王 楊 綜述 李世軍 審校

熱射病是指人體暴露于熱環(huán)境或劇烈運(yùn)動后,熱力作用于機(jī)體,機(jī)體產(chǎn)熱與散熱失衡,導(dǎo)致核心溫度升高超過40℃,同時伴中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙(如譫妄、抽搐,甚至昏迷)等,可進(jìn)展為多臟器功能衰竭,如呼吸/循環(huán)衰竭、肝腎功能損傷、凝血功能障礙等一系列急危重癥。熱射病住院患者死亡率為14%～65%,ICU患者死亡率高達(dá)60%,是嚴(yán)重威脅人類生命健康的急重癥[1]。熱射病是體溫調(diào)節(jié)由代償階段逐漸進(jìn)展為失代償階段的過程,可對機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重影響,導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征、彌散性血管內(nèi)凝血等系列反應(yīng)[2]。

表觀遺傳指在基因組或染色質(zhì)內(nèi)通過化學(xué)標(biāo)記和分子修飾的方式,在不改變遺傳物質(zhì)序列的前提下調(diào)控基因表達(dá),誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一系列表型改變[3]。表觀遺傳可能參與了機(jī)體適應(yīng)環(huán)境、免疫耐受、腫瘤發(fā)生等多種生物學(xué)過程。本文旨在從表觀遺傳的角度探索熱射病的發(fā)生機(jī)制及對預(yù)后的影響。

熱損傷的分子保護(hù)機(jī)制

蛋白質(zhì)只能在較窄的溫度窗內(nèi)維持其最佳的形態(tài)和功能,溫度過度升高有可能導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)展開和折疊錯誤,影響細(xì)胞的正常狀態(tài)和功能。錯誤折疊的蛋白可能是熱應(yīng)激反應(yīng)(HSR)的啟動信號,在這一啟動信號下,由熱休克轉(zhuǎn)錄因子(HSF)誘導(dǎo)的熱休克蛋白(HSPs)表達(dá)升高,HSPs能夠識別錯誤折疊蛋白,協(xié)助修正折疊狀態(tài),也可以標(biāo)記錯誤折疊蛋白,通過溶酶體系統(tǒng)進(jìn)行降解[4]。因此HSR誘導(dǎo)的HSPs高表達(dá)是防止熱刺激導(dǎo)致蛋白質(zhì)毒性所引起的細(xì)胞損傷重要機(jī)制之一。多種因素可削弱HSR,如衰老、缺乏對熱的適應(yīng)能力及可能存在的表觀遺傳因素等,都可能導(dǎo)致機(jī)體易發(fā)生熱射病[5]。

熱損傷中表觀遺傳的作用

機(jī)體長時間暴露于異常升高的溫度時,生物物種對環(huán)境壓力做出反應(yīng),在環(huán)境和遺傳因素共同驅(qū)動下發(fā)生表型改變,從而適應(yīng)新環(huán)境,這一過程稱為熱適應(yīng)(AC)。表觀遺傳學(xué)是一套被廣泛接受的通過調(diào)節(jié)表型可塑性使生物體適應(yīng)環(huán)境的變化機(jī)制,可在環(huán)境壓力下產(chǎn)生適應(yīng)性的、短期或長期的基因表型可塑性,增加機(jī)體適應(yīng)環(huán)境變化的潛力[6]。

表觀遺傳主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA對靶基因的調(diào)控等,這些機(jī)制在某些條件下啟動或沉默特定基因的表達(dá)(圖1)[5]。在熱射病過程中,多種形式的表觀遺傳改變參與了疾病發(fā)生發(fā)展過程。

圖1 表觀遺傳修飾的機(jī)制[3]

DNA甲基化DNA甲基化是目前研究最為深入的表觀遺傳機(jī)制,炎癥相關(guān)蛋白DNA甲基化可能在熱射病后機(jī)體易發(fā)生感染事件方面發(fā)揮了重要的作用。

DNA甲基化主要是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)催化下,以CpG島(一些富含CG序列的啟動子區(qū)域)序列為主，將甲基從S-腺苷甲硫氨酸(SAM)轉(zhuǎn)移到胞嘧啶殘基的第5個碳上,形成5 mC,進(jìn)而調(diào)控編碼區(qū)相關(guān)蛋白的表達(dá)[7]。DNA甲基化分布通常呈雙峰,調(diào)控區(qū)域要么高度甲基化,要么非甲基化,因此常作為基因表達(dá)的開關(guān)。

