孫 偉，袁會珠，陳淑寧

（中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，北京 100193）

油茶是我國特有的油料植物樹種，主要分布于我國長江流域以南地區(qū)，是我國部分地區(qū)重要的經(jīng)濟作物。油茶收獲期產(chǎn)生大量茶油，還能產(chǎn)生茶枯、茶殼等副產(chǎn)品，是醫(yī)療、化學等領域的重要原料，綜合使用價值極高[1,2]。近年來，隨著國家優(yōu)惠政策的出臺，油茶種植規(guī)?？焖僭黾?。

油茶炭疽病是我國油茶種植區(qū)最常見的病害之一，在我國油茶主要產(chǎn)區(qū)特別是在湖南、江西和廣西等?。▍^(qū)）發(fā)生普遍，引起嚴重落果、落蕾、枝梢枯死，甚至整株衰亡。各?。▍^(qū)）每年因油茶炭疽病造成油茶籽實減產(chǎn) 10%～30%，重病區(qū)減產(chǎn) 40%～50%，造成重大的經(jīng)濟損失[3]。隨著油茶炭疽病病原研究的不斷深入，已報道多種刺盤孢屬真菌可以侵染油茶，包括山茶刺盤孢Colletotrichum camelliae、果生刺盤孢Colletotrichum fructicola、暹羅刺盤孢Colletotrichum siamense、隱秘刺盤孢Colletotrichum aenigma、膠孢刺盤孢Colletotrichum gloeosporioides、哈銳刺盤孢Colletotrichum horii、卡瓦刺盤孢Colletotrichum kahawae、喀斯特刺盤孢Colletotrichum karstii和博寧刺盤孢Colletotrichum boninense[4-9]。

目前，噴施化學殺菌劑依舊是防治炭疽病的主要措施，生產(chǎn)上常使用甾醇脫甲基化酶抑制劑類，甲氧基丙烯酸酯類，苯并咪唑類等藥劑進行炭疽病防控[10]。研究表明，不同種刺盤孢對同種殺菌劑的敏感性存在差異。我國東部地區(qū)草莓炭疽病菌中，果生刺盤孢對戊唑醇的敏感性明顯高于暹羅刺盤孢[11]。海南地區(qū)橡膠樹病菌中，膠孢復合群（Gloeosporioides complex）對多菌靈的敏感性明顯高于尖孢復合群（Acutatum complex）[12]。此外，平頭刺盤孢Colletotrichum truncatum對大部分甾醇脫甲基化酶抑制劑類藥劑存在天然抗性[13]。因此，明確油茶炭疽病菌的種群結構，并據(jù)此篩選化學防治藥劑，對油茶炭疽病的精準綠色防控具有重要意義。

我國目前尚無登記于油茶炭疽病的防治藥劑，生產(chǎn)上主要采用多菌靈、甲基托布津等苯并咪唑類殺菌劑進行防治[14,15]，但李河等[16]調(diào)查發(fā)現(xiàn)該類藥劑抗性產(chǎn)生嚴重，部分地區(qū)已不再適合于油茶炭疽病的防治，亟需篩選高效安全的防治藥劑。

本研究對采自不同地區(qū)的油茶炭疽病病葉進行病原菌分離鑒定，并選擇不同作用機制的殺菌劑對分離的病原菌進行室內(nèi)毒力測定，明確不同地區(qū)、不同種群的油茶刺盤孢對藥劑的敏感性，并對科學用藥提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 病葉采集 從河北、浙江、江西、湖南、云南和貴州油茶主產(chǎn)區(qū)采集具有典型發(fā)病癥狀的油茶炭疽病病葉（表1）。

表1 供試菌株的種類名稱及采集地點Table 1 Colletotrichum isolates used in this study

1.1.2 供試藥劑 供試的 13種殺菌劑原藥分別為多菌靈、吡唑醚菌酯、嘧菌酯、苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇、氟環(huán)唑、咪鮮胺、苯并烯氟菌唑、啶酰菌胺、氟醚菌酰胺、氟吡菌酰胺、氟啶胺、咯菌腈。藥劑生產(chǎn)廠家，作用類別，有效成分含量，毒力測試濃度見表2。

表2 供試藥劑類別、有效成分含量、生產(chǎn)廠家及其設定濃度Table 2 Fungicide classes, name, content of active ingredients, fungicide concentrations for sensitivity assays

