劉 琴，李傳明，韓光杰，徐 彬，黃立鑫，陸玉榮，夏 楊，徐 健*

（1. 江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/國家農(nóng)業(yè)微生物揚州觀測實驗站，揚州 225007；2. 揚州綠源生物化工有限公司，揚州 225008）

稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis是為害水稻的重要遷飛性害蟲。由于耕作制度調(diào)整、品種更替及氣候環(huán)境改變等影響，稻縱卷葉螟的發(fā)生數(shù)量和為害程度逐年加重，給水稻生產(chǎn)造成嚴重的損失[1]。長期以來稻縱卷葉螟的防控主要依賴化學(xué)農(nóng)藥[2]，但大量的化學(xué)農(nóng)藥使用并未有效控制害蟲為害，同時由于殺蟲劑的有效劑量隨時間及環(huán)境的影響而逐漸降低[3]，導(dǎo)致接觸低于死亡劑量化學(xué)農(nóng)藥的個體產(chǎn)生亞致死作用[4]。稻縱卷葉螟顆粒體病毒（Cnaphalocrocis medinalis gralulovirus，CnmeGV）是感染稻縱卷葉螟的專性桿狀病毒（baculovirus），對稻縱卷葉螟幼蟲具有較強感染毒力[5]，田間應(yīng)用CnmeGV可以顯著抑制害蟲種群增長，子代稻縱卷葉螟種群增長趨勢指數(shù)（I）從20.03下降至6.30，作為防治稻縱卷葉螟的生物因子，具有重要應(yīng)用價值[6]。目前有關(guān)桿狀病毒亞致死作用的研究較少，其作用機制也不清楚。針對化學(xué)農(nóng)藥開展的亞致死作用的研究表明，殺蟲劑的亞致死效應(yīng)作為一種普遍現(xiàn)象廣泛存在于農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中[7]。亞致死作用可能通過誘導(dǎo)害蟲生理生化變化而導(dǎo)致害蟲對農(nóng)藥產(chǎn)生抗藥性[8]，以及具有刺激害蟲生殖、引發(fā)害蟲再猖獗為害的效應(yīng)[9]。不同于化學(xué)殺蟲劑，桿狀病毒的感染是病毒與宿主交互作用的動態(tài)過程，昆蟲利用其保護機制降低病毒對自身的影響[10,11]，病毒則通過干擾和克服宿主免疫響應(yīng)促進感染[12]。桿狀病毒感染宿主并不總是導(dǎo)致昆蟲產(chǎn)生系統(tǒng)感染，部分蟲體接觸低劑量的桿狀病毒后，害蟲體內(nèi)帶毒但并不表現(xiàn)出感病癥狀且繼續(xù)存活并完成生活史[13,14]。CnmeGV低劑量處理稻縱卷葉螟幼蟲感染死亡率顯著降低，但正常存活的幼蟲蟲體組織內(nèi)普遍檢測到病毒的存在，病毒在害蟲種群中能形成持續(xù)感染[15]。這種在低于死亡劑量下的持續(xù)感染可能對存活害蟲生長發(fā)育、生理代謝及子代種群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生潛在影響。本研究基于CnmeGV對稻縱卷葉螟的持續(xù)感染作用，通過亞致死劑量處理害蟲，分析 CnmeGV對稻縱卷葉螟形成的亞致死效應(yīng)，研明桿狀病毒CnmeGV亞致死作用對害蟲生長發(fā)育、繁殖力的影響，分析其作用機制，為應(yīng)用CnmeGV防治稻縱卷葉螟為害提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 稻縱卷葉螟的飼養(yǎng)

稻縱卷葉螟成蟲采自江蘇省揚州市郊稻田，按♀:♂＝1:1配對放入V＝125 mL的塑料水杯中交配產(chǎn)卵。室內(nèi)繁殖參考Xu等[16]方法制備人工飼料，在（25.0±0.5）℃、相對濕度80%、光照度2000 lx的生化培養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)。飼養(yǎng)繁殖多代后，挑選健康、蟲體大小一致的2齡或3齡幼蟲供試。