DNMT是調(diào)控DNA甲基化重要的酶。在哺乳動物中有3種DNMT：DNMT1、DNMT3a和DNMT3b,分別在不同階段發(fā)揮促甲基化作用[8]。DNA亦可以在去甲基化酶,如Ten-Eleven轉(zhuǎn)移酶(TET)調(diào)控下發(fā)生去甲基化,TET在5mC甲基上添加一個羥基形成5hmC,將5hmC轉(zhuǎn)化回胞嘧啶,實(shí)現(xiàn)去甲基化的作用[9]。DNA的甲基化和去甲基化動態(tài)變化是機(jī)體適應(yīng)不同環(huán)境的重要機(jī)制。

在哺乳動物、魚類和一些無脊椎動物中,各種環(huán)境刺激,包括污染物、環(huán)境壓力等,都會在全局水平或某些特定基因上改變DNA甲基化水平，影響生物的表型。Dorts等[10]研究表明斑馬魚暴露于高溫和銅后,早期胚胎死亡率顯著增加,孵化延遲,同時DNMT3表達(dá)上調(diào)。在雞胚胎中,TET通過調(diào)節(jié)下丘腦來調(diào)節(jié)對熱應(yīng)激的生理反應(yīng)[11]。在人體中,Bind等[12]認(rèn)為環(huán)境溫度和相對濕度通過DNA甲基化調(diào)節(jié)組織因子3、細(xì)胞間黏附分子1、Toll樣受體2、糖皮質(zhì)受體、長嵌核元素1(LINE1)和Alu等多種蛋白的水平。Murray等[13]發(fā)現(xiàn)小鼠在勞力型熱射病(EHS)恢復(fù)之后第4天,骨髓來源的單核細(xì)胞(BMDM)中26 000多個CpG位點(diǎn)發(fā)生了甲基化,在第30天進(jìn)一步增多;生物信息分析顯示甲基化主要富集在免疫相關(guān)的信號通路上,如核因子κB(NF-κB)相關(guān)基因RelA、RelB和Bcl3啟動子高度甲基化,而抑制基因如Nkfbia低甲基化;當(dāng)用脂多糖(LPS)刺激EHS恢復(fù)后30 d的小鼠時,白細(xì)胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)分泌升高幅度顯著低于對照組。提示EHS可能通過甲基化抑制了機(jī)體的免疫效能。

RNA甲基化甲基化是真核生物最常見的RNA修飾,占總RNA修飾的60%。RNA甲基化參與了RNA加工的所有方面,包括核輸出、翻譯、剪接等[14]。m6A甲基化是目前研究最多的RNA甲基化位點(diǎn)。在甲基化酶Mettl3/Mettl14和去甲基化酶FTO、ALKBH等的作用下,動態(tài)調(diào)整m6A甲基化平衡,最后在YTHDF家族相關(guān)蛋白的作用下,識別發(fā)生甲基化的堿基,調(diào)節(jié)mRNA的出核和翻譯效率[15]。m6A甲基化在動物生長、繁殖、脂肪代謝、神經(jīng)發(fā)育、免疫反應(yīng)等生理過程中有著重要的作用。

研究表明,熱刺激可通過m6A甲基化調(diào)控某些基因的表達(dá)。Lu等[16]在熱刺激的綿羊肝臟中檢測到大量m6A峰,進(jìn)一步功能分析提示差異m6A基因在應(yīng)激反應(yīng)和脂肪代謝中顯著富集。Heng等[17]研究表明在熱刺激后的豬肝臟和脂肪中HSP70/HSP27表達(dá)明顯升高;同時Mettl14、WTAP、FTO和YTHDF2等m6A甲基化相關(guān)酶的水平同樣增加。但作者并未進(jìn)一步探索m6A甲基化水平是否與HSP70表達(dá)相關(guān)。在人體腫瘤細(xì)胞中,Miao等[18]研究提示人黑色素瘤在熱刺激后,熱休克蛋白H1(HSPH1)蛋白5’UTR區(qū)A280和A286位點(diǎn)的m6A甲基化水平升高,進(jìn)而調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白表達(dá)。在Hela細(xì)胞中,熱刺激調(diào)節(jié)m6A甲基化水平,促進(jìn)了HSP70表達(dá)上調(diào),且這種作用不需要通過5’UTR的帽結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn),而是直接與真核起始因子3(elF3)結(jié)合,發(fā)揮調(diào)控作用[19]。Yu等[20]研究表明,在HepG2 細(xì)胞中,m6A甲基化酶Mettl3抑制之后HSP70 mRNA水平顯著升高。這些結(jié)果都表明,HSP70表達(dá)水平與m6A甲基化水平有著明確的關(guān)系。在熱損傷情況下,RNA甲基化是否參與調(diào)節(jié)HSPs表達(dá),目前仍有待研究。