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離 采用組織分離法分離病原菌[17]。在油茶葉片病健交界處剪取5 mm×5 mm病塊組織，先用無菌水沖洗30 s，再用75%的酒精表面消毒40 s，最后用無菌水沖洗3次，每次30 s。將消毒后的病塊組織置于PDA培養(yǎng)基上，26 ℃恒溫培養(yǎng)。3 d后，用無菌針挑取病塊組織邊緣少許菌絲，連續(xù)純化2～3次。純化菌株保存于 PDA斜面上，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌分子鑒定 選用植物基因組DNA提取試劑盒（擎科生物，北京）提取病原菌DNA。PCR擴增目的片段包括核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（internal transcribed spaces，ITS）、肌動蛋白基因（actin gene，ACT）、幾丁質(zhì)合成酶A基因（chitin synthase A gene，CHS-1）、鈣調(diào)蛋白基因（calmodulin，CAL）、β-微管蛋白基因（β-tubulin gene，TUB2）和3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene,GAPDH），引物序列委托擎科生物工程公司合成（表3）。PCR反應體系總體積為25 μL，包括1 μL DNA模板，1 μL 上游引物，1 μL 下游引物，12.5 μL 2×MasterMix，9.5 μL ddH2O。PCR 反應程序：96 ℃預變性2 min；94 ℃變性20 s，退火（ITS退火溫度54 ℃；ACT退火溫度 58 ℃；CAL退火溫度59 ℃；CHS-1退火溫度56 ℃；TUB2退火溫度59 ℃；GAPDH退火溫度56 ℃）20 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。吸取4 μL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將檢測到清晰目的條帶的PCR產(chǎn)物送至擎科生物科技公司進行測序，將測序結果在GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLASTN同源性分析，并選定模式菌株作為參考序列用于聚類分析。MEGA 7.0 軟件以最大似然法（Maximum Likelihood）構建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹。

表3 選擇的基因位點及其相應引物序列Table 3 Primers used for PCR amplification and sequencing in this study

1.2.3 病原菌形態(tài)學觀察 用直徑5 mm的打孔器從預先活化好的菌株邊緣打取菌塊，每株3次重復，在PDA平板上25 ℃黑暗培養(yǎng)7 d，觀察并記錄菌落形態(tài)特征。培養(yǎng)產(chǎn)生分生孢子后，鏡檢記錄 50個分生孢子大小及形態(tài)特征。

1.2.4 病原菌對化學殺菌劑的敏感性測定 采用菌絲生長速率法測定殺菌劑對病原菌菌絲生長的抑制作用[24]。用二甲亞砜將各試驗藥劑溶解為105μg/mL的母液，將母液加入冷卻至50 ℃左右的PDA培養(yǎng)基中，配置成一系列濃度的含藥培養(yǎng)基，混勻后倒入9 cm培養(yǎng)皿中，獲得含藥培養(yǎng)基平板。每種藥劑設置5個濃度梯度，以無菌水做對照。用直徑為5 mm打孔器在培養(yǎng)5 d的菌落邊緣打取菌餅，將菌餅接種于含藥培養(yǎng)基平板中央，每皿接1個菌餅，每個濃度3個重復。25 ℃黑暗培養(yǎng)5 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，計算出菌絲生長抑制率。取藥劑濃度的對數(shù)值為X，菌絲生長相對抑制率的機率值為Y，用DPS軟件（V 3.01）求毒力回歸方程及EC50。按以下公式計算抑制率。抑制率（%）=（對照菌落直徑—處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離

采樣地區(qū)涉及河北、浙江、江西、湖南、云南和貴州6個省油茶主產(chǎn)區(qū)，共分離17株油茶炭疽病菌。

2.2 病原菌分子鑒定

將測試菌株的目的片段序列在NCBI網(wǎng)站進行BLAST同源性搜索分析，確定這些供試菌株基因序列與已知的29個膠孢復合群參考菌株近似。然后，將這29個菌株作為參照菌株并從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載其相關序列用于聚類分析。以 GenBank相關權威菌株序列為參照，以博寧刺盤孢Colletotrichum boninenseCBS 123755作為外群，用 ITS、TUB2、ACT、CAL、GAPDH、CHS-1基因的聯(lián)合序列采用ML法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。Bootstrap 值大于50%，1000 次重復。從系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出，17株油茶炭疽病菌均屬于膠孢復合群，與6個已知刺盤孢屬物種聚為不同群，且具有較高的支持率（圖1）。它們分別歸屬為山茶刺盤孢、果生刺盤孢、暹羅刺盤孢、膠孢刺盤孢、卡瓦刺盤孢和哈銳刺盤孢。

