汪 華，鄧思怡，劉 軍，常 威，程杰元，陳 琦，喻大昭#

（1. 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所，武漢430064；2. 華中作物有害生物綜合治理重點實驗室，武漢430064；3. 浠水縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心植保站，浠水438200；4. 赤壁神山興農(nóng)科技有限公司，赤壁437300）

中國是獼猴桃原產(chǎn)地和世界上最大的獼猴桃生產(chǎn)國和消費國[1,2]。以“紅陽”品種為主的紅心獼猴桃因其口感和品質(zhì)深受市場青睞。但該品種易感由丁香假單胞菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringaepv.actinidiae，Psa）引起的潰瘍病[3-5]。該病害具有發(fā)生范圍廣、傳播迅速和防治難度大等特點[6]，在我國16個省份已造成嚴(yán)重危害[7,8]，成為制約獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要問題。國內(nèi)外已從病原學(xué)、發(fā)生規(guī)律和治理辦法等多方面對該病進行了研究。已有的結(jié)果表明該病病菌可在病株枝干、葉、芽、葉痕和田間病殘體上越冬，成為翌年初侵染源[9,10]。病菌主要借風(fēng)、雨、昆蟲傳播，通過自然孔口和傷口侵染寄主[11]。其發(fā)展與溫度和濕度關(guān)系密切[12]。Serizawa和Ichikawa[13]研究表明春季旬平均氣溫在12 ℃～18 ℃時，病害發(fā)生嚴(yán)重，而氣溫超過25 ℃時，新病斑僅在陰涼雨濕條件下發(fā)生。但未見雨天是否促進獼猴桃潰瘍傳播的報道。另外，前期獼猴桃園區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，園區(qū)陡坡區(qū)域的獼猴桃潰瘍病流行較為嚴(yán)重。為明確露地栽培獼猴桃園區(qū)坡度和晴、雨天對獼猴桃潰瘍病傳播的影響。本研究于2020年4月和2021年3月在獼猴桃園區(qū)的不同坡度區(qū)域和晴、雨環(huán)境下利用孢子捕捉器開展病原捕集試驗，記錄獼猴桃樹葉片顯癥所需時長，以此反映不同條件對病害傳播的影響，為該病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗品種為“紅陽”紅心獼猴桃。植物基因組DNA提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。中農(nóng)簡易病菌孢子捕捉器由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病害流行學(xué)實驗室研制，專利號：ZL201410009269.6[14]。其進氣倉直徑10 cm、高度10 cm，頂部設(shè)有8個進氣孔，進氣孔長3 cm、寬1 cm，捕捉倉直徑10 cm、高度10 cm、底座長12 cm、寬12 cm、高5 cm，底部風(fēng)扇直徑8 cm，出風(fēng)口為下方，鋰電池組（12 V，30 AH）供電裝置由深圳市勁風(fēng)科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 獼猴桃園區(qū)基本情況調(diào)查

2020年4月14日對湖北省赤壁市半島南獼猴桃園區(qū)18個種植紅陽獼猴桃的棚區(qū)的栽培模式、地形環(huán)境以及潰瘍病的病情指數(shù)和病株率進行了調(diào)查。病情分級標(biāo)準(zhǔn)如下：0級：全株無明顯病斑；1級：只有葉片可見明顯病斑，且病斑面積均未超過10%；2級：葉片、枝條均有明顯病斑，但病斑環(huán)繞枝條15%以下，主干無病斑或病斑面積低于25%；3級：枝條、葉片和主干均有明顯病斑，且主干病斑面積在25%～50%；4級：全株發(fā)病或死亡，或主干病斑面積高于50%。

1.3 獼猴桃潰瘍病菌捕集試驗

2020年4月16—22日和2021年3月24—30日，根據(jù)發(fā)病情況和地勢環(huán)境，在10號棚架內(nèi)選擇了4塊試驗地作為4個處理（如表1所示）。每處理設(shè)置3臺孢子捕捉器作為3個重復(fù)。蓄電池固定在獼猴桃植株中間的水泥支柱上，捕捉器固定在蓄電池上（圖1），捕捉器上部有進氣倉，下部有捕集倉，底部有風(fēng)扇，將儀器周圍的空氣吸入倉內(nèi)，使病原菌落到健康葉片上。

