位紅蘭，董駿武

(武漢市第四醫(yī)院腎病內科，湖北 武漢 430030)

繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進是慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)的常見并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為甲狀旁腺細胞增殖、甲狀旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)分泌增加[1]。因其與鈣磷代謝紊亂、血管鈣化、心腦血管事件[2]、死亡等密切相關，近年已經(jīng)受到高度重視，并成為研究熱點，但其具體的發(fā)生發(fā)展機制仍有待深入研究。

慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)早期FGF23與甲狀旁腺細胞上的FGFR1結合，抑制甲狀旁腺細胞增生及PTH分泌[3-6]。但FGF23對已經(jīng)增生的甲狀旁腺不起作用，且透析患者中血清FGF23與PTH正相關[7-8]。這一矛盾現(xiàn)象提示在CKD進展中可能存在某種競爭機制作用于FGFR1，影響甲狀旁腺增生及PTH分泌。

DJ-1是一種新近發(fā)現(xiàn)的多功能蛋白[9]，具有參與細胞轉化、抗氧化反應、分子伴侶及抑制凋亡等多種生物學功能[10-11]。目前研究發(fā)現(xiàn)，DJ-1具有“細胞內”和“細胞外”兩種存在形式[12]。成骨細胞分泌的細胞外DJ-1蛋白可以作為配體與FGFR1結合[13]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細胞轉分化中DJ-1蛋白的細胞內表達明顯升高[14]，但細胞外DJ-1蛋白分泌是否增加尚未進一步研究，且細胞外DJ-1蛋白是否能作用于甲狀旁腺細胞的FGFR1尚無報道。

本研究旨在探究轉分化腎小管上皮細胞是否分泌細胞外DJ-1蛋白，并作為配體與FGFR1結合，刺激甲狀旁腺細胞增生、PTH分泌。

1 材料與方法

1.1 材料

人腎小管上皮細胞(HK-2)、人甲狀旁腺細胞(武漢巴菲爾生物技術服務有限公司)；DMEM/F12培養(yǎng)液、RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清(美國Gibco公司)；胰蛋白酶-EDTA消化液(北京Solarbio公司)；兔抗人α-SMA蛋白抗體、鼠抗人DJ-1蛋白抗體、鼠抗人p-FGFR1抗體、兔抗人p-ERK1/2抗體(美國Santa Cruz公司)；FGFR1抑制劑SU5402(北京百奧萊博科技有限公司)；細胞增殖檢測試劑盒CCK8(Abcam中國)；免疫共沉淀試劑盒(美國貝克曼);人PTH試劑盒(西門子公司)。純化野生型分泌蛋白DJ-1及突變體由華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院腫瘤科劉順芳教授贈送。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組

(1)HK-2細胞：含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液37℃培養(yǎng)箱(95%濕度，5%CO2)培養(yǎng)，實驗分正常培養(yǎng)組、10μg/L TGF-β1培養(yǎng)組(HK-2細胞轉分化組)。

(2)甲狀旁腺細胞：含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液37℃培養(yǎng)箱(95%濕度，5%CO2)培養(yǎng)，甲狀旁腺細胞分為常規(guī)培養(yǎng)組(A組)、加入HK-2細胞轉分化上清培養(yǎng)組(B組)、加入轉分化HK-2細胞上清+SU5402培養(yǎng)組(C組)；加入純化野生型分泌蛋白DJ-1 5ng/mL(D組)、10ng/mL(E組)、15ng/mL(F組)；同時加入相同濃度的SU5402組(G、H、I組)、DJ-1突變體組(J、K、L組)。

1.2.2 ELISA檢測分泌型DJ-1蛋白

兩組HK-2細胞分別接種至6孔板，每組30樣，培養(yǎng)0、1、3d，分別收集培養(yǎng)液上清，ELISA試劑盒檢測分泌型DJ-1蛋白。

1.2.3 免疫共沉淀檢測分泌型DJ-1蛋白與FGFR1相互作用

A、B組甲狀旁腺細胞培養(yǎng)48h后，收集細胞。加入裂解液提取并稀釋蛋白,制成1g/L的溶液,取500μL加入抗體1μL,4℃緩慢搖晃、孵育過夜。次日加入50μL瓊脂糖珠,4℃緩慢搖晃、孵育4h,使抗體與瓊脂糖珠偶聯(lián);4℃、3 000r/min離心3min,棄上清。用250μL裂解緩沖液清洗瓊脂糖珠3次;加入4μL的5×上樣緩沖液和16μL的1×磷酸鹽緩沖液,煮沸5min待用。Western blot檢測DJ-1、P-FGFR1、FGFR1。