1.2 CnmeGV增殖和亞致死感染

CnmeGV原始包涵體（occlusion body，OB）病毒為實驗室保存。選擇2齡中期稻縱卷葉螟幼蟲預(yù)饑6 h，接種于均勻混合1×105OB/g病毒的人工飼料上飼養(yǎng)2 d，更換新鮮人工飼料飼養(yǎng)至5齡，收集感病癥狀明顯的蟲尸[5]，研磨、勻漿、過濾后，經(jīng)差速離心（7727 g離心10 min，482 g離心30 s）獲得純化的CnmeGV，以無菌水稀釋至1×1010OB/mL后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)預(yù)備試驗結(jié)果，在人工飼料中均勻混入105OB/g的CnmeGV作為亞致死劑量（死亡率約20%）口服感染3 齡幼蟲，2 d后更換未接病毒的飼料正常飼養(yǎng)，10 d后每重復(fù)中隨機挑取8頭幼蟲用以檢測病毒感染率、消化酶和解毒酶活性，其余部分繼續(xù)飼養(yǎng)至子代產(chǎn)卵孵化。另以未接病毒的人工飼料飼養(yǎng)同齡幼蟲為對照，每處理重復(fù)3次，每重復(fù)試蟲80頭。

1.3 稻縱卷葉螟生長發(fā)育與產(chǎn)卵

逐日檢查記錄感染病毒幼蟲死亡數(shù)（不能正?；嫉睦鲜煊紫x視為死亡）、化蛹數(shù)及蛹重，繪制存活曲線，計算幼蟲校正累計死亡率和發(fā)育歷期。蛹羽化后記錄羽化數(shù)、性比，并按照♀:♂＝1:1配對放入塑料杯中交配產(chǎn)卵，觀察記錄產(chǎn)卵數(shù)和孵化數(shù)，計算單雌產(chǎn)卵量及孵化率。

1.4 CnmeGV持續(xù)感染的檢測

采用巢式PCR 方法檢測CnmeGV亞致死處理稻縱卷葉螟的帶毒率[15]。取食CnmeGV 10 d的幼蟲體表經(jīng)10%甲醛消毒10 min，單頭液氮研磨、700 μL裂解液（0.1 mol/L Na2CO3，0.1 mol/L NaCl，0.008 mol/L EDTA，pH 10.7）37 ℃裂解10 min，加入7 μL蛋白酶K和1 μL Rnase酶55 ℃水浴30 min，酚氯仿抽提法提取 DNA。先用外側(cè)引物 Cm-gran 1（F：TGATGCCGAGTATGAACCG；R：TTCCTCAACCTCTCCCGTA G）進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物稀釋100倍為模板，再用內(nèi)側(cè)引物Cm-gran 2（F：CGCATCACTCTGTTCAAGG；R：ACGAGAGGACGGTAGAAGTAG）擴增CnmeGV的granulin基因標記片段，1%瓊脂糖電泳檢測。

1.5 稻縱卷葉螟消化酶和解毒酶活性測定

消化酶主要檢測蟲體中腸蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性。飼養(yǎng)稻縱卷葉螟4齡幼蟲在0～4 ℃下迅速解剖，截取中腸及其內(nèi)含物，每處理解剖幼蟲8 頭，重復(fù)3次。以0.15 mol/L NaCl溶液在冰浴中勻漿，214 g、4 ℃離心15 min，取上清液作為測試用酶液。參照王琛柱等[17]以氨苯磺胺偶氮酪蛋白為底物測定總蛋白酶活性。淀粉酶活性的測定按照 3,5-二硝基水楊酸法進行[18]。脂肪酶活性的測定采用比色法[19]。