表1 孢子捕捉器在獼猴桃園內(nèi)不同地勢擺放坡度及排布方式Table 1 Slope and arrangement of pathogen traps in different terrains in kiwi orchard

圖1 孢子捕捉器在獼猴桃園區(qū)不同地勢的擺放位置Fig. 1 Trap positions in each treatment in different terrains in the orchard

獼猴桃潰瘍病菌捕集操作步驟：（1）早上7點左右，在“紅陽”獼猴桃試驗棚，用75%酒精消毒的剪刀，采集大、小葉位一致的健康獼猴桃葉片備用；在室內(nèi)用0.5%次氯酸鈉溶液浸泡葉片1 min，無菌水漂洗兩遍，滅菌紗布吸干葉片表面水分，將葉柄剪至1 cm長，用2 cm×3 cm的滅菌紗布將葉柄部位包住，備用。（2）將雙層無菌濾紙放入直徑9 cm的塑料培養(yǎng)皿中，添加無菌水至濾紙潤濕。然后，將步驟1處理好的葉片放入其中。（3）將孢子捕捉器底部電源斷開，打開捕捉器進氣倉，將盛放有上述葉片的培養(yǎng)皿置于捕捉器倉底部，蓋上進氣倉，接通電源。（4）孢子捕捉器捕集24 h后，取出培養(yǎng)皿中葉片，放入有無菌濕潤濾紙的磁盤中，同時用健康獼猴桃葉片做陰性對照。磁盤上用透明封口膜保濕。當(dāng)葉片出現(xiàn)褪綠小點或不規(guī)則的褐色斑點，斑點周圍有黃色暈圈且黃色暈圈連續(xù)3 d擴大時，把第1 d觀察到黃色暈圈的時間定義為開始顯癥時間，把該時間與葉片采集日之間的時間差定義為顯癥所需時長。（5）把確定顯癥所需時長后的葉片用干濾紙將葉片分開包裹，放入自封袋中，置于4 ℃冰箱保存，用于后續(xù)顯癥葉片的病原菌分子鑒定，以確認(rèn)該病斑為由潰瘍病菌所致。（6）連續(xù)7 d，記錄當(dāng)日天氣情況，包括溫度、濕度、晴雨天。

1.4 潰瘍病斑的分子鑒定

用植物基因組DNA提取試劑盒提取獼猴桃顯癥葉片和健康葉片（陰性對照）的DNA。利用獼猴桃潰瘍病菌特異性引物（上游引物PsaF1：5′-TTTTGCTTTGCACACCCGATTTT-3′和下游引物PsaR2：5′-CAC GCACCCTTCAATCAGGATG-3′）[15]鑒定獼猴桃發(fā)病葉片是否為潰瘍病菌所致。PCR反應(yīng)體系總體積25 μL:無菌水9.5 μL，Master mix 12.5 μL，DNA 1.0 μL，引物 PsaF1/PsaR2各 1.0 μL。PsaF1/R2進行 PCR 擴增條帶大小為280 bp。PCR擴增反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。分別對其PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測。PCR擴增片段送至生工生物工程股份有限公司進行測序，經(jīng)測序得到的序列在 NCBI 網(wǎng)站上進行Blast檢索比對。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Microsoft Office Excel軟件對各試驗所得數(shù)據(jù)進行整理和作圖，獲得平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤。利用SPSS 23.0數(shù)據(jù)處理軟件進行方差分析，利用鄧肯氏新復(fù)極差法（DMRT）進行差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃園區(qū)基本情況調(diào)查

為了選取合適的試驗區(qū)域，對所選獼猴桃園區(qū)的地勢和潰瘍病發(fā)病情況進行了調(diào)查。結(jié)果顯示園區(qū)發(fā)病棚區(qū)病情指數(shù)低于30的有4個，介于30～50之間的棚區(qū)有6個，超過50的棚區(qū)有8個（表2）。其中，8、16、17和18號的區(qū)域為平地，病情指數(shù)均明顯低于有斜坡區(qū)域，表明不同地勢可能影響病害的傳播。本試驗選擇靠近路邊，方便通行，植株長勢一致，且包括不同坡度的10號棚架作為后續(xù)試驗區(qū)域。