圖1 油茶炭疽病菌菌株多基因序列采用最大似然法構建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of Colletotrichum isolates from tea-oil tree using multi-locus sequences by Maximum Likelihood method

2.3 病原菌形態(tài)學鑒定

根據(jù)分子系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結合菌落形態(tài)和分生孢子形態(tài)等特征，也支持 17株油茶炭疽病菌分別歸屬山茶刺盤孢、果生刺盤孢、暹羅刺盤孢、膠孢刺盤孢、卡瓦刺盤孢和哈銳刺盤孢，其代表菌株特征描述如下（圖2）：

圖2 在PDA平板上培養(yǎng)7 d后菌落形態(tài)及分生孢子特征Fig. 2 Front and back view of 7-day-old PDA culture and morphological characteristics of conidia

山茶刺盤孢菌株jxnc14：采集于江西省。菌落正面初期為灰白色，后期變?yōu)殚蠙炀G色；背面由黃綠色變?yōu)樯罹G色。氣生菌絲發(fā)達，菌落綿密，呈毛氈狀。培養(yǎng)兩周后菌落表面會產(chǎn)生橘紅色孢子堆，分生孢子圓柱形或梭形，兩端鈍圓，大小為（10.5～23.5）μm×（4.1～8.1）μm，與Dicken和Cook[25]對山茶刺盤孢形態(tài)描述相一致。

果生刺盤孢菌株mc173：采集于河北省。菌落初期為白色，后期變?yōu)榛疑?；背面中心灰色至深灰色，邊緣顏色稍淺。菌落表面有淺灰色氣生菌絲，由稀疏至茂密。培養(yǎng)兩周后，會產(chǎn)生橘紅色孢子堆，分生孢子圓柱形或橢圓形，兩邊鈍圓或稍尖，大小為（10.0～17.8）μm×（3.9～6.6）μm，與Prihastuti等[26]對果生刺盤孢形態(tài)描述相一致。

暹羅刺盤孢菌株gxnn23：采集于湖南省。菌落初期為白色，后期變?yōu)闇\褐色；背面淡黃色至黑褐色。菌落棉絮狀，氣生菌絲發(fā)達，菌落綿密。產(chǎn)孢較少，分生孢子圓柱形，兩端鈍圓，大小為（10.0～16.3）μm×（3.4～6.3）μm，與Prihastuti等[26]對暹羅刺盤孢形態(tài)描述相一致。

膠孢刺盤孢菌株cg：采集于湖南省。菌落初期為白色，后期變?yōu)樯罨疑?；菌落背面淺灰色至深灰色。菌落表面生有白色稀疏的氣生菌絲。培養(yǎng)兩周后菌落表面會產(chǎn)生橘紅色孢子堆，分生孢子圓柱形，兩端鈍圓或稍平，大小為（10.8～16.8）μm×（3.8～6.2）μm，與Prihastuti等[26]和Cannon等[27]對膠孢刺盤孢形態(tài)描述相一致。

卡瓦刺盤孢菌株c2：采集于貴州省。菌落初期為灰白色后期為深灰色：背面由灰白色變?yōu)樯罨疑行纳⒉缴罨疑椛錉钌?。菌落表面氣生菌絲濃密。培養(yǎng)兩周后菌落表面會產(chǎn)生橘紅色孢子堆，分生孢子圓柱形，兩端鈍圓，與Waller等[28]對卡瓦刺盤孢的描述一致。

哈銳刺盤孢菌株ch：采集于湖南省。菌落正面初期為白色，后期為淺褐色；背面由白色變?yōu)闇\褐色，并產(chǎn)生同心輪紋。菌落表面氣生菌絲較薄，棉花狀。產(chǎn)孢較少，分生孢子橢圓形或圓柱形，兩端鈍圓，大小為（6.1～15.0）μm×（3.2～7.0）μm，與Wei和Johnston[29]及Xie[30]對哈銳刺盤孢描述一致。