1.2.4 Western blot檢測P-ERK1/2表達

A、B、C 3組甲狀旁腺細胞培養(yǎng)48h后，收集細胞。加入預冷的蛋白裂解液提取蛋白，BCA法測蛋白濃度，上樣，SDS-PAGE凝膠電泳,將蛋白轉移到PVDF膜上。在5%脫脂奶粉中封閉2h后加一抗，4℃孵育過夜。次日在室溫下加入二抗孵育2h，采用ECL發(fā)光液曝光。

1.2.5 CCK8法檢測細胞增殖

甲狀旁腺細胞接種于96孔板，每組32孔，48h后CCK8溶液按1∶10加入每孔染色，2h后酶標儀450nm條件下檢測吸光度(A)值，計算細胞增殖率=(A樣本-A空白)/A空白×100%。

1.2.6 電化學發(fā)光法檢測甲狀旁腺激素

甲狀旁腺細胞接種于96孔板，每組32孔，48h后提取3組培養(yǎng)液上清，人PTH試劑盒電化學發(fā)光法檢測上清液中甲狀旁腺激素含量。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 20.0處理數(shù)據(jù)，非正態(tài)分布計量資料用中位數(shù)(四分位間距)表示，非參數(shù)檢驗比較兩組統(tǒng)計學差異，GraphPad Prism 9.0繪圖。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 轉分化腎小管上皮細胞分泌DJ-1蛋白

10μg/L TGF-β1培養(yǎng)HK-2細胞72h，Western印跡檢測α-SMA表達較正常培養(yǎng)組明顯升高(圖1)，提示腎小管上皮細胞轉分化。分別提取HK-2細胞正常培養(yǎng)組及10μg/L TGF-β1培養(yǎng)組0、1、3d培養(yǎng)液上清，ELISA法檢測分泌型DJ-1蛋白濃度，TGF-β1培養(yǎng)組較正常培養(yǎng)組分泌型DJ-1蛋白濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義，見表1。

表1 ELISA法檢測腎小管上皮細胞分泌DJ-1蛋白濃度(ng/mL，n=30)

圖1 Western印跡檢測HK-2細胞α-SMA蛋白表達

2.2 分泌型DJ-1與P-FGFR1相互作用激活下游P-ERK1/2通路

免疫共沉淀檢測發(fā)現(xiàn)B組甲狀旁腺細胞中DJ-1與P-FGFR1相互作用(圖2)，同時下游P-ERK1/2蛋白表達升高，但加入FGFR1抑制劑SU5402后(C組)P-ERK1/2蛋白的表達被部分抑制，見圖3。

圖2 免疫共沉淀檢測兩組甲狀旁腺細胞DJ-1與FGFR1相互作用

圖3 Western印跡檢測三組甲狀旁腺細胞P-ERK1/2蛋白濃度

2.3 轉分化腎小管上皮細胞培養(yǎng)液上清促進甲狀旁腺細胞增殖及PTH分泌

CCK8法檢測B組甲狀旁腺細胞增殖率為118.40%(112.47%～119.55%)，較A組98.44%(97.12%～99.45%)顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(Z=-6.876,P<0.001)，但C組細胞增殖率98.73%(97.23%～99.45%)較A組無統(tǒng)計學差異(Z=-0.309,P=0.757)，見圖4。電化學發(fā)光法檢測3組細胞上清液中PTH濃度，B組125.38pg/mL(117.56～147.35pg/mL),較A組67.66pg/mL(55.37～79.77pg/mL),差異有統(tǒng)計學意義(Z=-6.875，P<0.001);但C組67pg/mL(54.38～78.99pg/mL)，較A組差異無統(tǒng)計學意義(Z=-0.544，P=0.587)。見圖5。

圖4 CCK8法檢測三組甲狀旁腺細胞增殖率(與A組比較，*P<0.001，n=32例)

圖5 電化學發(fā)光法檢測3組甲狀旁腺細胞上清中PTH濃度(與A組比較，*P<0.001，n=32例)

