陶小艷，張 濤，周思旋，向清華，唐遠(yuǎn)江，趙 宇，盧昱希，史開志

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，貴陽 550004)

金蕎麥[Fagopyrumdibotrys(D. Don) Hara] 屬于蓼科蕎麥屬植物，收錄于《中華人民共和國藥典》、《中華人民共和國獸藥典》和《飼料藥物添加劑允許使用品種目錄》以及《飼料原料目錄》中，其野生品種為國家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物[1]，既可作為藥物使用，又可作為飼料以及飼料添加劑使用，適用范圍廣，應(yīng)用價(jià)值高。藥用部位塊狀根莖具有清熱解毒、排膿消腫清肺排痰等功效，歸肺經(jīng)，對(duì)呼吸系統(tǒng)疾病有一定療效，現(xiàn)代藥理研究表明，金蕎麥具有抗菌消炎、解熱鎮(zhèn)痛、抗過敏、增強(qiáng)免疫等作用[2～3]。為了保護(hù)和利用好野生金蕎麥這一優(yōu)質(zhì)植物資源，貴州省畜牧獸醫(yī)研究所以貴州黔中地區(qū)野生金蕎麥作為親本，栽培馴化而成牧草新品種“黔中金蕎麥”，其先后通過省級(jí)和國家級(jí)牧草品種審定。經(jīng)選育的“黔中金蕎麥”適應(yīng)性較強(qiáng)、營養(yǎng)價(jià)值高、抗病蟲害性強(qiáng)、耐刈割利用、易繁殖，高蛋白低纖維利于消化，是飼養(yǎng)豬、雞、等畜禽喜食的優(yōu)質(zhì)青飼牧草[4～5]。艾蓉等以“黔中金蕎麥”替代部分精糧飼喂豬和雞，發(fā)現(xiàn)可降低養(yǎng)殖成本、提高經(jīng)濟(jì)收益[6]。鄧蓉等評(píng)價(jià)“黔中金蕎麥”的種草養(yǎng)畜社會(huì)生態(tài)效益，發(fā)現(xiàn)“黔中金蕎麥”的種植不僅可以提高種植經(jīng)濟(jì)效益，還可提高土壤肥力、改善水土流失[7]?，F(xiàn)已廣泛種植并應(yīng)用于貴州省六盤水、大方、黔西、威寧、息烽等10余個(gè)縣(市)的生態(tài)畜牧養(yǎng)殖，取得了一定成效[8]。

金蕎麥中的化學(xué)成分多以酚酸類、黃酮類和萜類為主，發(fā)揮的作用也多是這些化合物。“黔中金蕎麥”作為藥飼兼用、綠色環(huán)保的優(yōu)質(zhì)牧草，化學(xué)成分也比較豐富，但金蕎麥在中國藥典中的含量測定標(biāo)準(zhǔn)是表兒茶素(C15H14O6)，評(píng)價(jià)指標(biāo)太過單一，無法全面來評(píng)價(jià)金蕎麥的質(zhì)量，因此,本試驗(yàn)以大中小極性的黃酮類物質(zhì)及物質(zhì)總和為指標(biāo)來綜合評(píng)價(jià) “黔中金蕎麥”的質(zhì)量，采用高效液相色譜法同時(shí)測定“黔中金蕎麥”與野生金蕎麥中表兒茶素、原花青素B2、蘆丁和槲皮素4種成分的含量，旨在建立一種簡便快捷、準(zhǔn)確可靠的質(zhì)控方法，以及分析“黔中金蕎麥”與野生金蕎麥在這4種成分含量上的差異，有效控制藥材的內(nèi)在質(zhì)量，充分保障其藥用價(jià)值。此試驗(yàn)試驗(yàn)亦可為“黔中金蕎麥”作為藥用資源選育、飼料添加劑開發(fā)以及用于臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)藥材 2020 年于貴州省畜牧獸醫(yī)研究所麥坪試驗(yàn)基地分別選擇種源、栽培環(huán)境和管理?xiàng)l件一致的1～3年生及不同季節(jié)栽培地采集“黔中金蕎麥”塊根樣品共5份；從麥坪試驗(yàn)基地遷至黔西種植的“黔中金蕎麥”塊根樣品1份；在龍里、丹寨、普安、關(guān)嶺和羅甸等收集野生金蕎麥塊根共5份，采自石柱(重慶)和云南的野生金蕎麥塊根樣品共2份，總計(jì)13份樣品。