解毒酶主要測定羧酸酯酶（CarE）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）活性。剖去中腸的幼蟲體加入5 mL預(yù)冷的0.04 mol/L磷酸緩沖液勻漿，離心（7727 g、4 ℃）15 min，取上清液作為測試用酶液。CarE和GST測定參考楊亞軍[4]方法，用酶標儀分別在450 nm和340 nm波長測定間隔反應(yīng)時間的光密度值（OD），以反應(yīng)速率表示酯酶活性（OD/(min·mg)）。CAT活性采用二苯胺磺酸鈉催化動力光度法，測定550 nm波長下酶促反應(yīng)速率[20]。

1.6 稻縱卷葉螟激素水平和卵黃蛋白含量測定

蛻皮激素含量參考慧玉虎等[21]方法測定。幼蟲稱重后放入研缽，加2 mL 95%乙醇浸提，超聲振蕩30 min。將液體轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中，858 g冷凍離心10 min，用95%乙醇離心提取多次，集合上清液。經(jīng)氮氣吹干后用甲醇定容，液相色譜測定激素含量。保幼激素含量根據(jù)戴國華等[22]方法。幼蟲稱重后放入研缽，加甲醇與乙醚（1:1）混合液研磨，轉(zhuǎn)移出液體，加入1 mL正己烷超聲10 min，858 g冷凍離心10 min，取上清液，用正己烷提取3次匯集上清液。經(jīng)氮氣吹干后用乙腈定容，液相色譜測定激素含量。卵黃蛋白含量參考楊國慶等[23]，羽化成蟲4 ℃解剖卵巢，吸干水分后稱鮮重。加入5 mL PBS溶液勻漿， 4 ℃、7727 g離心20 min，取上清液考馬斯亮藍G-250染色測定。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 2016處理數(shù)據(jù)，發(fā)育歷期采用t測驗分析，存活曲線應(yīng)用log-rank test分析，其余數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計并方差分析，圖形制作使用GraphPad Prism軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 CnmeGV亞致死處理害蟲的感染和死亡動態(tài)

105OB/g的CnmeGV亞致死劑量處理稻縱卷葉螟3齡幼蟲后，存活幼蟲能正常生長，并未表現(xiàn)出明顯的病毒感染癥狀。病毒亞致死處理幼蟲10 d后巢式PCR檢測發(fā)現(xiàn)，蟲體內(nèi)普遍檢測到500 bp大小CnmeGV的granulin基因片段存在，而未經(jīng)病毒處理的對照組中未檢測到病毒標記基因片段（圖1）。說明亞致死劑量CnmeGV能夠在稻縱卷葉螟蟲體內(nèi)長時間存在，幼蟲體內(nèi)始終攜帶感染病毒，從而產(chǎn)生亞致死作用。CnmeGV亞致死濃度下稻縱卷葉螟幼蟲校正累計死亡率為 18.15%，處理組生存曲線與對照組呈顯著差異（df＝1,P＝0.0431）。害蟲感染CnmeGV死亡發(fā)生集中在病毒接種后期化蛹階段（12～14 d），老熟幼蟲不能正常化蛹而死亡（圖2）。

圖1 CnmeGV亞致死處理稻縱卷葉螟幼蟲存活個體帶毒水平的隨機檢測Fig. 1 Virus carrying in survival larvae of C. medinalis treated with sub-lethal dose of CnmeGV

圖2 CnmeGV亞致死處理稻縱卷葉螟幼蟲的存活動態(tài)Fig. 2 The survival curve of C. medinalis larvae treated with sub-lethal dose of CnmeGV

