李清潔，李世環(huán)，徐鳳男，周巧逢，2，龔金花，2，李敏才

(1.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學(xué)院糖尿病心腦血管病變湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

動(dòng)脈粥樣硬化疾病(atherosclerosis，AS)是常見病，是高血壓、糖尿病和慢性腎病等動(dòng)脈血管病變的基礎(chǔ)，是引起心血管疾病高發(fā)病率和高致死率的主要原因。然而AS發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，一般認(rèn)為是一種多環(huán)節(jié)參與的血管壁慢性炎癥性疾病，目前AS藥物治療也沒有明顯的特異性藥物[1]。

姜黃素(curcumin，CUR)是一種天然存在的多酚植物化學(xué)物質(zhì)，其分子式C21H20O6。這種黃色疏水化合物對(duì)人類慢性疾病如炎癥性疾病和神經(jīng)退行性疾病具有積極的治療作用。研究表明，CUR可以調(diào)節(jié)各種癌癥標(biāo)志，包括細(xì)胞無限增殖、癌癥相關(guān)的炎癥、癌癥細(xì)胞死亡、信號(hào)通路、癌癥血管生成和轉(zhuǎn)移[2]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠進(jìn)行疾病靶點(diǎn)和藥物靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)，通過分子對(duì)接篩選出藥物與疾病靶點(diǎn)的最優(yōu)結(jié)合。我們借助網(wǎng)絡(luò)藥理技術(shù)期望篩選出CUR治療AS潛在靶點(diǎn)，通過分析驗(yàn)證了EGFR、STAT3、CXCL8、CDKN-2A、BCL-2、TLR7、NOS-2、HSP902A這些評(píng)分較高基因是CUR治療AS發(fā)揮作用的治療靶點(diǎn)，并構(gòu)建了AS中的鈣化模型進(jìn)行了初步驗(yàn)證，為未來的基礎(chǔ)研究提供了新的見解及依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 獲取靶點(diǎn)

在TCMSP數(shù)據(jù)庫查找CAS編號(hào)，然后在Pubchem中輸入CAS號(hào)458-37-7，獲取對(duì)應(yīng)SMILES號(hào)；在Swisstarget prediction數(shù)據(jù)庫中輸入CUR的SMILES號(hào)，獲得CUR預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。通過Genecard、Drugbank數(shù)據(jù)庫檢索AS并相互補(bǔ)充，刪除重復(fù)值后進(jìn)行合并，獲取AS作用靶點(diǎn)。將CUR預(yù)測(cè)靶點(diǎn)和AS作用靶點(diǎn)和輸入韋恩在線軟件，得到AS和CUR共同靶點(diǎn)，利用Metoscape網(wǎng)站對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析，并構(gòu)建CUR與AS靶點(diǎn)與通路關(guān)系圖[3]。

1.2 核心基因篩選及小分子對(duì)接

利用String在線數(shù)據(jù)庫將共同靶點(diǎn)構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)模型，保存結(jié)果TSV格式輸入到Cytoscape-3.8軟件中，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，根據(jù)P<0.01篩選核心靶基因。將度值排名前七靶基因，作為對(duì)接受體。以CUR作為配體，采用Autodocktools對(duì)接，以對(duì)接評(píng)分Affinity來篩選結(jié)合活性較好的靶點(diǎn)，其中對(duì)接評(píng)分Affinity<-4.25kcal/mol認(rèn)為配體與靶點(diǎn)之間具有結(jié)合活性，得分<-5.0 kcal/mol表明結(jié)合活性較佳，得分<-7.0 kcal/mol表明兩者之間有強(qiáng)烈的對(duì)接活性[4]。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

采用大鼠原代平滑肌細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞鈣化模型，給予CUR刺激；提取蛋白、變性，Western blotting檢測(cè)靶基因表達(dá)。

1.4 動(dòng)物檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)分組為模型組和姜黃素組，每組7只大鼠。構(gòu)建血管鈣化大鼠模型，采用維生素D3肌肉注射5mg/kg和結(jié)扎內(nèi)膜損傷以及外膜粉刷氯化鈣方法，再給予CUR組喂養(yǎng)，直至三周后取材制片，鏡下觀察血管壁病變[5-6]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 共同靶點(diǎn)獲取和分析