組蛋白修飾組蛋白是一種高度保守的、帶正電荷的核蛋白,與帶負(fù)電荷的DNA結(jié)合,形成染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單元-核小體。組蛋白是基因轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)節(jié)因子,主要通過組蛋白N端尾部的翻譯后修飾,如甲基化、乙?；蛄姿峄葘?shí)現(xiàn)[21]。DNA甲基化常?？梢院徒M蛋白修飾以串?dāng)_的方式交流,參與染色質(zhì)調(diào)節(jié)[22]。

在EHS之后2個月生物體可以獲得AC記憶,在脫適應(yīng)(De-Acclimation,DeAC)的休眠記憶時期,很多分子處于“警戒狀態(tài)”,當(dāng)再次發(fā)生損傷時,機(jī)體能快速再適應(yīng)(Re-Acclimation,ReAC)以應(yīng)對熱損傷。有研究認(rèn)為,組蛋白在這一過程中發(fā)揮了重要的作用。Friedrich等[23]研究提示中度熱刺激擬南芥HSFA2和HSFA3復(fù)合物通過影響組蛋白H3賴氨酸4(H3K4)的高甲基化來促進(jìn)轉(zhuǎn)錄記憶,維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)。Tetievsky等[24]研究提示組蛋白H3的磷酸化誘導(dǎo)了HSF1和熱休克元件HSE的結(jié)合,激活了HSP70和HSP90的表達(dá),隨后組蛋白H4在整個AC、DeAC和ReAC過程中維持了可以隨時轉(zhuǎn)錄的預(yù)警狀態(tài),當(dāng)熱暴露再次發(fā)生時,機(jī)體能夠快速表達(dá)HSP70和HSP90,以緩沖熱暴露對機(jī)體的影響。這就解釋了DeAC之后可以快速ReAC的原因。

血清組蛋白可作為評估EHS嚴(yán)重程度的標(biāo)志物。組蛋白通過與細(xì)菌DNA結(jié)合或破壞細(xì)胞膜發(fā)揮抗菌作用,并通過中性粒細(xì)胞胞外陷阱(NETs)釋放到胞外,成為DAMPs加重機(jī)體損傷。Bruchim等[25]研究提示發(fā)生EHS的犬血清中組蛋白的水平和EHS的嚴(yán)重程度生物標(biāo)志物之間呈顯著正相關(guān)。Li等[26]研究提示EHS人群中血漿外泌體組蛋白H3水平與器官功能障礙和疾病嚴(yán)重程度顯著相關(guān)(AUC=0.925)。

表觀遺傳學(xué)改變傳遞給后代的可能性

表觀遺傳信息跨代遺傳是指在沒有任何環(huán)境暴露的情況下,表觀遺傳信息在幾代人之間的生殖系傳遞。既往報道,懷孕期間由于饑餓導(dǎo)致的熱量限制,使子代較易出現(xiàn)肥胖、糖尿病等[27]。在熱應(yīng)激方面,多年以前就有關(guān)于熱刺激通過表觀遺傳影響了果蠅和鹽水蝦的表型突變的相關(guān)研究[28]。在野生豚鼠中,同一個父親在熱暴露前后所生育的子代的DNA甲基化水平不同。熱暴露后生育的子代在溫度調(diào)節(jié)基因等相關(guān)基因CpG位點(diǎn)上出現(xiàn)高甲基化水平,提示熱調(diào)控在哺乳動物中的可遺傳性[29]。不僅如此,這種遺傳還可能跨越了多代。Klosin等[30]研究表明,在F0代秀麗隱桿線蟲的熱應(yīng)激后,HSP90的過表達(dá)至少持續(xù)了14代,這一效應(yīng)可能與組蛋白H3水平的維持有關(guān)。這些結(jié)果表明表觀遺傳的后代傳遞可能是使生物適應(yīng)頻繁而強(qiáng)烈的氣候變化關(guān)鍵機(jī)制。

