金科華

(1.湖北科技學院醫(yī)學部醫(yī)藥研究院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學院醫(yī)學部基礎醫(yī)學院)

有氧糖酵解是很多腫瘤細胞的重要特征之一，抑制有氧糖酵解是富有前景的抗腫瘤策略[1]。磷酸甘油酸變位酶(phosphoglycerate mutase 1，PGAM1)是糖酵解途徑的重要酶，催化3-磷酸甘油酸和2-磷酸甘油酸之間的互變，協(xié)調糖酵解、絲氨酸生成和磷酸戊糖途徑[2]，研究表明PGAM1高表達與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[3-4]，可抑制PGAM1的活性[5-9]或降低其表達水平[10]，阻礙腫瘤細胞生長。本研究利用重組DNA技術，在大腸桿菌中表達和純化PGAM1，為后續(xù)抑制劑的篩選和其他研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 宿主菌和主要試劑

大腸桿菌、HiFi DNA Polymerase、DNA marker購自北京全式金生物技術公司。PGAM1 cDNA由廈門大學韓家淮院士饋贈?？敲顾亍PTG、質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司。限制性核酸內切酶購自NEB公司。DNA連接試劑盒購自TaKaRa公司。His-Tag蛋白純化試劑盒(可溶性)購自康為世紀生物科技有限公司。BCA蛋白質定量測定試劑盒購自Bio-sharp公司。截流分子量10kd超濾管(15mL)購自Millipore公司。

1.2 擴增PGAM1 cDNA

設計引物。利用SnapGene軟件設計擴增PGAM1 cDNA的引物。正向引物PF序列為：CGACATATGATGGCCGCCTACAAACTGG；反向引物PR序列為：AGTCTCGAGTCACTTCTTGGCCTTGCCC。下劃線標記的序列分別為Nde I和Xho I位點。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

獲取cDNA模板。將含PGAM1 cDNA的菌液按1∶100接種于含100μg/mL氨芐青霉素的LB，37℃，220r/min培養(yǎng)24h，按質粒抽提試劑盒提取含PGAM1 cDNA的未知質粒。

PCR擴增cDNA。PCR體系：cDNA模板1μL,引物PF(10μmol/L)和PR(10μmol/L)各1μL，10×HiFi Buffer Ⅱ 5μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，HiFi DNA Polymerase 0.5μL,H2O 37.5μL。PCR參數(shù)：95℃預變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延長1min，循環(huán)30次；72℃延長10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，膠回收試劑盒純化。

1.3 酶切、連接與轉化

按表1酶切cDNA與pET-28a。酶切產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳分離、膠回收純化。取酶切純化的cDNA、pET-28a 各2.5μL與DNA連接試劑I 5μL，混勻，于16℃連接1h。按DH5α感受態(tài)細胞說明書，將連接產(chǎn)物進行熱激轉化，并于含卡那霉素的LB平板(LBK平板)篩選抗性菌落。

表1 DNA的酶切

1.4 鑒定重組質粒

重組質粒pET-28a-PGAM1(記為28a-PAM)按表1酶切，產(chǎn)物于0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定。酶切鑒定與預期相符重組質粒送華大基因測序。

1.5 IPTG誘導PGAM1表達與純化

按1.3的方法，將28a-PAM轉化BL21(DE3)細胞，挑抗性單菌落接種于5mL LBK培養(yǎng)基，37℃ 220r/m培養(yǎng)過夜。取過夜培養(yǎng)的菌液1mL接種于100mL LBK培養(yǎng)基，37℃ 220r/m培養(yǎng)至OD600為0.86，加入終濃度0.1mmol/L IPTG,16℃誘導培養(yǎng)24h。12 000r/min,4℃離心收集菌體。加10mL細菌蛋白抽提緩沖液(含1mmol/L PMSF)重懸細胞，以260W超聲10s停10s的程序，超聲1h裂解細胞。細胞裂解液于12 000r/min，4℃離心10min。將上清與等體積的不含咪唑的Binding Buffer混勻，得混合液。取1.5mL Ni2+填料，裝入重力純化柱，按說明書洗滌與平衡。在4℃冰箱純化PGAM1：將混合液加入純化柱，純化柱出口連接一次性輸液器管，調節(jié)流速至0.5mL/min，流出未結合蛋白。分別用含20、40mmol/L咪唑的Binding Buffer各40mL洗滌填料上的非特異性結合蛋白，再用20mL Elution Buffer洗脫PGAM1。