1.2 試驗(yàn)儀器與耗材 LC-20A高效液相色譜儀(SIL-20A 自動(dòng)進(jìn)樣器，SPD-20A 檢測器，日本島津公司)；C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，日本GL Sciences公司)；電子天平(A-R1140，瑞士梅特勒-托利多上海有限公司公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(N-1300，上海愛朗儀器有限公司)；恒溫?cái)?shù)字顯示水浴鍋(HH-6，科密儀器儀表有限公司)；超聲波清洗機(jī)(JT-410HT，深圳市潔拓超聲波清洗設(shè)備有限公司)；0.45 μm微孔濾膜(島津(上海)實(shí)驗(yàn)器材有限公司)；聚酰胺(30-60目，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 試驗(yàn)試劑與藥品 無水乙醇(分析純，重慶川東化工(集團(tuán))有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，德國默克公司)；磷酸(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)；表兒茶素、原花青素B2和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(編號(hào)：C100865、C100664和C100001，貴州迪大科技有限公司)，槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：ALT600928，天津阿爾塔科技有限公司)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備 精密稱量原花青素B2標(biāo)準(zhǔn)品0.0100 g、表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品0.0100 g、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.0100 g、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品0.0100 g，分別加適量色譜甲醇于10 mL的容量瓶中，超聲溶解后定容，得各標(biāo)準(zhǔn)品溶液母液，備用。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取干燥、粉碎后的藥材2.00 g于燒瓶中，加80%乙醇40 mL，浸泡過夜，加熱回流提取2 h，過濾后取全部濾液于水浴鍋上揮干，加色譜甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至10 mL的容量瓶中，定容，離心取上清液5 mL過聚酰胺柱，先用50 mL的蒸餾水洗脫，棄掉水洗液，再用150 mL的無水乙醇洗脫，濃縮醇洗液，溶解、轉(zhuǎn)移、定容至10 mL的容量瓶中，得供試品溶液，進(jìn)樣前搖勻，并用0.45 μm的微孔濾膜過濾，備用。

2.3 色譜條件 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，乙腈(A)-0.4%磷酸水(B)梯度洗脫，進(jìn)樣量10 μL，檢測波長254 nm，溫度30 ℃。梯度洗脫見表1。

激勵(lì)是給學(xué)生最好的動(dòng)力，老師在課堂教育時(shí)營造情境氛圍，用激勵(lì)的語言去指導(dǎo)學(xué)生，從而讓學(xué)生產(chǎn)生對(duì)體育學(xué)習(xí)的興趣。激勵(lì)教學(xué)就是要做到理性和感性相結(jié)合，學(xué)生在一種輕松的環(huán)境下學(xué)習(xí)，有嚴(yán)有松，既能鍛煉身體，又能培養(yǎng)自身的服從命令聽指揮的意識(shí)。在學(xué)生碰到一些狀況時(shí)，老師千萬不要用一些嘲笑不友好的態(tài)度對(duì)待學(xué)生，要曉之以理，動(dòng)之以情，幫助學(xué)生解決狀況，尊重學(xué)生，讓學(xué)生在激勵(lì)的語言下取得更大的進(jìn)步。

表1 梯度洗脫條件Tab 1 Procedore of gradient elution

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性關(guān)系考察 取適量原花青素B2、表兒茶素、蘆丁和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品溶液母液，分別配置成5、25、45、65、85 μg/mL的濃度梯度溶液， 5、10、20、40、80 μg/mL的濃度梯度溶液， 0.5、1、2、4、8 μg/mL的濃度梯度溶液， 0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 μg/mL的濃度梯度溶液，按2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，測定原花青素B2、表兒茶素、蘆丁和槲皮素的峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.2 精密度考察 精密吸取含原花青素B2100 μg/mL、表兒茶素100 μg/mL、蘆丁100 μg/mL、槲皮素100 μg/mL的混合對(duì)照品溶液10 μL，按2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，重復(fù)6次，記錄色譜圖，測定峰面積，計(jì)算其RSD值。

