張 妤,孫冰清,姜 芹,顧 欣,吳雨珊,張文剛,商 軍

(上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103)

腸球菌(Enterococcus)屬于革蘭氏陽(yáng)性球菌，廣泛存在于土壤、植物以及人類(lèi)和動(dòng)物胃腸道中，是人類(lèi)及動(dòng)物腸道中常見(jiàn)菌群之一，也是條件致病菌，可引起人及動(dòng)物多種疾病[1-2]。腸球菌具有堅(jiān)厚的細(xì)胞壁，對(duì)頭孢菌素、氨基糖苷類(lèi)等多種抗菌藥物天然耐藥，同時(shí)它可通過(guò)質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子-基因盒系統(tǒng)等方式從其他細(xì)菌獲取耐藥基因，從而產(chǎn)生獲得性耐藥[3]。腸球菌屬中較為常見(jiàn)的是糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)和屎腸球菌(EnterococcusFaecium)[4]。糞腸球菌常被報(bào)道為致病性或潛在致病性細(xì)菌的耐藥基因貯藏庫(kù)[5]。同時(shí)，腸球菌引起的感染病例中，屎腸球菌的感染比例呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)[6]。中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)統(tǒng)計(jì)顯示，醫(yī)院臨床病例中分離得到的腸球菌多重耐藥現(xiàn)象十分嚴(yán)重[7]。耐藥腸球菌的產(chǎn)生增加了臨床抗感染工作的難度，也逐漸成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。由于動(dòng)物源腸球菌的耐藥基因存在著可能通過(guò)養(yǎng)殖環(huán)節(jié)、屠宰環(huán)節(jié)及食物鏈等多種途徑傳播的風(fēng)險(xiǎn)，因此，對(duì)人類(lèi)健康造成潛在威脅，給養(yǎng)殖業(yè)也帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)。為了解近年來(lái)上海市動(dòng)物源腸球菌耐藥情況及MIC(minimal inhibitory concentration)變遷情況，擬選擇豬、雞、牛養(yǎng)殖場(chǎng)為研究對(duì)象，對(duì)常見(jiàn)10種抗菌藥物的耐藥性進(jìn)行監(jiān)測(cè)與分析，并計(jì)算得到MIC50與MIC90。MIC為最小抑制病原微生物生長(zhǎng)的藥物濃度，相對(duì)應(yīng)的MIC50和MIC90分別指抑制50%和90%病原微生物生長(zhǎng)的抑菌濃度，常用于衡量抗菌藥物抵抗病原微生物的能力[8]。因此，開(kāi)展動(dòng)物源糞腸球菌、屎腸球菌耐藥性監(jiān)測(cè)，可了解上海地區(qū)動(dòng)物源腸球菌耐藥性本底情況，為抗菌藥物使用的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。通過(guò)比較五年間MIC50和MIC90的變遷情況，可掌握本市糞腸球菌及屎腸球菌對(duì)不同藥物的耐藥發(fā)展趨勢(shì)，對(duì)遏制腸球菌耐藥、保障公共衛(wèi)生安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株 458株糞腸球菌及283株屎腸球菌，分離自2017～2021年自上海地區(qū)21家養(yǎng)殖場(chǎng)(2家牛場(chǎng)、7家雞場(chǎng)、12家豬場(chǎng))的豬/牛肛門(mén)、雞泄殖腔拭子，凍存于-80 ℃冰箱。糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29212(美國(guó)菌種保藏中心)。

1.1.2 試劑與儀器 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(tryptose soya agar,TSA)、陽(yáng)離子調(diào)節(jié)MH肉湯(cationadjusted Mueller-Hinton broth,CAMHB)(青島海博公司)；0.9%生理鹽水(121 ℃高壓滅菌30 min)；凍干型革蘭氏陽(yáng)性菌藥敏板，內(nèi)含慶大霉素(gentamicin,GM)、阿莫西林/克拉維酸(amoxicillin,AMC)、青霉素(penicillin,P)、頭孢西丁(cefoxitin,FOX)、頭孢噻呋(ceftiofur,XNL)、氧氟沙星(ofloxacin,OFX)、恩諾沙星(enrofloxacin, ENR)、氟苯尼考(florfenicol,FFC)、萬(wàn)古霉素(vancomycin,VA)、利奈唑胺(linezolid,LNZ)等10種抗菌藥物(復(fù)興診斷科技(上海)有限公司)；比濁儀、Sensititre AIM全自動(dòng)菌液接種儀(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 腸球菌抗菌藥物敏感性測(cè)試 將凍存的腸球菌接種至TSA上，36 ℃培養(yǎng)18 h，挑取2～3個(gè)新鮮培養(yǎng)的單菌落，置于3 mL滅菌生理鹽水中，使用比濁儀將細(xì)菌濃度調(diào)整至0.48～0.52麥?zhǔn)蠁挝?，含菌量約為1 × 108CFU/mL，隨后使用CAMHB進(jìn)行200倍稀釋?zhuān)臃N于含不同藥物濃度的96 孔凍干型細(xì)菌藥敏板中，每孔100 μL，置于36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，分別設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照孔(加入待測(cè)菌液)、陰性孔(加入無(wú)菌CAMHB)。同時(shí)使用糞腸球菌ATCC 29212進(jìn)行藥敏測(cè)定作為質(zhì)控。

