/Cas系統(tǒng)是在原核生物中存在的一種天然免疫系統(tǒng)。原核生物在遭到病毒入侵后，能夠把病毒DNA的一小段序列提取并存儲到自身基因組上的特定區(qū)域。當病毒再次入侵時，原核生物能夠根據(jù)存儲的DNA片段對病毒進行識別，對病毒的基因組DNA進行切割，進而消滅病毒[9-10]。根據(jù)CRISPR/Cas系統(tǒng)的生物學特性優(yōu)化的CRISPR/Cas9技術可實現(xiàn)對基因組的精確編輯，針對目的基因實現(xiàn)點突變、基因敲除或敲入等操作，具有高效、便捷、低脫靶的優(yōu)點[11-13]。因此，本研究利用CRISPR/Cas9技術構建一種keratin 5-IRES-eGFP 敲入的hESCs細胞系，并誘導hESCs分化為角質形成細胞，實現(xiàn)對keratin 5陽性的基底層角質形成細胞的標記，為后續(xù)分選獲得keratin 5陽性的基底層角質形成細胞等研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒、菌株及細胞株

CRISPR/Cas9質粒 pSpCas9n(BB)-2A-GFP(PX461)購自Addgene公司，HEK-293T及hESCs細胞由本實驗室保存。感受態(tài)菌購自北京全式金公司。質粒圖譜可于http://www.addgene.org網(wǎng)站查詢。

1.2 實驗試劑

DNA連接酶(T4 DNA ligase、10×T4 Ligation Buffer)購自NEB公司；質粒保護的核酸外切酶(Plasmid Safe exonuclease、10×Plasmid Safe Buffer)購自 Epicentre公司；膠回收試劑盒QIAquick Gel Extraction Kit、質粒小提試劑盒QIAGEN Plasmid Mini Kit、PCR純化試劑盒QIAquick PCR Purification Kit購自 QIAGEN公司；Lipo2000轉染試劑購自Invitrogen公司；快速限制性內切酶(Fast Digest Bbs I、FastAP、10× TM Fast Digest Buffer)、基因組DNA純化試劑盒(Gene JET Genomic DNA Purification Kit)。

1.3 實驗方法

1.3.1 sgRNA質粒與打靶Donor載體的構建 UCSC Genome Browser網(wǎng)站(http://genome.ucsc.edu/)中檢索人源keratin 5的基因序列，找出終止密碼子，參考張鋒實驗室團隊的sgRNA預測網(wǎng)站(http: ∥crispr.mit.edu/)，針對目的基因keratin 5終止密碼子下游設計并合成相應的sgRNA序列，將sgRNA連入pU6-EFsgRNA2.1scaffold載體(本實驗室保存)，篩選出正確的克隆，得到sgRNA質粒。針對目的基因keratin 5斷裂位點設計上游同源臂keratin 5 Arm 1及下游同源臂keratin 5 Arm 2，將線性的Donor質粒載體與keratin 5 Arm 1及keratin 5 Arm 2連接，再將本實驗室保存的IRES-eGFP連至帶有同源臂的Donor質粒中，得到打靶Donor載體。

針對目的基因keratin 5終止密碼子下游設計并合成相應的sgRNA序列，將sgRNA連入pU6-EFsgRNA2.1scaffold載體(本實驗室保存)，篩選出正確的克隆，得到sgRNA質粒。針對目的基因keratin 5斷裂位點設計上游同源臂keratin 5 Arm 1及下游同源臂keratin 5 Arm 2，將線性的Donor質粒載體與keratin 5 Arm 1及keratin 5 Arm 2連接，再將本實驗室保存的IRES-eGFP連至帶有同源臂的Donor質粒中，得到打靶Donor載體。

1.3.2 293T細胞培養(yǎng)、轉染及基因組DNA的提取 以每孔5×105個細胞接種至6孔板中，使用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)進行培養(yǎng)。細胞生長達到30%～40%時加入PEI轉染試劑與上述構建的sgRNA質粒，并設置一個無轉染sgRNA質粒的293T細胞作為陰性對照。細胞轉染后48 h收取HEK293T細胞，用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒按照說明書操作步驟提取細胞基因組DNA。