將純化的PGAM1裝入截留分子量10KD的超濾管，4℃ 4 000×g離心濃縮至1mL，加入9mL不含咪唑的Binding Buffer稀釋濃縮液，再次離心濃縮至1mL，重復稀釋—濃縮6次，徹底降低PGAM1溶液中的咪唑濃度。

取10μL濃縮的PGAM1，用PBS稀釋10倍，按BCA蛋白質濃度測定試劑盒測定PGAM1濃度。向剩余PGAM1中加入終濃度2mmol/L PMSF后與等體積的甘油混勻，分裝后保存于-20℃，備用。

2 結 果

2.1 PGAM1 cDNA的PCR擴增

PCR產(chǎn)物電泳結果如圖1，PCR擴增后有略大于750bp的條帶，與PGAM1 cDNA分子量(765bp)相符(泳道1)，陰性對照無擴增條帶(泳道2)。

M:DL2000 DNA marker；1:PGAM1 cDNA PCR產(chǎn)物；2:陰性對照PCR產(chǎn)物

2.2 重組質粒的鑒定

2.2.1 酶切鑒定

重組質粒28a-PAM經(jīng)NdeI+Xho I酶切后出現(xiàn)兩種DNA片段。大片段與pET-28a經(jīng)相同酶切的產(chǎn)物(圖2泳道1)相符，小片段(圖2泳道2)與PGAM1 cDNA分子量(765bp)吻合。可知PCR產(chǎn)物已插入pET-28a質粒中。

M1:1kb DNA marker；1:pET-28a Nde I+Xho I酶切產(chǎn)物；2:pET-28a-PGAM1 Nde I+Xho I酶切產(chǎn)物；M2:DL2000 DNA marker

2.2.2 測序鑒定

重組質粒DNA測序結果表明連入pET-28a中的序列與cDNA序列一致，讀碼正確，正向測序的部分信號峰如圖3所示。藍色下劃線序列為pET-28a Nde I位點，紅色箭頭序列為PGAM1的起始密碼子編碼序列。

圖3 pET-28a-PGAM1部分測序峰圖

2.3 PGAM1的表達與純化

PGAM1表達產(chǎn)物如圖4所示。0.1mmol/L IPTG誘導的28a-PAM-BL21(DE3)裂解液上清中有一條介于25～35Ku粗帶(泳道2)，與PGAM分子量(29Ku)相符，未經(jīng)IPTG誘導的菌體無此條帶(泳道1)，可見PGAM獲得了可溶性表達，經(jīng)Ni2+純化的PGAM1雜帶少，純度高。PGAM1經(jīng)超濾濃縮和緩沖液交換后，測定其濃度約為12mg/mL，可知PGAM的表達量約120mg/mL。

M:蛋白質Marker；1：28a-PAM-BL21(DE3)未經(jīng)IPTG誘導的上清；2：28a-PAM-BL21(DE3)0.2mmol/L IPTG誘導的上清；3：純化的PGAM1

3 討 論

PGAM1在多種腫瘤細胞中高表達，宋宜鵬等[11]發(fā)現(xiàn)PGAM1在胃癌組織的表達水平明顯高于癌旁組織，與胃癌臨床病理特征相關。近年已有研究認為PGAM有望成為腫瘤治療的靶點在[1]。Wang等[12]合成了一系列基于N-氧雜蒽酮酰胺基苯磺酰胺母核的PGAM1的抑制劑，其中編號為15h的化合物對PGAM1抑制活性最強，IC50約2.1μmol/L，細胞實驗表明，15h能有效抑制人非小細胞肺癌H1299細胞的增值。Liang等[6]發(fā)現(xiàn)小分子化合物HBK99通過別構抑制PGAM1，能逆轉非小細胞肺癌細胞對埃羅替尼的抗性。

本研究構建了PGAM1的原核表達載體pET28a-PGAM1，并在宿主菌BL21(DE3)中獲得了可溶性PGAM，產(chǎn)量達120mg/mL。通過大體積低濃度咪唑溶液的反復洗滌，有效去除雜蛋白，保證PGAM1的高純度。為避免咪唑對PGAM1濃度測定及酶活性的影響，本文采用反復超濾—緩沖液交換的策略，徹底降低PGAM1溶液中殘存咪唑的濃度，為后續(xù)酶活性的測定、抑制劑的篩選、蛋白質結晶和其它功能的研究奠定了堅實的基礎。

PGAM1在LKB培養(yǎng)基中，通過低濃度IPTG(0.1mmol/L)，16℃誘導培養(yǎng)24h，產(chǎn)量已達到120mg/mL，足夠后續(xù)研究對酶量的需求，無需進一步優(yōu)化其它表達條件。