崔明秦，張東華，閆曉慧，洪英娣，馬煥成 ，伍建榕,*，劉 麗*

（1. 云南省高校森林災害預警控制重點實驗室/西南林業(yè)大學生物多樣性保護學院，昆明650224；2. 西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點實驗室/西南林業(yè)大學林學院，昆明650224）

油茶Camellia oleifera，隸屬于山茶目山茶科Theaceae山茶屬Camellia，為常綠小喬木或灌木，是中國特有的木本油料樹種，具有較高的經濟和生態(tài)價值[1]。根據林業(yè)部門的統計截止2020年我國油茶種植面積約達7175萬畝，油茶籽產量314萬噸，茶油產量約72.1噸。油茶炭疽病是油茶栽培過程中最常見的真菌性病害，在各大油茶產區(qū)普遍發(fā)生[2]。在不同栽培地區(qū)該病的主要致病菌各不相同，主要包括炭疽菌屬下的果生炭疽Colletotrichum fructicola、山茶炭疽C. camelliae、膠孢炭疽C. gloeosporioides、暹羅炭疽C.siamense等[3]。病菌以分生孢子借助雨水傳播，可進行多次再侵染[4]，并依次危害油茶葉片、枝條及果實，造成油茶大面積落葉、落果、落花和枯枝，導致油茶減產20%～30%，給油茶產業(yè)的健康發(fā)展造成了嚴重的經濟損失[5]。

植物內生菌是指生活史中一定階段或全部階段定殖于植物器官、組織內部以及細胞間隙的一類微生物，主要包括內生真菌、細菌和放線菌。內生菌在與宿主共生的過程中，可通過為宿主植物提供所需的部分營養(yǎng)物質和激素來調節(jié)植物的生長發(fā)育[6]，亦可合成和分泌部分抗菌素和酶等活性物質進而提高植物對環(huán)境的適應能力[7]。相對于宿主，植物微生物群落的快速進化大大加強了這種適應性[8]。同時內生菌還廣泛參與宿主次生代謝產物的合成與轉化，對宿主植物的種群結構、生存、進化和健康狀態(tài)產生重大影響[9,10]。近年來，越來越多的研究發(fā)現，植物受到病原侵染后，會招募有益微生物為植物提供保護[11]。如基于系統發(fā)育芯片法研究發(fā)現，擬南芥受霜霉菌Hyaloperonospora arabidopsidis侵染后會誘導根際土壤中特定細菌的富集，從而形成可抑病的土壤[12]。甜菜受立枯病菌Rhizoctonia solani侵染后會富集幾種根系內生細菌并激活一些生物合成基因簇，從而抑制疾病[13]。相比于備受關注的植物根部，作為植物全功能體一部分的“葉圍”在植物抗逆過程中的作用同樣不容忽視。

葉片是植物獲取營養(yǎng)和能量代謝的重要場所，其內生微生物在植物抗病蟲和抗逆等方面發(fā)揮著重要的作用[14]。Chen等[15]以擬南芥自發(fā)壞死突變體為材料驗證了葉片內生細菌的穩(wěn)態(tài)與植物健康息息相關，提出內生細菌群落的失衡是植物葉片表現出類似病害表型的原因。Yang等[16]研究發(fā)現水稻白葉枯抗病品種的葉片中拮抗白葉枯病菌的內生細菌豐度更高?？梢?，植物葉片內生細菌群落結構與植物病害的抗、感性密切相關。因此，了解植物受到病原浸染后，植物內生細菌群落結構的變化，對病害防治至關重要。本研究基于高通量測序技術解析油茶炭疽病侵染后對油茶葉片內生細菌群落結構、多樣性的影響，并對葉片內生細菌群落功能進行預測。以期揭示油茶葉片內生微生物群落對炭疽病的應答規(guī)律，為進一步探討油茶炭疽病的生防策略奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料采集