事實(shí)上,表觀遺傳性狀向后代傳遞是一個復(fù)雜的過程。體細(xì)胞中,有絲分裂要求表觀遺傳信息能夠在每次細(xì)胞分裂發(fā)生的雙重稀釋下幸存下來,絕大多數(shù)細(xì)胞狀態(tài)信息在傳遞到生物體的生殖系中已經(jīng)被擦除或重新編程。這些信息的維護(hù)至少需要兩個不同的載體之間的相互作用才能實(shí)現(xiàn)。生殖細(xì)胞也是需要關(guān)注的重點(diǎn),因?yàn)榘l(fā)生表觀遺傳的基因如果需要向后代傳遞,取決于至少有一些從生殖系統(tǒng)對遺傳信息的擦除和重編程過程中逃脫出去[6]。大部分組蛋白修飾的結(jié)果在精子發(fā)生過程中被去除;卵細(xì)胞中的基因組雖然由核小體組成,但經(jīng)歷了廣泛的組蛋白置換之后,與體細(xì)胞的染色質(zhì)也有了很大的不同。在受精之后,精子和卵細(xì)胞中的甲基化狀態(tài)同樣會發(fā)生很大改變,亦會影響甲基化信息的保留[6]。

雖然在哺乳動物中,生殖細(xì)胞和胚胎發(fā)育過程中發(fā)生的全局甲基化幾乎完全消除了祖先的甲基化信息,但有一小部分基因可能以某種方式抵抗了甲基化的全局擦除,其中Tet抑制劑Stella的募集可能就是機(jī)制之一[31]。

表觀遺傳改變對器官的遠(yuǎn)期損傷

表觀遺傳在人體適應(yīng)熱刺激中有著重要的作用,有研究提示適應(yīng)不良的表觀遺傳可能影響了某些器官的遠(yuǎn)期功能(圖2)[22]。

圖2 適應(yīng)不良和適應(yīng)性表觀遺傳反應(yīng)之間差異[22]

EHS患者后期心血管事件發(fā)生率明顯升高。在臺灣的一項(xiàng)研究中,EHS發(fā)病2.1年后患者缺血性心臟病的概率增高了3.5倍[32]。在動物實(shí)驗(yàn)中,EHS小鼠恢復(fù)后30 d心肌出現(xiàn)了大量DNA甲基化,且發(fā)生甲基化的位點(diǎn)主要參與了各種應(yīng)激和代謝反應(yīng)的過程,提示心臟可能較易對未來刺激或壓力事件產(chǎn)生不良反應(yīng)[33],但暫無直接的證據(jù)提示表觀遺傳如何直接影響心肌的病變。

EHS后患者發(fā)生各種感染的風(fēng)險明顯增高[2]。在EHS時人體啟動大規(guī)模免疫反應(yīng),試圖修復(fù)器官損傷和功能障礙,但可能同時導(dǎo)致了腸道上皮細(xì)胞破壞,LPS移位致血液中,長期暴露于LPS的單核細(xì)胞或骨髓細(xì)胞會產(chǎn)生對于LPS的耐受性,這種現(xiàn)象受到了DNA甲基化的控制。在小鼠體內(nèi),有研究發(fā)現(xiàn)暴露于EHS的血液對LPS的刺激幾乎沒有反應(yīng),在BMDM中,這種反應(yīng)與促炎基因上DNA甲基化水平相關(guān)[13]。

急性腎損傷是EHS最常見的并發(fā)癥,多數(shù)研究均認(rèn)為橫紋肌溶解是急性腎損傷的主要原因,特別是肌紅蛋白在腎臟中的長期堆積,同時合并全身炎癥反應(yīng),及EHS期間脫水導(dǎo)致的腎臟灌注不足均加重了腎臟損傷。長期隨訪提示,EHS之后慢性腎臟病風(fēng)險增加了4.4倍[34]。另有研究提示表觀遺傳參與了糖尿病腎病的進(jìn)展,但目前仍缺乏EHS之后的慢性腎臟病發(fā)生與表觀遺傳相關(guān)的證據(jù)。

小結(jié):生物處于惡劣環(huán)境時可啟動表觀遺傳修飾,通過調(diào)節(jié)靶蛋白的表達(dá),幫助機(jī)體適應(yīng)環(huán)境的改變,并在某種程度上可向后代傳遞,從而推動物種總體發(fā)生適應(yīng)環(huán)境的基因改變(圖3)。但熱射病如何引起表觀遺傳改變或何種表觀遺傳的改變,表觀遺傳改變是否確定是臟器遠(yuǎn)期損傷的主要原因以及熱射病導(dǎo)致的表觀遺傳改變能否傳遞給后代,仍存在著許多問題亟待解決。

圖3 表觀遺傳在熱應(yīng)激過程中的作用