2.4 油茶炭疽病菌對殺菌劑的敏感性測定

本研究選取了13種藥劑，通過菌絲生長速率法，測定了其對17株油茶炭疽病菌的室內(nèi)毒力活性。其中，嘧菌酯、啶酰菌胺、氟醚菌酰胺、氟吡菌酰胺4種藥劑對油茶炭疽病菌的EC50值大于100 μg/mL，抑菌活性較弱，未錄入表中（表4）。從圖3中可以看出，不同殺菌劑對油茶炭疽病菌菌絲生長抑制作用明顯不同。

表4 油茶炭疽病菌對殺菌劑敏感性測定Table 4 Fungicides sensitivity of Colletotrichum isolates from tea-oil tree

圖3 油茶炭疽病菌對九種殺菌劑的敏感性測定Fig. 3 Sensitivity of Colletotrichum spp. to nine fungicides tested

4種DMI類藥劑對油茶炭疽病菌都有較好的抑制作用。其中，咪鮮胺對油茶炭疽病菌的毒力最強，平均 EC50僅為 0.035 μg/mL。其次為苯醚甲環(huán)唑、氟環(huán)唑、戊唑醇，平均 EC50依次為 0.342 μg/mL、0.490 μg/mL、1.401 μg/mL。

4種SDHI類藥劑對油茶炭疽病菌的抑制作用存在差異。油茶炭疽病菌對啶酰菌胺、氟醚菌酰胺、氟吡菌酰胺表現(xiàn)為不敏感，所有菌株的EC50值均大于100 μg/mL；僅對苯并烯氟菌唑表現(xiàn)敏感，平均EC50為 0.534 μg/mL。

兩種QoI類殺菌劑嘧菌酯和吡唑醚菌酯對油茶炭疽病菌的抑制效果也存在差異。其中，吡唑醚菌酯對油茶炭疽病菌的抑菌活性高，平均EC50為0.243 μg/mL；而從菌絲生長抑制情況來看，嘧菌酯對油茶炭疽病菌的抑菌活性較低，所有菌株的EC50值均大于100 μg/mL。

多菌靈，氟啶胺，咯菌清對油茶炭疽病菌菌絲生長都有較好的抑制作用。其中，油茶炭疽病菌對氟啶胺最敏感，平均EC50為0.076 μg/mL；多菌靈和咯菌腈也具有較高抑菌活性，平均EC50分別為0.169 μg/mL和 0.202 μg/mL。

此外，除戊唑醇和苯并烯氟菌唑以外，不同油茶炭疽病菌菌株間對同一殺菌劑的 EC50值分布范圍較小（圖3）。其中，戊唑醇對油茶炭疽病菌的EC50范圍為0.317～2.655 μg/mL，最高值和最低值相差2.338 μg/mL；苯并烯氟菌唑?qū)τ筒杼烤也【腅C50范圍為0.027～2.149 μg/mL，最高值和最低值相差2.122 μg/mL。 而其他藥劑對不同油茶炭疽病菌的 EC50值分布范圍較小，以咪鮮胺為例，EC50最大值與最小值之間相差僅為 0.059 μg/mL。

3 討論

刺盤孢屬真菌是最常見的植物病原菌之一，其寄主廣且分類復雜[31]。不同種刺盤孢的致病機理及對藥劑的敏感性都存在差異[4,11,12,32]。因此，明確油茶炭疽病病原菌，確定其優(yōu)勢種群，將有助于制定更加高效合理的防治措施。本文從我國河北、浙江、江西、湖南、云南、貴州主要油茶產(chǎn)區(qū)，共分離出了山茶刺盤孢、果生刺盤孢、暹羅刺盤孢、膠孢刺盤孢、卡瓦刺盤孢、哈銳刺盤孢6個種，均屬于膠胞炭疽復合群。Wang等[4]和Jiang等[6]也報道造成我國油茶炭疽病的主要病原菌為膠孢復合群。