1.2.2 結(jié)果判讀 自培養(yǎng)箱中取出藥敏板，置于襯有黑底板的光線下肉眼觀察結(jié)果。依據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)抗菌藥物敏感性結(jié)果進(jìn)行判讀，判讀標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。S(Susceptible)是指細(xì)菌對(duì)抗菌藥敏感，當(dāng)MIC值小于表1中抗菌藥物臨床折點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn)所示值時(shí)，則判為S；R(Resistance)是指細(xì)菌對(duì)某種抗菌藥耐藥, 當(dāng)MIC值大于表1中抗菌藥物臨床折點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn)所示值時(shí)，則判為R;I(Intermediate)是指細(xì)菌對(duì)抗菌藥中度敏感，當(dāng)MIC值為表1中抗菌藥物臨床折點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn)所示區(qū)間或者不為S或R時(shí)，則判為I[9]。藥敏板上陰性對(duì)照孔內(nèi)應(yīng)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，液體未見(jiàn)渾濁；陽(yáng)性對(duì)照孔內(nèi)有細(xì)菌生長(zhǎng)，液體渾濁，且質(zhì)控菌株的 MIC 值在規(guī)定的范圍內(nèi)，則藥敏板結(jié)果有效。

表1 腸球菌對(duì)常見(jiàn)抗菌藥物的折點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控菌株MIC范圍Tab 1 Break point criteria of Enteroccus against common antibiotics and MIC range of quality control strains

2 結(jié)果與分析

2.1 腸球菌耐藥率比較 結(jié)果顯示，糞腸球菌及屎腸球菌均對(duì)頭孢西丁(99.6%，95.4%)、氧氟沙星(93.0%，59.8%)及頭孢噻呋(89.3%，65.4%)的較為耐藥；對(duì)青霉素(4.8%，10.6%)、阿莫西林/克拉維酸(0.4%，2.8%) 較為敏感；未分離到耐萬(wàn)古霉素的腸球菌。兩種腸球菌對(duì)氟苯尼考(59.8%，24.2%)、慶大霉素(56.1%，12.0%)、利奈唑胺(48.3%，4.9%)、恩諾沙星(33.2%，17.3%)的耐藥率存在較大差異，且糞腸球菌比屎腸球菌更為耐藥。動(dòng)物源糞腸球菌及屎腸球菌對(duì)10種抗菌藥物的耐藥率結(jié)果見(jiàn)圖1所示。

圖1 糞腸球菌及屎腸球菌對(duì)10種抗菌藥物的耐藥率Fig 1 The resistance rates of E.faecalis and E.faecium to 10 kinds of antibiotics

2.2 腸球菌MIC變遷情況

2.2.1 β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物 2017-2021年β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物對(duì)糞腸球菌的MIC值見(jiàn)表2、表3。五年間，頭孢噻呋MIC50保持在32 μg/mL，MIC90在2017年有所上升后，近年來(lái)呈下降趨勢(shì)；阿莫西林/克拉維酸MIC502017年由2 μg/mL下降至0.5 μg/mL后均保持在該水平，同時(shí)MIC90呈下降趨勢(shì)，由16 μg/mL下降至1 μg/mL。

表2 2017-2021年頭孢噻呋及阿莫西林/克拉維酸對(duì)糞腸球菌MIC值(μg/mL)Tab 2 MIC values of ceftiofur and amoxicillin/ clavulanate potassium against E.faecalis (μg/mL)

表3 2017-2021年青霉素及頭孢西丁對(duì)糞腸球菌MIC值(μg/mL)Tab 3 MIC values of penicillin and cefoxitin against E.faecalis (μg/mL)