1.3.3 sgRNA切割效率檢測 針對sgRNA切割點上下游100～200 bp處設計PCR引物，進行PCR擴增，反應條件為：96 ℃ 30 s;94 ℃，5 s,60 ℃，30 s,72 ℃，10 s，40個循環(huán);72 ℃ 10 min，16 ℃放置。配置10%的聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)，具體配方為：3%聚丙烯酰胺 3 mL；1%AP 55 μL；10×TAE 750 μL；TEMED 5 μL；水 3.69 mL。進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，內外槽加入1×TAE，電泳條件為12 mA，120 min；1×gelred液體浸泡凝膠5 min，自來水浸泡2 min后凝膠成像儀顯影。

1.3.4 電轉方法 將sgRNA質粒，cas9質粒(購自Addgene，編號：#44719)，打靶Donor載體共同電轉至hESCs細胞，其中sgRNA、cas9質粒、打靶Donor載體電轉的數(shù)量比例為1∶4∶10。所用電轉儀為ECM 830型細胞電轉儀，電轉條件為300 mA，4 ms。

1.3.5 篩選keratin 5-IRES-eGFP敲入的hESCs細胞系 電轉后繼續(xù)培養(yǎng)細胞，待細胞系穩(wěn)定，用1 μg/mL的嘌呤霉素篩選2 d，通過有限稀釋法將80個左右的克隆鋪于96孔板中，培養(yǎng)半個月后，挑取單克隆細胞至24孔板進行培養(yǎng)，收取細胞提取基因組DNA，隨后進行PCR測序初步篩出陽性單克隆細胞。將初步鑒定為陽性單克隆細胞培養(yǎng)至穩(wěn)定后，通過電轉法轉入本實驗室保存的pCMV-cre的質粒，待細胞系穩(wěn)定后，通過有限稀釋法將80個左右的克隆鋪于96孔板中，培養(yǎng)半個月后，將挑取的單克隆細胞至24孔板進行培養(yǎng)后，收取細胞提取基因組DNA，隨后進行PCR測序以及Sanger測序，篩出陽性克隆。

1.3.6 將hESCs誘導分化成為角質形成細胞 在分化前3 d，將篩選的keratin 5-IRES-eGFP細胞系鋪在Matrigel包被的6孔板中培養(yǎng)，其中加入的培養(yǎng)液為ES培養(yǎng)基。在第0天時，將hESCs細胞移至Ⅰ型膠原蛋白包被的12孔板上培養(yǎng)，用含有1 μM RA和25 ng/mL BMP4的DMEM/F12的培養(yǎng)基維持培養(yǎng)；第8～15天用含有1 μM RA和25 ng/mL BMP4的KSFM培養(yǎng)基培養(yǎng)；第15天后，采用含25 ng/mL BMP4的KSFM的培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)至第30天后檢測。

2 結果

2.1 成功構建sgRNA質粒

將sgRNA連入pU6-EFsgRNA2.1scaffold載體后挑取單克隆，通過Sanger測序驗證，篩選出正確克隆，得到sgRNA質粒(圖1A)。sgRNA質粒制備完成后轉染293T細胞，通過DNA-PAGE凝膠電泳驗證，選取切割效率最高的sgRNA進行后續(xù)實驗。

2.2 成功構建打靶Donor質粒

為獲取針對keratin 5目的基因的打靶Donor載體，通過PCR擴增獲得攜帶酶切位點的上、下游同源臂keratin 5 Arm 1和keratin 5 Arm 2。首先將上、下游同源臂克隆至線性化Donor載體中，再將IRES-eGFP連至帶有同源臂的Donor質粒中并通過Sanger測序驗證(圖1B)。篩選出正確的打靶Donor載體，將其命名為keratin 5-IRES-eGFP-LoxP-neo(圖1C)。

圖1 sgRNA質粒圖譜(1A)、打靶Donor載體keratin 5-IRES-eGFP-LoxP-neo的測序結果(1B)及其圖譜(1C)