2.2 亞致死處理對稻縱卷葉螟生長和繁殖的影響

亞致死CnmeGV對稻縱卷葉螟的生長發(fā)育產(chǎn)生明顯影響，主要表現(xiàn)在化蛹、羽化和產(chǎn)卵的變態(tài)階段。CnmeGV亞致死濃度處理稻縱卷葉螟后，幼蟲3齡后平均發(fā)育歷期為13.68 d，而對照組為13.30 d，兩者差異不顯著（t＝1.393，df＝85，P＝0.1672）（圖3）。幼蟲化蛹蛹重顯著下降，較對照減輕了15.95%（F1,5＝13.94，P＝0.02）。病毒亞致死處理對蛹的羽化產(chǎn)生明顯影響，處理組蛹羽化率僅為59.21%，顯著低于對照84.02%的羽化率（F1,5＝40.70，P＝0.0031），同時羽化成蟲性比發(fā)生變化，處理組雌性性比（♀∶♂）由對照組的1.11下降到0.82（F1,5＝59.346，P＝0.002），差異顯著（圖4）。CnmeGV亞致死處理同樣影響了稻縱卷葉螟的產(chǎn)卵，羽化成蟲單雌產(chǎn)卵量為26.07粒，較對照產(chǎn)卵量減少了41.5%，差異顯著（F1,5＝19.42，P＝0.0116）。而從產(chǎn)卵孵化率來看，處理組雌蟲產(chǎn)卵孵化率達88%，與對照組93%的孵化率差異不顯著（F1,5＝4.83，P＝0.0926）（圖5）。

圖3 CnmeGV亞致死處理稻縱卷葉螟幼蟲的歷期Fig. 3 Duration of C. medinalis larvae treated with sub-lethal dose of CnmeGV

圖4 CnmeGV亞致死處理稻縱卷葉螟蛹重、羽化及性比的變化Fig. 4 Pupa weight, eclosion and sex ratio of C. medinalis treated with sub-lethal dose of CnmeGV

圖5 CnmeGV亞致死處理稻縱卷葉螟的產(chǎn)卵和孵化Fig. 5 Oviposition and hatching of C. medinalis treated with sub-lethal dose of CnmeGV

2.3 CnmeGV亞致死處理對稻縱卷葉螟代謝酶活性的影響

CnmeGV亞致死處理影響稻縱卷葉螟幼蟲的營養(yǎng)代謝，幼蟲中腸脂肪酶活性變化最大，較對照處理活性提高了45.92%（F1,5＝90.23，P＝0.001）。淀粉酶活性從0.196提高到0.2833，顯著高于對照處理（F1,5＝9.74，P＝0.0035），而蛋白酶活性與對照處理無顯著差異（F1,5＝1.96，P＝0.234）（圖6）。幼蟲蟲體羧酸酯酶（CarE）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）等解毒酶活性也表現(xiàn)不同程度的差異變化，CarE活性降低，與對照呈顯著差異（F1,5＝25.08，P＝0.007），GST酶活性增強，顯著高于對照處理（F1,5＝17.12，P＝0.014）。CAT酶活性與對照組相比差異不顯著（F1,5＝1.91，P＝0.239）（圖7）。

圖6 CnmeGV亞致死處理稻縱卷葉螟幼蟲消化酶活性變化Fig. 6 The digestive enzyme actives of C. medinalis larvae treated with sub-lethal dose of CnmeGV

圖7 CnmeGV亞致死處理稻縱卷葉螟幼蟲解毒酶活性變化Fig. 7 The detoxifying enzyme actives of C. medinalis larvae treated with sub-lethal dose of CnmeGV

2.4 亞致死處理對稻縱卷葉螟激素水平和卵黃蛋白的影響

稻縱卷葉螟取食亞致死濃度CnmeGV后，幼蟲體內(nèi)蛻皮激素和保幼激素含量顯著降低，蛻皮激素含量由 0.188 μg/g 下降到 0.041 μg/g，降幅達 4.59 倍（F1,5＝19.77，P＝0.0069）。保幼激素由對照組的 0.146 μg/g下降為0.026 μg/g，下降了5.62倍（F1,5＝5.89，P＝0.0004）。CnmeGV亞致死處理對稻縱卷葉螟卵巢發(fā)育無顯著影響（F1,5＝7.22，P＝0.7537），但卵巢內(nèi)卵黃蛋白含量顯著降低，處理組卵黃蛋白含量為235.17 μg/g，較對照下降了40.63%（F1,5＝37.75，P＝0.0388）（表1）。