青霉素、苯唑西林、頭孢西丁對(duì)糞腸球菌的MIC值均較為穩(wěn)定，其中青霉素MIC50保持在4 μg/mL，MIC90雖比2017、2018年有所上升，但整體仍保持在4 μg/mL；糞腸球菌對(duì)苯唑西林及頭孢西丁有較高耐藥，五年間，苯唑西林MIC50及MIC90均為≥4 ug/mL，苯唑西林MIC50及MIC90均為≥128 μg/mL。

2017-2021年β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物對(duì)屎腸球菌的MIC值見(jiàn)表4、表5。五年間，青霉素、阿莫西林/克拉維素的MIC50均較為穩(wěn)定，MIC90均呈下降趨勢(shì)，其中青霉素MIC50保持在4～8 μg/mL，MIC90由256 μg/mL下降至4 μg/mL；阿莫西林/克拉維酸MIC50保持在0.25～0.5 μg/mL，MIC90由64 μg/mL下降至1 μg/mL。

表4 2017-2021年青霉素及阿莫西林/克拉維酸對(duì)屎腸球菌MIC值(μg/mL)Tab 4 MIC values of penicillin and amoxicillin/clavulanate potassium against E.faecium (μg/mL)

表5 2017-2021年頭孢噻呋及頭孢西丁對(duì)屎腸球菌MIC值(μg/mL)Tab 5 MIC values of ceftiofur and cefoxitin against E.faecium (μg/mL)

苯唑西林對(duì)屎腸球菌的MIC值較為穩(wěn)定，MIC50及MIC90均保持在大于4 μg/mL；而頭孢噻呋及頭孢西丁的耐藥性變化趨勢(shì)較為相似，其中頭孢噻呋的MIC50于2018年下降至4 μg/mL，2019年有所上升，2021年下降至32 μg/mL，MIC902018年下降至128 μg/mL后又再次回升至256 μg/mL；頭孢西丁MIC50于2019年有所上升，后由32 μg/mL下降至16 μg/mL，MIC90由大于128 μg/mL下降至32 μg/mL。

2.2.2 氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥物 2017-2021年氟喹諾酮類(lèi)藥物對(duì)糞腸球菌的MIC值見(jiàn)表6。五年間，恩諾沙星的MIC50處于較低水平保持在1～2 μg/mL，MIC90則保持在大于64 μg/mL；氧氟沙星的MIC50由16 μg/mL降為4 μg/mL，MIC90于2020年由256 μg/mL降為64 μg/mL。

表6 2017-2021年恩諾沙星及氧氟沙星對(duì)糞腸球菌MIC值(μg/mL)Tab 6 MIC values of enrofloxacin and ofloxacin against E.faecalis (μg/mL)

2017-2021年氟喹諾酮類(lèi)藥物對(duì)屎腸球菌的MIC值見(jiàn)表7。五年間，恩諾沙星及氧氟沙星的MIC50均處于較低水平，恩諾沙星保持在0.5～2 μg/mL，氧氟沙星保持在2～4 μg/mL；MIC90均于2017年有所上升，恩諾沙星上升至64 μg/mL，氧氟沙星上升至256 μg/mL，兩者近年來(lái)均處于下降趨勢(shì)，恩諾沙星為波動(dòng)下降，2021年降為4 μg/mL，氧氟沙星于2017年上升至256 μg/mL，后下降至8 μg/mL保持至今。

表7 2017-2021年恩諾沙星及氧氟沙星對(duì)屎腸球菌MIC值(μg/mL)Tab 7 MIC values of enrofloxacin and ofloxacin against E.faecium (μg/mL)

2.2.3 氨基糖苷類(lèi)、氯霉素類(lèi)、糖肽類(lèi)、唑烷酮類(lèi)抗菌藥物 2017-2021年慶大霉素、氟苯尼考、利奈唑胺及萬(wàn)古霉素對(duì)糞腸球菌的MIC值見(jiàn)表8。五年間，慶大霉素的MIC50為上升趨勢(shì)，MIC90均保持在大于2048 μg/mL；氟苯尼考MIC50保持在32～64 μg/mL，MIC90為下降趨勢(shì)，由128 μg/mL下降至64 μg/mL；利奈唑胺的MIC50保持在4～8 μg/mL，MIC90保持在8 μg/mL；萬(wàn)古霉素的MIC50和MIC90五年來(lái)均較為穩(wěn)定，期間略有浮動(dòng)，MIC50保持在1 μg/mL， MIC90保持在2 μg/mL。

表8 2017-2021年慶大霉素、氟苯尼考、利奈唑胺及萬(wàn)古霉素對(duì)糞腸球菌MIC值(μg/mL)Tab 8 MIC values of gentamicin, florfenicol, linezolid and vancomycin against E.faecalis (μg/mL)