樣品于2021年9月采自云南省德宏傣族景頗族自治州油茶栽培基地。該地區(qū)為南亞熱帶季風氣候類型，雨量充沛，干冷同季，雨熱同期；年溫差小，有霜日少，無霜期長。年平均氣溫 18.4 ℃～20.3 ℃，年溫差 11.8 ℃～12.8 ℃。油茶品種為云南本地品種（白花油茶）。試驗選擇在同一地塊分別采集炭疽病發(fā)病葉片和健康植株的健康葉片2組樣本，已有試驗證明該栽培區(qū)油茶炭疽病原主要為C. fructicola和C.siamense[17]。其中發(fā)病組命名為C組，未病組命名為H組，每組6個重復樣本，共12個樣本。采集后裝入密封袋中，帶回實驗室進行表面消毒。表面消毒流程為75%乙醇1 min，無菌水沖洗1次，用5%（有效氯）次氯酸鈉溶液表面消毒5 min，無菌水沖洗3次。收集最后一次沖洗的無菌水并涂布于NA培養(yǎng)基，作為對照驗證表面消毒效果。

1.2 總DNA提取

將表面消毒的葉片無菌剪為約1 cm×0.5 cm小塊。采用E.Z.N.A? Mag-Bind Soil DNA Kit試劑盒（OMEGA公司），提取葉片總基因組DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，并用Qubit3.0定量檢測DNA樣本濃度。

1.3 序列擴增及測序

將提取的總 DNA 作為模板，以 341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′），805R（5′-GACTACHVGGGTA TCTAATCC-3′）為引物對16SV3-V4區(qū)域進行擴增。PCR擴增體系為（200 μL）。

第一輪PCR反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s，5個循環(huán)；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，20個循環(huán)；72 ℃ 5 min，10 ℃。第二輪擴增：95 ℃ 3 min；94 ℃ 20 s，55 ℃20 s，72 ℃ 30 s，5 個循環(huán)；72 ℃ 5 min，10 ℃。

反應產物通過 2%瓊脂凝膠電泳檢測。為了得到均勻的長簇效果和高質量的測序數據，使用 Qubit3.0熒光定量儀進行濃度測定。PCR擴增及測序工作由生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.4 數據統計與分析

原始數據通過cutadapt 1.18去除引物接頭序列，使用PEAR 0.9.8和PRINSEQ 0.20.4進行過濾優(yōu)化和序列拼接得到有效序列。有效序列用Usearch 11.0.667基于97%的相似水平下對序列進行OTU聚類并進行生物信息統計分析（葉綠體、線粒體序列通過生工生物工程股份有限公司自寫Python腳本進行剔除）。利用RDP classifier 2.12對比RDP數據進行物種注釋和分類。基于OTU豐度信息，利用mothur 1.43.0做rarefaction分析，計算多樣性指數（ACE、Chao1、shannon、Simpson）。并通過IBM SPSS Statistic 25.0對數據進行差異顯著性分析。利用R 3.6.0制作曲線圖、PCA圖、物種相對豐度圖。使用phyloseq 1.30.0根據系統發(fā)生進化樹得到樣品間距離矩陣進行主成分分析（基于Bray-Curtis距離算法）。使用STAMP 2.1.3進行差異分析，采用Welch's t-test檢驗。使用BugBase 0.1.0分析微生物組樣品表型，對微生物群落進行表型分類。

2 結果與分析

2.1 基因序列分析

對12個樣本內生菌進行測序，共獲得高質量質控序列1255996條，平均長度407.25 bp，序列在97%的相似度水平下進行聚類共獲得 649個OTU。

通過稀釋曲線可以看出，隨著測序深度的增加，各部位樣本的稀釋曲線斜率趨于平緩（圖1），說明本次測序數據量足夠。

圖1 油茶葉片內生細菌測序稀釋曲線Fig. 1 Rarefaction curve of endophytic bacteria sequencing in Camellia oleifera leaves