2.4.3 重復(fù)性考察 精密稱“黔中金蕎麥”(黔西)的干燥粉末6份，每份約2.00 g，按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，測定原花青素B2、表兒茶素、蘆丁和槲皮素的峰面積，計(jì)算其RSD值。

2.4.4 穩(wěn)定性考察 精密吸取“黔中金蕎麥”(黔西)制成的供試品溶液10 μL，在室溫下放置，分別于0、2、4、6、8、12 h按2.3項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，測定原花青素B2、表兒茶素、蘆丁和槲皮素的峰面積，計(jì)算其RSD值。

2.4.5 回收率測試 采用加樣回收法，精密稱取6份已知含量的黔中金蕎麥(黔西產(chǎn))約1 g，分別精密加入混合對(duì)照品20 mL(用色譜甲醇配置成的含原花青素B234 μg/mL、表兒茶素18.75 μg/mL、蘆丁3.45 μg/mL、槲皮素0.85 μg/mL)，按2.2項(xiàng)方法提取制備供試品，按2.3項(xiàng)色譜條件測定，計(jì)算其峰面積。

2.4.6 樣品測試 取測試試驗(yàn)藥材按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，測定原花青素B2、表兒茶素、蘆丁和槲皮素的峰面積，根據(jù)各對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 線性關(guān)系考察 以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制各對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，各對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：原花青素B2：y=1922.3x-192.8(r2=0.9998)；表兒茶素：y=2190.3x-119(r2=0.9998)；蘆?。簓=22572x+652(r2=0.9996)；槲皮素：y=33687x-89.8(r2=0.9999)。

3.2 精密度考察 原花青素B2、表兒茶素、蘆丁、槲皮素峰面積的RSD分別為0.14%、0.10%、0.09%、0.07%(n=6)，表明所用儀器精密度良好。

3.3 重復(fù)性考察 原花青素B2、表兒茶素、蘆丁、槲皮素峰面積的RSD分別為0.83%、1.09%、0.74%、1.50%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

3.4 穩(wěn)定性考察 原花青素B2、表兒茶素、蘆丁、槲皮素峰面積的RSD分別為0.88%、0.80%、1.62%、1.28%(n=6)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.5 回收率試驗(yàn) 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果顯示：原花青素B2、表兒茶素、蘆丁和槲皮素的平均回收率分別為98.37%、98.68%、96.11%和97.56%，RSD分別為1.02%、1.00%、1.18%和1.01%。以上結(jié)果表明此方法檢測“黔中金蕎麥”中原花青素B2、表兒茶素、蘆丁和槲皮素的含量可靠、穩(wěn)定。加樣回收率測試結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)(n=6)Tab 2 Sample recovery test(n=6)

3.6 樣品測試 以2.3項(xiàng)下的色譜條件對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)品及各供試品進(jìn)行色譜測定，色譜圖如圖1所示。

1-原花青素B2，2-表兒茶素，3-蘆丁，4-槲皮素

3.6.1 “黔中金蕎麥”與不同產(chǎn)地野生金蕎麥的成分含量 對(duì)采自貴州省內(nèi)不同產(chǎn)地及云南、重慶的野生金蕎麥與“黔中金蕎麥”1年生根莖供試品溶液按照2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，檢測結(jié)果見表3。