2.3 成功挑選keratin 5-IRES-eGFP敲入的單克隆hESCs細胞株

PCR鑒定電泳結果顯示單克隆細胞系keratin 5-IRES-eGFP#3為純合敲入的hESCs細胞系，表明成功將IRES-eGFP-lox2272-CAG-NeoR-lox2272片段整合至keratin 5的兩條等位基因終止密碼子之后(圖2A)。獲得初步篩選的陽性細胞克隆keratin 5-IRES-eGFP#3后電轉表達Cre蛋白的質粒pCMV-cre，刪除細胞克隆中除IRES-eGFP以外其它多余的Donor質粒元件。再次挑取單克隆進行PCR鑒定，通過Cre-band條帶初步鑒定出刪除了多余的質粒元件的細胞克隆(圖2B)，將其命名為keratin 5-IRES-eGFP#3-16。對PCR產(chǎn)物進行Sanger測序，與打靶Donor載體進行序列對比，可證實該細胞克隆中其它多余元件確已成功刪除(圖2C)。

圖2 純合敲入IRES-eGFP的單克隆細胞系keratin 5-IRES-eGFP#3 的PCR鑒定結果(2A)、成功刪除除IRES-eGFP以外其它多余的質粒元件的單克隆細胞系keratin 5-IRES-eGFP#3-16的PCR鑒定結果(2B)及Sanger測序結果(2C)

2.4 將hESCs誘導成為角質形成細胞

為誘導keratin 5-IRES-eGFP敲入的hESCs細胞系分化為基底層角質形成細胞，在不同時間點加入多種細胞因子，進行為期30 d的誘導分化培養(yǎng)(圖3A)。分化培養(yǎng)30 d后，在白光視野下觀察該分化獲得的角質形成細胞系ES-KC的細胞形態(tài)，可見其與角質形成細胞系HaCaT在形態(tài)上一致(圖3B)。通過免疫熒光染色鑒定，分化獲得的ES-KC細胞系穩(wěn)定表達GFP與keratin 5，表明可將keratin 5-IRES-eGFP敲入的hESCs細胞系誘導分化為表達綠色熒光蛋白的基底層角質形成細胞(圖3C)。

圖3 keratin 5-IRES-eGFP敲入的hESCs細胞系的分化培養(yǎng)方案(3A)、角質形成細胞系HaCaT和分化獲得的角質形成細胞系ES-KC的白光視野圖(3B)及ES-KC的免疫熒光圖(3C)

3 討論

hESCs是經(jīng)體外分離、培養(yǎng)形成的一種原始多能干細胞，具有分化形成各種組織細胞的潛能，hESCs可經(jīng)誘導分化為基底層角質形成細胞[14-15]。角蛋白14和角蛋白5可作為基底層角質形成細胞的標志物，可以利用角蛋白14和角蛋白5實現(xiàn)對角質形成細胞的標記，但目前對基底層角質形成細胞分離培養(yǎng)的研究及應用仍有一定限制[16-18]。本研究試圖利用基底層角質形成細胞的標志物角蛋白5完成對角質形成細胞的標記。首先通過CRISPR/Cas9技術靶向目的基因keratin 5對hESCs細胞系基因組進行精確編輯，將綠色熒光蛋白報告基因整合至keratin 5下游，制備出keratin 5-IRES-eGFP敲入的hESCs細胞系keratin 5-IRES-eGFP#3-16。在不同時間點加入多種細胞因子培養(yǎng)該細胞系，通過為期30 d的分化培養(yǎng)將hESCs細胞誘導分化為帶有綠色熒光蛋白的基底層角質形成細胞，實現(xiàn)了對keratin 5陽性的人表皮基底層角質形成細胞的標記。

綜上所述，目前研究尚缺少對基底層角質形成細胞分離培養(yǎng)的細胞模型，本研究建立了keratin 5-IRES-eGFP#3-16細胞系及分化培養(yǎng)方案，可篩選出keratin 5 陽性的基底層角質形成細胞，后續(xù)實驗中可以利用細胞流式技術將其分選出來，從而為臨床上表皮基底層角質形成細胞異常的皮膚病研究提供細胞模型，用于疾病的機制研究。