2.2 油茶病健葉片內生菌Alpha多樣性分析

表1可以看出云南油茶葉片所有樣本的覆蓋度均在98%以上，表明測序數據可以真實反應病、健葉片樣本內生細菌菌群多樣性；其中，感病組內生細菌Chao1、ACE指數顯著高于健康組（P＜0.05），Simpson和Shannon指數病、健葉片間無顯著差異（P＞0.05）。說明炭疽菌侵染后顯著提高了油茶葉片內生細菌的豐度，但對多樣性無顯著影響。

表1 油茶葉片內生細菌多樣性指數Table 1 Diversity indices of endophytic bacteria in Camellia oleifera leaves

2.3 云南油茶病健葉片內生菌Beta多樣性分析

為了揭示樣本的組間差異，基于Bray-Curtis距離進行了PCA分析（圖2）。結果表明，PC1和PC2的樣本差異貢獻率分別為39.72%和14.16%。組內相似程度大于組間，說明炭疽菌侵染后使油茶葉片內生細菌群落構成趨于相近。

圖2 云南油茶葉片內生細菌OTU水平上PCA分析Fig. 2 PCA analysis of endophytic bacteria in Camellia oleifera leaves at OTU level

2.4 云南油茶病健葉片內生菌群落組成

以97%相似水平對樣本序列進行OTU聚類分析，云南油茶病健葉片內生細菌群落可分類到18個門，40個綱，63個目，100個科，130個屬。

門水平上，病、健油茶葉片內生細菌均檢測出18個門，無特有門。其中，相對豐度大于1%的共7個門（圖3），分別為變形菌門Proteobacteria（27.71%，22.64%）、Bacteroidets 擬桿菌門（12.05%，11.25%）、Verrucomicrobia疣微菌門（4.59%，4.29%）、Acidobacteria 酸桿菌門（3.32%，3.24%）、Actinobacteria 放線菌門（2.25%，2.19%）、Planctomycetes 浮霉菌門（2.03%，1.79%）、Chloroflexi 綠彎菌門（1.34%，1.15%）。病、健葉片內生細菌均為變形菌門豐度最高，其次是擬桿菌門。

圖3 門水平下的云南油茶葉片內生細菌群落組成Fig. 3 Community composition of endophytic bacteria inCamellia oleifera leaves at phylum level

屬水平下的群落組成分析表明，炭疽病侵染后，病、健組內生細菌前20優(yōu)勢屬相同（表2），但相對豐度具有一定差異。病組中相對豐度＞1%的屬為Methylobacterium、Panacagrimonas、Pontibacter、Gp7。健組中相對豐度＞1%的屬為Pontibacter、Panacagrimonas、Gp7。病組最優(yōu)屬為Methylobacterium，健組最優(yōu)屬為Pontibacter。

表2 油茶葉片內生細菌屬水平相對豐度（前20屬）Table 2 Relative abundance of endophytic bacteria in Camellia oleifera leaves at genus level (top 20)

組特有屬為Belnapia0.03%、Achromobacter0.02%、Pantoea0.02%、Flavobacterium0.01%、Spirosoma0.01%。健組特有屬為Legionella0.01%、Rhizorhabdus0.01%、Romboutsia0.01%。云南油茶病、健葉片內生菌還存在大量未鑒定及不可歸類的屬，相對豐度分別達到76.99%、79.99%，這表明云南油茶病健葉片中可能存在大量的新屬種。

2.5 組間差異顯著微生物分析

為了進一步尋找組間差異顯著性物種，對云南油茶病、健葉片內生細菌進行了STAMP分析。結果如圖4所示。在目分類水平（圖4A)上，病組中有3個目的豐度顯著高于健組。分別為Rhizobiales（C 4.17%，H 1.51%）、Rhodospirillales（C 1.90%，H 1.38%）和Clostridiales（C 0.16%，H 0.11%）目。

圖4 基于STAMP分析的組間差異目（A）、科（B)、屬（C）Fig. 4 Analysis of differences between groups based on STAMP at order (A)、family (B)、genus (C) level