目前，化學防治是炭疽病最有效的防控措施。然而，我國尚無登記于油茶炭疽病的防控藥劑。因此，我們從國內(nèi)外登記或報道可用于炭疽病防治的藥劑中選取了13種，涵蓋了6種作用機理。其中，DMI類是目前炭疽病防控中最常用的藥劑。Cao等[12]研究表明咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑3種DMI類藥劑對膠孢復合群均有較好的防效，其中咪鮮胺的 EC50值最低，與本文的研究結果相吻合。此外，不同種的刺盤孢對不同的DMI類藥劑敏感性存在顯著差異。Chen等[13]研究表明，在桃炭疽病菌中，屬于膠胞復合群的暹羅刺盤孢和果生刺盤孢對苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑、戊唑醇、葉菌唑、粉唑醇和腈苯唑 6種DMI類殺菌劑均敏感，而睡蓮刺盤孢Colletotrichum nymphaeae和平頭刺盤孢則對部分測試DMI藥劑表現(xiàn)出天然抗性。油茶炭疽病菌的優(yōu)勢種均屬于膠胞復合群，因此，結合本研究和前人報道，DMI藥劑可作為其推薦用藥。

QoI類殺菌劑一直被廣泛用于炭疽病的防治。本研究選取了嘧菌酯和吡唑醚菌酯兩種藥劑，通過菌絲生長速率法，發(fā)現(xiàn)嘧菌酯對油茶炭疽病菌的抑菌活性較低（EC50＞100 μg/mL），但同屬Q(mào)oI藥劑的吡唑醚菌酯抑菌活性較高，因此，還需要通過孢子萌發(fā)法等試驗進一步驗證測試菌株是否對嘧菌酯產(chǎn)生了抗性，也需采集更多菌株驗證嘧菌酯是否能有效防治油茶炭疽病。此外，QoI類藥劑也極易產(chǎn)生抗藥性，有關其菌株已經(jīng)在我國草莓和桃樹上被相繼報道[11,33,34]。因此，在使用QoI類藥劑防控油茶炭疽病時，需要注意輪換用藥，并監(jiān)測炭疽病菌的抗藥性產(chǎn)生情況。

MBC類藥劑多菌靈在過去很長一段時間一直是防治炭疽病的首選藥劑。在本研究中，多菌靈也對油茶炭疽病菌有很好的抑菌效果。但李河等[16]研究指出湖南、江西、廣東、海南四地油茶苗圃中的炭疽病菌已對多菌靈產(chǎn)生嚴重的抗藥性。因此，在油茶炭疽病防治時應控制多菌靈等MBC類殺菌劑的使用頻率，以延緩油茶炭疽病菌對此類殺菌劑產(chǎn)生抗藥性。

SDHI類藥劑是一類擁有優(yōu)異殺菌活性和寬廣殺菌譜的新型殺菌劑。然而，Ishii[35]研究發(fā)現(xiàn)膠孢刺盤孢，尖孢刺盤孢，谷物刺盤孢Colletotrichum cereale和西瓜刺盤孢Colletotrichum orbiculare對啶酰菌胺，氟吡菌酰胺和氟唑菌酰胺等SDHI類殺菌劑表現(xiàn)出天然抗性，但對苯并烯氟菌唑表現(xiàn)為敏感。本文的研究也進一步證實了這一結果，啶酰菌胺、氟醚菌酰胺、氟吡菌酰胺對油茶炭疽病菌的抑菌活性較低（EC50＞100 μg/mL），而苯并烯氟菌唑?qū)τ筒杼烤也【憩F(xiàn)出優(yōu)異的抑菌活性（EC50=0.534 μg/mL）。苯并烯氟菌唑是由先正達研制的一種新型的SDHI類殺菌劑。目前已經(jīng)在美國已被登記用于蘋果炭疽病的防治，并且它對草莓炭疽病也有很好的防效[36,37]。有關苯并烯氟菌唑?qū)τ筒杼烤也〉奶镩g藥效還需進一步研究。

除了以上藥劑以外，咯菌腈和氟啶胺對油茶炭疽病菌也有優(yōu)異的抑制活性。雖然這兩種藥劑在國內(nèi)尚未被用于炭疽病的防治，但在國外這兩種藥劑已經(jīng)被登記用于防治草莓炭疽病[38,39]。因此，咯菌腈和氟啶胺在油茶炭疽病的防控上具有一定的應用潛力。后續(xù)將進一步通過田間藥效試驗驗證上述藥劑的防治效果。