從表3中可以看出：在此試驗(yàn)方法下除關(guān)嶺和羅甸產(chǎn)的野生金蕎麥未檢測到槲皮素外，其余樣品均檢測出4種指標(biāo)成分?！扒薪鹗w麥”4種成分的總含量高于除丹寨外的其他野生金蕎麥，采自黔西的“黔中金蕎麥”總含量(1189.70 μg/g)優(yōu)于采自麥坪的“黔中金蕎麥”(1108.01 μg/g)?！扒薪鹗w麥”和黔產(chǎn)的各地野生金蕎麥的含量各不相同，且具有一定差異。原花青素B2和蘆丁的含量“黔中金蕎麥”最高，采自黔西的分別為710.27、71.69 μg/g，采自麥坪的分別為798.79、65.47 μg/g，其中采自麥坪的原花青素B2含量最高(798.79 μg/g)，采自黔西的蘆丁含量和槲皮素含量最高(71.69、17.91 μg/g)；除龍里產(chǎn)的野生金蕎麥槲皮素含量(15.11 μg/g)高于采自麥坪的“黔中金蕎麥”(7.81 μg/g)，采自丹寨的野生金蕎麥表兒茶素含量高最高(588.00 μg/g)外，“黔中金蕎麥”的表兒茶素和槲皮素的含量均高于其他野生金蕎麥。

表3 “黔中金蕎麥”與不同產(chǎn)地野生金蕎麥中4種成分含量(n=2)Tab 3 Contents of 4 components in "Qianzhong Golden Buckwheat" and wild from different origins (n=2)

3.6.2 生長年限對(duì)“黔中金蕎麥”的化學(xué)成分含量的影響 對(duì)采自麥坪不同生長年限的“黔中金蕎麥”根莖供試品溶液按照2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，檢測結(jié)果見表4。

表4 不同生長年限的“黔中金蕎麥”中4種成分含量(n=2)Tab 4 Contents of 4 components in "Qianzhong Golden Buckwheat" with different growth years (n=2)

表4的試驗(yàn)結(jié)果顯示：在4種指標(biāo)成分含量上，前3種成分含量在第2年采收時(shí)含量達(dá)到最高，總含量也達(dá)最高，槲皮素含量無明顯規(guī)律性變化，第3年含量最高，有逐年累計(jì)的可能，或者是在生長過程中，蘆丁受影響發(fā)生水解產(chǎn)生槲皮素，造成槲皮素含量升高，但第3年時(shí)4種成分總含量急劇減少。為充分利用資源，且考慮其總體成分含量以及治療作用，故適宜在“黔中金蕎麥”生長第2年時(shí)采收。

3.6.3 采收時(shí)間對(duì)“黔中金蕎麥”化學(xué)成分含量的影響 對(duì)不同時(shí)間采收的“黔中金蕎麥”根莖供試品溶液按照2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，檢測結(jié)果見表5。

表5 不同采收時(shí)間的“黔中金蕎麥”中4種成分含量(n=2)Tab 5 Contents of 4 components in "Qianzhong Golden Buckwheat" at different harvest times (n=2)

表5結(jié)果顯示：不同采收時(shí)間對(duì)4種指標(biāo)成分含量的影響未呈現(xiàn)出一定的趨勢，6月份與12月份采收在總含量上差異不明顯，總體綜合來看12月采收較好，不僅成分含量高，且金蕎麥地上部分也具有一定的經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值，能在冬季枯死之前地上部分作為青綠飼料加以利用，降低養(yǎng)殖成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。

綜合評(píng)價(jià)，在此試驗(yàn)方法下，“黔中金蕎麥”的物質(zhì)含量豐富，品質(zhì)佳，其中以來自黔西的“黔中金蕎麥”在此4種指標(biāo)成分評(píng)價(jià)下，品質(zhì)最佳。以12月份、2年生的“黔中金蕎麥”采收最適宜，活性物質(zhì)成分含量高。