在屬分類水平（圖4C）上，病組中共 6個屬的豐度顯著高于健組，依次為 Alphaproteobacteria 門Rhizobiales目下1未鑒定屬（C 1.29%，H 0.71%），Alphaproteobacteria 門Rhodospirillales 目Acetobacteraceae科下1未鑒定屬（C 1.34%，H 0.87%），Firmicutes 門Eubacteriales目 Clostridiaceae科下1未鑒定屬（C 0.10%，H 0.04%），Actinobacteria門Acidimicrobiales 目Aciditerrimonas屬（C 0.02%，H 0.01%）和1未鑒定屬（C 0.05%，H 0.02%）、Proteobacteria門Burkholderiales目Achromobacter屬（C 0.02%，H 0%）（P＜0.05)。

病組 Actinobacteria門Geodermatophilus（C 0.01%，H 0.02%）、Proteobacteria門Sulfurimonas（C 0.05%，H 0.09%）、Pusillimonas（C 0.01%，H 0.03%）共3個屬的豐度顯著低于健組（P＜0.05)。

2.6 云南油茶微生物表型和細菌功能潛力預測

基于16S rRNA的高通量測序結果，采用Bugbase數據庫對云南油茶葉片內生細菌表型進行預測分析，病、健兩組共檢測到9種微生物表型（圖5）。炭疽病菌侵染后，云南油茶葉片內生細菌菌群的生物膜形成、氧化脅迫耐受能力增強；革蘭氏陽性菌、好氧、厭氧、兼性厭氧菌相對豐度增加，但革蘭氏陰性菌相對豐度降低。進一步分析表明，生物膜形成、氧化脅迫耐受能力的增強主要是變形菌門下內生細菌相對豐度的增加。革蘭氏陽性菌主要是放線菌門相對豐度增加，同時還特定增加了綠彎菌門的相對豐度。好氧微生物中，變形菌門、擬桿菌門、酸桿菌門、疣微菌門相對豐度增加。厭氧微生物中酸桿菌門、擬桿菌門、綠菌門、浮霉菌門相對豐度增加。革蘭氏陰性菌主要是變形菌門的相對豐度下降。

圖5 基于Bugbase的油茶葉內生細菌表型預測Fig. 5 Phenotypic prediction of endophytic bacteria in Camellia oleifera leaves based on Bugbase

3 討論

內生細菌與植物體建立和諧關系，有助于植物的生防、促生和抗逆等。本研究采用高通量測序技術對云南油茶炭疽病病、健葉片內生細菌群落進行研究。結果表明，云南油茶葉片受炭疽菌侵染后，內生細菌菌群多樣性相對穩(wěn)定，但菌群的豐度、OTUs數目顯著高于健康葉片。肖蓉等[18]比較分析了患炭疽病與健康草莓根際土壤微生物群落，發(fā)現患病土壤細菌的OTUs數目及多樣性指數均降低。樊俊等[19]研究發(fā)現煙草患青枯病后根際土壤細菌群落結構多樣性高于健康煙草根際土壤?？梢姴煌牟≡秩静煌募闹髦参飳χ参镂⑸锶郝涞亩鄻有院拓S富度的影響不具有一致性，這其中的具體規(guī)律和原因還有賴于對更多試驗數據的歸納與總結。

云南油茶炭疽病菌侵染后改變了葉片內生細菌群落組成。在門水平上，病、健葉片最優(yōu)內生菌門均為變形菌門，其次為擬桿菌門、疣微菌門、酸桿菌門、放線菌門。其中變形菌門是目前多數植物內生菌的優(yōu)勢菌門[20,21]。其他幾個門雖是病、健葉片共有，但均為感炭疽病葉片中的相對豐度較高。向立剛等[22]研究發(fā)現感青枯病的煙株根際土壤中疣微菌門和酸桿菌門的相對豐度也增加，且疣微菌門和酸桿菌門的相對豐度與發(fā)病率呈正相關。另有證據表明酸桿菌門與疣微菌門成員之間有協同作用[23]。放線菌門是能產生抗生素及拮抗物質等多種代謝產物的革蘭氏陽性菌，其功能已在不同類型土壤[24]、海洋、沉積物[25]等環(huán)境中分離獲得的菌株上得以驗證。因此，油茶葉片感染炭疽病后，這幾個細菌門相對豐度增加可能對油茶葉片抵抗炭疽病的入侵有益。