表1 CnmeGV亞致死處理稻縱卷葉螟幼蟲激素水平及成蟲卵黃蛋白含量Table 1 The hormone level of C. medinalis larvae and vitellogenin content of female treated with sub-lethal dose of CnmeGV

3 討論

殺蟲劑的亞致死作用研究是害蟲可持續(xù)治理和農(nóng)藥科學(xué)應(yīng)用的重要課題。目前，有關(guān)亞致死效應(yīng)主要通過生物個體的生物活性、繁殖率、生態(tài)行為或種群生命表等方面的參數(shù)來評價和評估[7]?；诨瘜W(xué)殺蟲劑的大量研究表明，亞致死作用對害蟲的影響因農(nóng)藥性質(zhì)、害蟲種類、試驗方法等不同而有所差異[24]。桿狀病毒是特異性感染昆蟲的環(huán)狀雙鏈DNA病毒，主要包括核型多角體病毒（NPV）和顆粒體病毒（GV），通過病毒粒子感染宿主受體細胞造成害蟲死亡、引起害蟲病毒流行而控制害蟲種群暴發(fā)增長[25]。桿狀病毒突破宿主免疫體系形成系統(tǒng)感染則造成害蟲直接死亡，而宿主通過防御機制抑制病毒進一步增殖擴散而存活。作為其存活的代價，害蟲往往通過降低存活率、延長發(fā)育歷期、降低蛹重、減少產(chǎn)卵量等來維持對病毒感染的免疫抗性[26]。本研究結(jié)果表明，CnmeGV亞致死劑量處理后存活幼蟲體內(nèi)普遍攜帶病毒，可能造成稻縱卷葉螟種群中桿狀病毒持續(xù)感染。持續(xù)感染的病毒雖不能造成稻縱卷葉螟幼蟲的直接死亡，但卻影響了稻縱卷葉螟的生長發(fā)育和產(chǎn)卵繁殖。CnmeGV亞致死處理害蟲的蛹重、羽化、性比和產(chǎn)卵都發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)出蛹重減輕、羽化率下降、雌雄性比降低和產(chǎn)卵量減少，最終導(dǎo)致稻縱卷葉螟子代種群增長受到顯著抑制。Rothman等[27]認為桿狀病毒的亞致死作用在去掉其致死作用外，可使種群數(shù)量再降低20%。桿狀病毒除通過直接致死昆蟲外，也通過影響產(chǎn)卵率等因素影響宿主種群動力學(xué)[28]。

目前，有關(guān)殺蟲劑對害蟲的亞致死效應(yīng)主要集中在害蟲生物學(xué)特性的表象上，造成亞致死作用的內(nèi)在機制仍無法明晰[7]。桿狀病毒的亞致死效應(yīng)可能更多是能量交換的結(jié)果，宿主為抵抗外源病毒而調(diào)動免疫反應(yīng)將病毒感染的影響限制到最低水平，從而使自身的生長或其他重要功能不受影響[29]。CnmeGV亞致死處理對幼蟲發(fā)育歷期的影響不明顯，但對消化酶活性影響顯著，特別是淀粉酶活性顯著增強。說明病毒亞致死效應(yīng)誘導(dǎo)宿主通過提高消化酶活性增強取食代謝以補償?shù)钟《靖腥镜哪芰肯?。CnmeGV對稻縱卷葉螟的亞致死作用主要表現(xiàn)在化蛹和羽化階段。前期研究也表明，亞致死處理的稻縱卷葉螟在化蛹的變態(tài)過程中，通過蛹蛻將蟲體內(nèi)持續(xù)感染的病毒排出體外，以降低潛伏感染病毒對子代的影響[15]。胸腺是昆蟲分泌蛻皮激素的主要結(jié)構(gòu)，腦內(nèi)神經(jīng)分泌細胞也是多種激素產(chǎn)生和分泌的場所。NPV亞致死處理舞毒蛾Lymantria dispar的胸腺、腦和卵巢等組織都不同程度受到感染，可能影響昆蟲分泌功能，導(dǎo)致生長發(fā)育紊亂[30]。CnmeGV亞致死處理后，稻縱卷葉螟調(diào)控昆蟲變態(tài)發(fā)育的保幼激素和蛻皮激素水平都顯著下降，影響了昆蟲的正常變態(tài)發(fā)育，表現(xiàn)出蛹重降低，性比變化及羽化率顯著下降。桿狀病毒亞致死作用對雌性個體的影響明顯高于雄性個體[30]。卵黃蛋白是卵黃中的主要成分，為胚胎發(fā)育提供氨基酸、脂肪、碳水化合物、維生素等營養(yǎng)和功能性物質(zhì)[23]。CnmeGV亞致死處理的雌性成蟲卵巢中卵黃蛋白含量顯著下降，這可能是導(dǎo)致CnmeGV亞致死處理羽化成蟲產(chǎn)卵量下降的主要因素。