2017-2021年慶大霉素、氟苯尼考、利奈唑胺及萬(wàn)古霉素對(duì)屎腸球菌的MIC值見(jiàn)表9。五年間，慶大霉素的MIC50為下降趨勢(shì)，由8 μg/mL下降至4 μg/mL，MIC90于2018年上升至512 μg/mL，近年來(lái)為波動(dòng)下降，2021年下降至8 μg/mL；氯霉素類(lèi)抗菌藥物氟苯尼考MIC50及MIC90均為下降趨勢(shì)，MIC50由64 μg/mL下降至2 μg/mL，MIC90由128 μg/mL下降至4 μg/mL；利奈唑胺的MIC50保持在2 μg/mL，MIC90由8 μg/mL降為2 μg/mL；萬(wàn)古霉素的MIC50和MIC90五年來(lái)均較為穩(wěn)定， MIC50保持在0.5～ 1 μg/mL， MIC90保持在1～2 μg/mL。

3 分析與討論

腸球菌是人與動(dòng)物腸道正常的棲息菌，近年來(lái)逐漸證實(shí)具有致病能力，臨床上可引起嚴(yán)重的感染和疾病，如心內(nèi)膜炎、菌血癥、泌尿系統(tǒng)等，也可感染雞、鴨、豬、牛、羊、水產(chǎn)品等多種食品動(dòng)物，導(dǎo)致疾病發(fā)生[10-14]。動(dòng)物源腸球菌的耐藥基因可通過(guò)養(yǎng)殖環(huán)境、食物鏈等傳遞給人。此外，有研究表明，耐藥腸球菌的耐藥基因可在質(zhì)粒等移動(dòng)元件介導(dǎo)水平傳播給其他病原菌，給人類(lèi)健康和公共衛(wèi)生帶來(lái)威脅[15]。

3.1 腸球菌耐藥性比較 整體看來(lái)，上海地區(qū)動(dòng)物源糞腸球菌耐藥性比屎腸球菌更為嚴(yán)重。糞腸球菌和屎腸球菌均對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物中的頭孢類(lèi)藥物有高耐藥率(65%～99%)，這可能與腸球菌對(duì)頭孢類(lèi)藥物具有固有耐藥性有關(guān)[16],這也與河南地區(qū)李金磊等[17]、東北地區(qū)李延山等[18]的結(jié)果一致；兩者對(duì)青霉素、阿莫西林/克拉維酸敏感，耐藥率較低(均低于15%)，與東北地區(qū)李延山等[18]的結(jié)果一致，但四川地區(qū)張國(guó)明等[19]、寧夏地區(qū)王文等[20]的研究均顯示腸球菌對(duì)青霉素均較為耐藥(均高于50%)，這可能與養(yǎng)殖場(chǎng)用藥有關(guān)，說(shuō)明腸球菌的耐藥情況存在著地域差異；根據(jù)喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥結(jié)果，兩者均對(duì)氧氟沙星更為耐藥(58%～93%)，對(duì)恩諾沙星更為敏感(17%～34%)，與新疆地區(qū)陳萬(wàn)昭等[21]的研究結(jié)果一致；根據(jù)氨基糖苷類(lèi)及氯霉素類(lèi)藥物的耐藥結(jié)果，糞腸球菌更為耐藥，對(duì)慶大霉素(56.1%)及氟苯尼考(59.8%)的耐藥率均高于屎腸球菌(慶大霉素12.0%，氟苯尼考24.2%)。

值得注意的是，糞腸球菌對(duì)利奈唑胺的耐藥率為48.3%，屎腸球菌為4.9%。利奈唑胺是治療由多重耐藥革蘭氏陽(yáng)性菌包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和耐萬(wàn)古霉素腸球菌(VRE)引起嚴(yán)重感染的重要藥物[22]，而養(yǎng)殖場(chǎng)治療用藥中并無(wú)利奈唑胺。由于利奈唑胺是一種細(xì)菌蛋白質(zhì)合成抑制劑，抑制蛋白質(zhì)合成的初始階段，不影響翻譯起始tRNA的形成、延伸與終止階段，和以往抗菌藥物抑制蛋白合成的作用方式不同[23]，因此,利奈唑胺與其他抗菌藥物不易發(fā)生交叉耐藥，在體外也不易誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥[24]。故造成上海地區(qū)動(dòng)物源糞腸球菌利奈唑胺較高耐藥率的原因可能有二：一是其自身發(fā)生了23S rRNA V區(qū)突變，此突變?yōu)樽钪饕哪退帣C(jī)制，且糞腸球菌比屎腸球菌更容易被誘導(dǎo)突變[25]；二是耐藥基因發(fā)生轉(zhuǎn)移，如氯霉素-氟甲砜霉素耐藥(cfr)基因(可能來(lái)自于耐氟苯尼考的菌株)、cfr(B)基因及optrA基因，該類(lèi)耐藥多通過(guò)外源性質(zhì)粒介導(dǎo)[24]。研究表明，動(dòng)物源腸球菌很可能作為耐藥基因的貯存庫(kù)，成為crf、cfr(B)、optrA基因等耐藥基因的潛在來(lái)源，通過(guò)耐藥基因的克隆擴(kuò)增或水平轉(zhuǎn)移在環(huán)境中傳播[26-27]。本研究未發(fā)現(xiàn)耐萬(wàn)古霉素腸球菌(VRE)，但仍應(yīng)嚴(yán)格控制藥物的使用，避免交叉耐藥，防止VRE的出現(xiàn)。

隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，開(kāi)展動(dòng)物源性食品的耐藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估勢(shì)在必行，耐藥率本底情況為耐藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估計(jì)算中不可或缺的一部分[28]，本研究結(jié)果為細(xì)菌耐藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了數(shù)據(jù)支撐。

3.2 腸球菌MIC變遷分析 根據(jù)MIC變遷結(jié)果，2017～2021年上海地區(qū)動(dòng)物源糞腸球菌對(duì)阿莫西林/克拉維酸、氧氟沙星的MIC50及MIC90均呈下降趨勢(shì)；慶大霉素的MIC50為上升趨勢(shì)，MIC90五年來(lái)無(wú)明顯改變，但腸球菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物具有天然耐藥性[29-30]，美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI) 建議將腸球菌在氨基糖苷類(lèi)藥物上的耐藥程度分為中度耐藥和高度耐藥，慶大霉素為目前已知的高水平耐藥[31]；對(duì)利奈唑胺耐藥率較高，但其MIC50及MIC90五年來(lái)無(wú)明顯改變，MIC90為8 μg/mL,非高濃度抗菌藥物耐藥；對(duì)其余6種抗菌藥物的MIC50和MIC90五年來(lái)無(wú)明顯改變，其中，對(duì)青霉素、萬(wàn)古霉素均保持敏感。2017～2021年上海地區(qū)動(dòng)物源屎腸球菌對(duì)阿莫西林/克拉維酸、頭孢西丁及氟苯尼考的MIC50及MIC90均呈下降趨勢(shì)；青霉素、恩諾沙星、氧氟沙星、利奈唑胺的MIC50五年來(lái)無(wú)明顯改變，MIC90呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明高濃度耐藥菌數(shù)量有所下降；對(duì)其余4種抗菌藥物的MIC50和MIC90五年來(lái)無(wú)明顯改變，其中慶大霉素、頭孢噻呋MIC90均處于較高水平耐藥，萬(wàn)古霉素處于敏感。

上海地區(qū)動(dòng)物源腸球菌除對(duì)阿莫西林/克拉維酸、青霉素、萬(wàn)古霉素較為敏感之外，對(duì)多種抗菌藥物均有較高的耐藥率，不同腸球菌屬細(xì)菌對(duì)同一抗菌藥物存在不同程度的耐藥現(xiàn)象。五年間，腸球菌對(duì)頭孢西丁、青霉素、阿莫西林/克拉維酸、恩諾沙星、氧氟沙星及利奈唑胺存在不同程度耐藥性下降趨勢(shì)，耐藥情況有好轉(zhuǎn)趨勢(shì),除對(duì)慶大霉素、頭孢噻呋有天然耐藥性外[29-30]，其余3種抗菌藥物MIC變遷無(wú)明顯改變，耐藥性無(wú)下降趨勢(shì)。因此仍需進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)抗菌藥物的規(guī)范使用及動(dòng)物源腸球菌的耐藥性監(jiān)測(cè)，在進(jìn)行治療用藥時(shí)，應(yīng)根據(jù)不同腸球菌屬合理選擇抗菌藥物，合理輪換用藥，進(jìn)一步遏制動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。

上海地區(qū)動(dòng)物源腸球菌對(duì)多種抗菌藥物具有不同程度的耐藥，糞腸球菌耐藥性整體高于屎腸球菌。五年來(lái)，整體耐藥情況有好轉(zhuǎn)趨勢(shì)，仍需繼續(xù)加強(qiáng)腸球菌耐藥性監(jiān)測(cè)。