表2 獼猴桃園區(qū)情況調(diào)查Table 2 Investigation of the kiwifruit orchard

2.2 坡度對獼猴桃潰瘍病菌傳播的影響

2020年和2021年對獼猴桃園區(qū)試驗地的坡頂和坡底（10°）、坡上（45°）和坡下（30°）進行病原菌捕集，結(jié)果均表明在坡底和坡頂（10°）進行病原捕集的獼猴桃葉片顯癥所需時長比在坡上（45°）和坡下（30°）進行病原捕集的獼猴桃葉片顯癥所需時長長1～2 d（圖2A，B），表明30°至45°陡坡區(qū)域有利于獼猴桃潰瘍病的傳播。

圖2 不同坡度捕集病原菌的獼猴桃葉片顯癥所需時長Fig. 2 Length of time necessary to show symptoms in kiwi leaves placed inside pathogen traps at different slope areas

2.3 晴、雨天對獼猴桃潰瘍病傳播的影響

2020年和2021年分別連續(xù)7 d調(diào)查了天氣情況對發(fā)病的影響結(jié)果表明，2020年4月18日和4月20日雨天導(dǎo)致溫度低濕度高，獼猴桃葉片7～8 d即可發(fā)病，而晴天獼猴桃葉片顯癥所需時長為10～12 d（圖3A）。2021年3月27日、3月29日和3月30日雨天也表現(xiàn)出同樣的結(jié)果（圖3B）。因此，表明雨天導(dǎo)致的低溫高濕環(huán)境利于潰瘍病的傳播。

圖3 晴、雨天捕集病原菌的獼猴桃葉片顯癥所需時長Fig. 3 Time length necessary to show symptoms in kiwi leaves placed inside pathogen traps on sunny and raining days

2.4 獼猴桃顯癥葉片的病原菌分子鑒定

通過獼猴桃潰瘍病菌特異性引物Psa F1/Psa R2 進行的PCR檢測結(jié)果表明，作為陰性對照的健康葉片DNA未擴增出條帶，顯癥葉片DNA則擴增出280 bp大小的條帶。對所有擴增條帶進行測序，并經(jīng)與NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast檢索比對，結(jié)果顯示所有發(fā)病葉片為Psa侵染所致。

3 討論

有研究表明，雨水可能是獼猴桃潰瘍病菌中短距離傳播的重要途徑[11,16,17]，但并沒有量化研究。本研究通過病原捕集，并以葉片顯癥所需時長明確了雨天環(huán)境對獼猴桃潰瘍病傳播的影響，證明雨天進行病原捕集后葉片顯癥所需時長最短（7～8 d）。而晴天回收的葉片，顯癥時長通常為10～12 d。其原因可能在于雨天利于潰瘍病菌的增殖，群體數(shù)量增加后致傳播量加大。但也可能與雨水促進了病原菌的定殖和侵染有關(guān)。無論如何，雨水是可以促進該病的擴散。因此，避雨栽培應(yīng)可能成為獼猴桃潰瘍病防控的有效手段。地勢較為平坦的棚架發(fā)病情況和病株率相對較輕，進行病原捕集的獼猴桃葉片顯癥時間較長。試驗中，在坡底（10°）進行病原捕集的獼猴桃葉片顯癥所需時間最長，而在45°陡坡進行病原捕集的獼猴桃葉片顯癥所需時間最短。這可能是因為陡坡比平地接收了更多風(fēng)帶來的病原菌，并在葉片上集聚，增加了病原菌的接種勢。因此，地形上的隔離對該病的防控有一定的意義。本研究首次借助孢子捕捉器直接證實了園區(qū)陡坡區(qū)域和雨天環(huán)境可以促進獼猴桃潰瘍病的流行，為后續(xù)防治方法和防治策略的制訂提供了依據(jù)。