共同靶點(diǎn)生物學(xué)分析獲取CUR預(yù)測(cè)靶點(diǎn)97個(gè)，獲取AS治療靶點(diǎn)1157個(gè)，取二者交集后獲得26個(gè)共同靶點(diǎn)。對(duì)26共同作用靶基因進(jìn)行GO分析，BP分析顯示其參與細(xì)胞遷移、代謝過程、活性氧代謝和氧化應(yīng)激損傷等生物過程(見圖1A)；MF分析表明其參與蛋白激酶、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)區(qū)域特異性結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子和氧化還原酶活性等分子功能(見圖1B)；CC表明其參與囊腔、胞漿核周區(qū)、髓鞘、基質(zhì)等細(xì)胞組分(見圖1C)；KEGG分析表明其參與JAK-STAT信號(hào)通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑拮抗、PI3K-AKT信號(hào)通路和細(xì)胞分化等通路調(diào)節(jié)(見圖1D)。

A：GO-BP生物學(xué)過程分析;B：GO-MF分子功能分析;C：CC細(xì)胞組分分析；D：KEGG通路富集分析

2.2 篩選核心基因和分子對(duì)接

篩選核心基因和分子對(duì)接將31個(gè)靶基因輸入String數(shù)據(jù)庫，其PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果(見圖2)輸入Cytoscape分析得到7個(gè)核心基因EGFR、STAT3、CXCL-8、CDKN2A、NOS2、TLR7、BCL-2(見表1)。將7個(gè)核心基因與CUR進(jìn)行分子對(duì)接，根據(jù)閾值得到6組配體-受體對(duì)接結(jié)果，其中EGFR、BCL-2、CXCL-8基因與CUR具有高結(jié)合力(見表2)，其結(jié)合位點(diǎn)三維圖見圖3。

圖2 姜黃素和動(dòng)脈粥樣硬化疾病交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

表1 核心靶點(diǎn)信息表

表2 姜黃素與關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白對(duì)接信息表

A-G圖分別是姜黃素與EGFR;CXCL-8;TLR7;STAT3;BCL-2;CDKN2A;NOS-2蛋白對(duì)接圖

2.3 CUR對(duì)平滑肌細(xì)胞鈣化模型的影響

CUR抑制平滑肌細(xì)胞鈣化以平滑肌細(xì)胞鈣化為AS模型，通過茜素紅染色檢測(cè)細(xì)胞鈣化水平[7]。與模型組相比，給予CUR濃度刺激，發(fā)現(xiàn)隨著CUR濃度不斷提高，茜素紅染色降低，表明細(xì)胞內(nèi)鈣鹽沉積逐漸下降(見圖4)。

A：對(duì)照組;B：模型組;C-D：姜黃素組2.5、10μmol/L

2.4 CUR對(duì)血管鈣化模型的影響

CUR減弱血管鈣化模型組HE染色顯示血管壁內(nèi)膜增生、結(jié)構(gòu)紊亂，鈣鹽沉積明顯；CUR給藥組血管壁結(jié)構(gòu)較為完整，鈣鹽沉積少，顯示CUR抑制血管鈣化、促進(jìn)血管壁結(jié)構(gòu)完整性(見圖5)。

A：模型組；B：姜黃素組

2.5 WESTERN檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)

CUR調(diào)節(jié)EGFR、STAT3、BCL-2表達(dá)首先我們WB檢測(cè)成骨轉(zhuǎn)錄因子RUNX-2，與對(duì)照組相比，模型組RUNX-2表達(dá)上升，表明模型構(gòu)建成功；與模型組相比，CUR組后RUNX-2表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，表明Cur抑制RUNX-2。我們進(jìn)一步檢測(cè)調(diào)節(jié)蛋白EGFR、STAT3、BCL-2表達(dá)，與模型組相比，CUR組BCL-2表達(dá)上調(diào)，提示CUR促進(jìn)了抑制凋亡蛋白表達(dá)；與模型組相比，CUR組EGFR和STAT3表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，推測(cè)CUR調(diào)節(jié)EGFR、STAT3、BCL-2對(duì)AGE-RAGE和凋亡通路產(chǎn)生干預(yù)作用，抑制血管鈣化(見圖6)。

A-D分別是RUNX2、EGFR、STST3、BCL-2蛋白表達(dá)水平(與對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；n=3)