2.4 不同組CCK8法檢測各組甲狀旁腺細胞增殖率與電化學發(fā)光法檢測各組甲狀旁腺激素濃度比較

不同濃度純化野生型分泌蛋白DJ-1(或加SU5402)及突變體加入甲狀腺細胞培養(yǎng)液后細胞增殖率分別為：D組118.67%(115.55%～119.56%)、E組120.67%(118.89%～130.82%)、F組130.50%(128.30%～139.59%)，較A組98.44%(97.12%～99.45%)差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，但G組97.68%(95.95%～99.41%)、H組98.90%(97.55%～99.54%)、I組98.51%(96.45%～99.52%)、J組99.44%(97.64%～99.54%)、K組99.26%(97.89%～100.50%)、L組98.52%(96.70%～99.35%)較A組差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖6。

圖6 CCK8法檢測各組甲狀旁腺細胞增殖率(與A組比較，*P<0.001，n=32例)

不同濃度純化野生型分泌蛋白DJ-1(或加SU5402)及突變體加入甲狀腺細胞培養(yǎng)液后PTH濃度分別為：D組129.88pg/mL(118.70～142.25pg/mL)、E組147.10pg/mL(140.65～158.08pg/mL)、F組165.61pg/mL(150.22～179.33pg/mL)，較A組67.66pg/mL(55.37～79.77pg/mL)差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，但G組61.49pg/mL(55.29～79.36pg/mL)、H組57.35pg/mL(50.90～73.98pg/mL)、I組66.66pg/mL(55.56～77.72pg/mL)、J組68.03pg/mL(59.46～77.72pg/mL)、K組74.23pg/mL(59.28～78.48pg/mL)、L組68.79pg/mL(58.98～78.23pg/mL)較A組差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖7。

圖7 電化學發(fā)光法檢測各組甲狀旁腺激素濃度(與A組比較，*P<0.001，n=32例)

3 討 論

目前DJ-1在腎臟疾病中表達的研究多集中在細胞內表達水平上，尚無細胞外相關報道。在急性腎損傷模型中，Leeds等[15]發(fā)現(xiàn)內毒素處理小鼠24h后DJ-1蛋白表達較4h升高更明顯，且主要表達在腎小管。Eltoweissy等[16]用促纖維化激動劑ANG Ⅱ(0.5mmol/L)或PDGF(10nmol/L)處理腎小管上皮細胞，DJ-1蛋白與纖維化標志物表達平行升高；在纖維化小鼠模型中同樣觀察到DJ-1蛋白表達隨模型周齡增加而逐漸升高。然而，Yin等[17]報道5ng/mL TGF-β1處理腎小管上皮細胞后前36h DJ-1表達逐漸升高，但隨后開始下降；同時在UUO模型中發(fā)現(xiàn)DJ-1蛋白表達低于對照組。這種差異或許與藥物濃度及模型不同有關。我們用10μg/L TGF-β1處理腎小管上皮細胞后，隨著時間的延長，細胞外DJ-1蛋白分泌增加，但其是否能在CKD患者血清中檢測需進一步臨床研究證實。

此外，本研究首次發(fā)現(xiàn)加入細胞外DJ-1蛋白可以刺激甲狀旁腺細胞增生及PTH分泌，這種作用可以被FGFR1抑制劑SU5402阻斷，免疫共沉淀同時證實了細胞外DJ-1與FGFR1結合，并使其磷酸化。前期研究發(fā)現(xiàn)甲狀旁腺上的FGFRs-Klotho復合物可以與FGF23結合，通過活化絲裂原活化蛋白激酶旁路發(fā)揮對甲狀旁腺激素合成的調控作用[5]。體外和體內試驗均證明FGF23/FGFR1可減少PTH信使RNA合成和抑制PTH分泌，上調甲狀旁腺細胞1-α羥化酶表達，增加局部1，25(OH)2D3合成，發(fā)揮對PTH的抑制作用[6]。目前認為FGF23與FGFR1結合是繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進的主要調節(jié)機制，但本研究首次發(fā)現(xiàn)了DJ-1/FGFR1可能也參與其中。

另外，我們通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)下游信號通路P-ERK1/2被激活。但抑制FGFR1后，P-ERK1/2蛋白的表達僅輕度下降。一方面ERK通路可由生長因子、細胞因子及G蛋白耦聯(lián)受體的配體等多種途徑激活，單純抑制FGFR1不能完全阻斷ERK1/2的活化，推測細胞外DJ-1蛋白可能還與其它分子存在相互作用；另一方面DJ-1/FGFR1相互作用后下游可能也不僅僅激活了ERK1/2蛋白，其它下游途徑有待進一步深入研究。