目水平上，被炭疽菌侵染的油茶感病葉片中根瘤菌目、紅螺菌目的相對豐度顯著高于健康組。根瘤菌目下許多科屬都有固氮作用，如克雷伯氏菌屬Klebsiella[26]、根瘤菌屬Rhizobium[27]等。這些可以聯合固氮的植物內生菌不僅具有一定的促生作用，而且可以直接或間接地提高宿主植物的抗病性。在膜生物反應器（MBRs）中，生物膜的形成主要與根瘤菌目和紅螺菌目有關[28]。

屬水平上，甲基桿菌屬Methylobacterium是感病葉片上的最優(yōu)勢屬，且相對豐度高于健康葉片。劉曉菲等[29]研究發(fā)現，黃龍病入侵柑橘，隨罹病程度的加深，甲基桿菌屬的相對豐度也增加。甲基桿菌屬是兼有甲基營養(yǎng)和甲烷營養(yǎng)特性的革蘭氏陰性桿菌，具有固氮能力，可促進植物生長，還可通過分泌植物激素（細胞分裂素、生長素）與植物相互作用。此外，感病葉片中豐度顯著高于健康葉片的Aciditerrimonas屬多具有拮抗、產生抗生素及抑制土傳病害[30]等功能。Achromobacter屬可產生鐵載體并抑制番茄枯萎病[31]。葉片感病后的特有屬Spirosoma是擬桿菌門下的屬，該屬下的許多種表現出對紫外線等輻射的抗性，這是葉際微生物適生的一個重要屬性[32]?？梢姡颇嫌筒璞惶烤揖秩竞?，激發(fā)了油茶葉片中內生細菌的防御。增強了一些具有潛在抗病性的內生菌的豐度。此外，本研究中油茶葉未歸類到屬的內生細菌相對豐度高達79%，可見油茶內生細菌還有很大的開發(fā)新屬種的潛力。由于部分內生菌具有宿主專一性，尚有很多植物存在大量的未知內生菌。如玫瑰的內生細菌以未歸類屬為最優(yōu)勢菌屬，相對豐度占33%[33]，蔥屬植物未歸類內生細菌的豐度占比高達70%[34]。植物內生菌未知屬種的豐度一方面取決于該宿主內生菌研究的深度和廣度，另一方面也受制于現有的已知物種數據庫。

Bugbase主要進行細菌的表型預測，通過表型情況來解析微生物群落生態(tài)功能。本研究通過 Bugbase功能預測得知，在感病葉片中生物膜形成、移動元件、氧化脅迫耐受功能豐度增加。Mousa等[35]研究發(fā)現，小麥種子內生菌也會因鐮刀菌的侵入形成生物膜介導的微菌落，以此形成物理屏障，阻止病原菌的入侵。此外，感病葉片中革蘭氏陽性菌豐度增加，目前許多代表性的生防細菌都是革蘭氏陽性菌[36]，并有證據表明植物內生革蘭氏陽性菌在植物抗病、營養(yǎng)互作等有利于植物健康生長的生物活性方面具有重要的作用[37]。Bugbase表型分析是基于OTU數據的預測分析，本研究中存在大量未分類的屬種，因此會出現表型預測比較片面或有些樣品的部分表型沒有預測到等情況。進一步的宏基因組測序將可以給出相對準確的內生細菌的功能分析。此外，對微生物群落功能的全面準確的預測，還有賴于已有參考數據庫的不斷完善。