3 討 論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究CUR干預(yù)AS的相關(guān)基因，構(gòu)建蛋白相互作用篩選出核心基因，通過分子對(duì)接分析CUR對(duì)EGFR、STAT3、BCL-2等的靶點(diǎn)作用；通過細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明Cur具有抑制鈣化作用，驗(yàn)證Cur調(diào)節(jié)EGFR、STAT3、BCL-2蛋白表達(dá)。

祖國古代醫(yī)學(xué)中，雖無AS一詞，但古籍《黃帝內(nèi)經(jīng)》中有脈絡(luò)不通、血瘀、氣滯、跛行等記載，這也許是AS病變嚴(yán)重時(shí)引起的臨床表現(xiàn)[8]，中醫(yī)認(rèn)為氣血脈絡(luò)不暢、氣血痹阻導(dǎo)致該類疾病，因此，活血化瘀法是治療AS的重要方法之一[9]。CUR是化學(xué)化瘀的常用藥物，我們選擇CUR對(duì)AS研究具有一定新穎性。

臨床研究[10]表明AS患者存在顯著病理改變，其主要病理學(xué)基礎(chǔ)為動(dòng)脈粥樣硬化和血脂代謝異常，平滑肌細(xì)胞遷移到內(nèi)膜不斷的增生，由收縮表型轉(zhuǎn)化為成骨表型，平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)變成具有合成和分泌功能的成骨樣細(xì)胞，分泌成骨相關(guān)蛋白可以促進(jìn)鈣與羥基磷灰石結(jié)合，促進(jìn)鈣鹽在血管壁沉積，導(dǎo)致血管動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展。本次研究實(shí)驗(yàn)組成骨轉(zhuǎn)錄因子RUNX-2表達(dá)上升，CUR減弱RUNX-2表達(dá)，在動(dòng)物模型中顯示CUR促進(jìn)血管壁結(jié)構(gòu)完整性，表明CUR抑制血管鈣化進(jìn)程。

我們篩選出EGFR、STAT3、BCL-2、CXCL-8核心基因，這些靶點(diǎn)可能在CUR干預(yù)AS生物過程中起關(guān)鍵作用。EGFR分布于血管上皮細(xì)胞，主要干預(yù)血管的生長、分化、增殖等，有研究[11]表明CUR可以抑制血管上皮細(xì)胞增殖。在AS血管鈣化階段存在細(xì)胞凋亡，促凋亡蛋白BAX表達(dá)上調(diào)、抑制凋亡蛋白BCL-2表達(dá)下降。本次研究表明，CUR可以下調(diào)BAX表達(dá)、上調(diào)BCL-2表達(dá)，表明CUR可能抑制VSMC凋亡。有研究[12-13]表明CUR介導(dǎo)STAT3抑制平滑肌細(xì)胞的遷移，與抑制JAK-STAT通路有關(guān)。

綜上所述，我們采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，篩選出姜黃素治療AS的相關(guān)核心靶點(diǎn)，如EGFR、STAT3等，前期分析表明這些靶點(diǎn)與細(xì)胞的生長，分化有關(guān)。預(yù)測(cè)姜黃素治療AS可能是通過這些靶點(diǎn)調(diào)控細(xì)胞的增殖與分化。WESTERN檢測(cè)了相關(guān)蛋白在不同實(shí)驗(yàn)分組情況下的蛋白表達(dá)水平，我們發(fā)現(xiàn)姜黃素影響鈣化的平滑肌細(xì)胞在相關(guān)蛋白的表達(dá)，再通過HE染色發(fā)現(xiàn)姜黃素具有減少鈣鹽沉積，減弱鈣化作用，這可能與姜黃素能夠抑制內(nèi)膜增生和抑制中膜的平滑肌細(xì)胞遷移和增殖有關(guān)。目前尚無姜黃素對(duì)治療AS的過多網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，因此，本文具有一定新穎性，但是本文也有局限性，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)本身是一類預(yù)測(cè)結(jié)果，只能作為輔助驗(yàn)證相關(guān)結(jié)論，另外姜黃素是一類難溶性物質(zhì)，難以在水中溶解，難以達(dá)到藥物濃度等原因也限制了它的使用，下一步本課題將圍繞姜黃素的難溶特性展開，準(zhǔn)備制備成納米粒，再進(jìn)行下一步的相關(guān)研究。