昆蟲體內(nèi)解毒酶的酶活力可以作為一種生物標記來測定殺蟲劑的亞致死效應(yīng)[31]。GST和CarE是對殺蟲劑產(chǎn)生代謝抗性的重要酶系，多殺菌素在活體條件下能誘導(dǎo)增強蟲體 CarE活性，從而降低害蟲對殺蟲劑的敏感度[32]。GSTs和CarE的活性增強與田間茶細蛾Caloptilia theivora的抗藥性密切相關(guān)[33]。桿狀病毒亞致死作用同樣涉及宿主蟲體抗性、解毒相關(guān)酶系的活性。美洲棉鈴蟲Helicoverpa zea經(jīng)核型多角體病毒（HzSNPV）亞致死濃度（LD15）處理后誘導(dǎo)蟲體參與包埋和黑化反應(yīng)的葡糖水解酶（GLD）活性顯著提高，而多酚氧化酶（PO）活性卻未發(fā)生明顯變化[34]。小菜蛾P(guān)lutella xylostella感染顆粒體病毒（PxGV）的蟲體 CAT活力顯著提高，而過氧化物岐化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活力變化較小[35]。本研究測定的三種解毒酶活性中，CAT活性在CnmeGV亞致死作用下并未發(fā)生明顯變化，但GST活性顯著提高，而 CarE活性卻顯著下降，說明桿狀病毒亞致死作用誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)是復(fù)雜的，與宿主的抗逆性和耐藥性有著密切的關(guān)系[36]。GST活性增強可能涉及宿主對病毒的抗性作用，CarE活性下降則表明宿主對桿狀病毒抗性存在不同于化學(xué)農(nóng)藥的機制。桿狀病毒感染誘導(dǎo)蟲體組織產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[37]，CnmeGV亞致死處理并未引起CAT活性改變，有利于蟲體組織保持較高的活性氧（ROS）水平，從而抑制病毒的增殖。

桿狀病毒作為控制害蟲的重要生物因子，是引起生態(tài)系統(tǒng)中昆蟲種群波動的主要因素，其作用價值在于對害蟲種群的生態(tài)控制作用上[28]。桿狀病毒感染宿主不僅具有殺死害蟲的致死作用，還具有亞致死作用。這種亞致死作用表現(xiàn)為寄主體內(nèi)帶毒而不造成害蟲死亡的持續(xù)感染。近年來大量證據(jù)表明，持續(xù)感染的桿狀病毒在昆蟲種群中普遍存在[38]，持續(xù)感染可能是造成亞致死效應(yīng)的主要因素。長期以來對殺蟲劑的評價主要集中在其致死劑量的殺蟲效果和致死時間的長短，而沒有表現(xiàn)出即時殺蟲效果的亞致死作用常常被忽視。已有的研究充分證明，桿狀病毒亞致死作用顯著影響害蟲的生長發(fā)育和產(chǎn)卵繁殖，對控制害蟲種群增長具有重要作用[39,40]，加強桿狀病毒亞致死作用在維持生態(tài)平衡、減少農(nóng)藥和病毒使用及對害蟲種群持效控制作用研究具有重要意義。