4 討論與結(jié)論

金蕎麥中物質(zhì)成分豐富、復(fù)雜，含有各類化學(xué)成分，主要是多酚類、黃酮類、甾體類和萜類等化學(xué)成分，以較大極性類物質(zhì)居多，具有治療糖尿病、抗癌、抗氧化、抗菌以及增強(qiáng)免疫等多種藥理作用，是一種具有良好開發(fā)前景的中藥。金蕎麥中含有大量黃酮類物質(zhì)，如表兒茶素、蘆丁、槲皮素、異鼠李素、兒茶素和原花青素B2等黃酮單聚體和一些二聚體等物質(zhì)[9]，黃仁術(shù)等[10]研究發(fā)現(xiàn)其中表兒茶素具有明顯抗菌消炎作用，黔中金蕎麥中表兒茶素含量較高，達(dá)到中國藥典含量測定要求，而丹寨產(chǎn)的野生金蕎麥中表兒茶素含量近乎是藥典標(biāo)準(zhǔn)的兩倍。馮黎莎、王立波等[11-12]研究發(fā)現(xiàn)金蕎麥的根莖和莖葉都具有一定的抑制細(xì)菌和真菌的作用，且金蕎麥中的黃酮以及多酚類化合物對(duì)乙型溶血性鏈球菌和肺炎球菌具有抑制作用。還可以保護(hù)由肺炎球菌菌株所致的小鼠感染，可能與其中的原花青素B2對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用有關(guān)[13]；同時(shí)，金蕎麥中的多酚類和黃酮類物質(zhì)還具有較強(qiáng)的總抗氧化能力和抗脂質(zhì)過氧化作用[14-15]。程友斌等[16]對(duì)金蕎麥不同提取部位進(jìn)行抗炎測試研究，發(fā)現(xiàn)氯仿和水液為抗炎活性部位，具有顯著的抗炎作用，推測其活性物質(zhì)可能是中等極性和較大極性類型的物質(zhì)成分，如黃酮類、多酚類以及萜類等類型的物質(zhì)，具體的活性物質(zhì)類型還需進(jìn)一步研究。金蕎麥具有很好的、廣泛的藥理作用，體現(xiàn)出其巨大的藥用價(jià)值，從各研究中可以看出，其藥理作用與其植物體內(nèi)的黃酮類、酚酸類、萜類等物質(zhì)有極大關(guān)系。在此試驗(yàn)中可以看出，“黔中金蕎麥”黃酮類物質(zhì)總含量高于野生金蕎麥，尤其是槲皮素含量較高，可能在藥理作用和療效方面也存在一定的優(yōu)勢，具有良好的藥用價(jià)值，為其作為藥用資源開發(fā)利用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

黔產(chǎn)的野生金蕎麥含量各不相同，差異較大，質(zhì)量不穩(wěn)定，成分總含量低，但丹寨野生金蕎麥總含量顯著高于其他野生金蕎麥，可能和貴州各地區(qū)海拔梯度有關(guān)，進(jìn)而影響陽光、水分等吸收，以及土壤、環(huán)境等差異，導(dǎo)致植物物質(zhì)成分的差異，體現(xiàn)出貴州地勢地理環(huán)境的多樣性，從而導(dǎo)致植物物質(zhì)成分的多樣性。而采自黔西和麥坪兩地的“黔中金蕎麥”在此試驗(yàn)條件下顯示，在總含量上差異不明顯，各成分含量均較高，優(yōu)于黔產(chǎn)野生金蕎麥，也優(yōu)于云南與重慶產(chǎn)的野生金蕎麥，且質(zhì)量穩(wěn)定，體現(xiàn)出自主選育的“黔中金蕎麥”的優(yōu)勢、價(jià)值和意義。

本試驗(yàn)建立了以HPLC同時(shí)測定“黔中金蕎麥”中原花青素B2、表兒茶素、蘆丁和槲皮素4種成分含量的方法，適用于 “黔中金蕎麥”的含量測定，也可用于“黔中金蕎麥”的質(zhì)量控制?！扒薪鹗w麥”活性物質(zhì)豐富、總黃酮含量高，質(zhì)量穩(wěn)定，符合中國藥典和中國獸藥典對(duì)金蕎麥的含量測定標(biāo)準(zhǔn)，即表兒茶素含量(C15H14O6)≥0.03%(按干燥品計(jì)算)，可為該藥材在臨床的應(yīng)用奠定物質(zhì)基礎(chǔ)?！扒薪鹗w麥”作為一種高蛋白低纖維、營養(yǎng)豐富的牧草資源，采用本試驗(yàn)建立的檢測方法明確其內(nèi)控質(zhì)量，可大面積示范推廣種植，運(yùn)用于畜禽養(yǎng)殖具有一定的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。