姚路路，程嬋嬋，張 聰，魏 軻，楊會(huì)鮮，周德剛

(洛陽(yáng)惠中獸藥有限公司，河南洛陽(yáng) 471000)

復(fù)方非潑羅尼滴劑的有效成分為非潑羅尼和甲氧普烯，非潑羅尼作用于跳蚤成蟲(chóng)和蜱，甲氧普烯作用于跳蚤卵和幼蟲(chóng)，二者連用發(fā)揮協(xié)同增效作用，可用于驅(qū)殺犬體表的成年跳蚤，跳蚤卵、幼蟲(chóng)和蜱，文獻(xiàn)[1-4]報(bào)道，復(fù)方非潑羅尼滴劑可有效治療和預(yù)防犬、貓蜱蟲(chóng)和跳蚤感染及室內(nèi)環(huán)境中跳蚤清除，單次使用可提供長(zhǎng)達(dá)30 d的保護(hù)。復(fù)方非潑羅尼滴劑中非潑羅尼易氧化，處方中添加叔丁基對(duì)羥基茴香醚(BHA)和二丁基羥基甲苯(BHT)為抗氧劑，可有效抑制非潑羅尼的氧化降解，但復(fù)方非潑羅尼滴劑中抗氧劑的含量測(cè)定方法還缺少相關(guān)的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，文獻(xiàn)中對(duì)BHA、BHT的含量測(cè)定有很多報(bào)道[5-16]，但是，針對(duì)復(fù)方非潑羅尼滴劑中抗氧劑的含量檢測(cè)未見(jiàn)有相關(guān)報(bào)道。由于本品為復(fù)方，且BHA、BHT的添加量比較低(分別為0.02%、0.01%，v/w)，采用文獻(xiàn)方法檢測(cè)干擾較大，為控制制劑質(zhì)量，本研究擬建立高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定復(fù)方非潑羅尼滴劑中BHA和BHT的含量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Alliance e2695型高效液相色譜儀(配有2998型PDA檢測(cè)器和Empower 3工作站，美國(guó)Waters公司)；AB135-S型電子分析天平(瑞士梅特勒托利多公司)。

1.1.2 試藥 二丁基羥基甲苯對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：190065-201602，含量：99.9%)；叔丁基對(duì)羥基茴香醚對(duì)照品(Dr. Ehrenstorfer GmbH，批號(hào)：G129943，含量：99.4%)；復(fù)方非潑羅尼滴劑(洛陽(yáng)惠中獸藥有限公司，規(guī)格：1.34 mL/管，批號(hào)：20180401，20180402，20180403)；甲醇(Thermo Fisher公司，HPLC級(jí))；乙腈(Thermo Fisher公司，HPLC級(jí))；冰醋酸(天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心，色譜純)；水為超純水。

1.2 方 法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18(250 × 4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A：乙腈-甲醇-水(47∶21∶32)，混合前在水中加入1%冰醋酸；流動(dòng)相B：乙腈；采用線性梯度洗脫(0 min，100% A；7 min，100% A；7.1 min，40% A；20 min，40% A；20.1 min，15% A；25 min，15% A；25.1 min，100%A；30 min，100%A)，流速：0.9 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：285 nm；進(jìn)樣體積：20 μL。

1.2.2 溶液的制備 BHA對(duì)照品貯備液的制備：取BHA對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇溶解并稀釋制成0.1 mg/mL的溶液，搖勻，即得。BHT對(duì)照品貯備液的制備：取BHT對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇溶解并稀釋制成0.05 mg/mL的溶液，搖勻，即得。BHA、BHT對(duì)照品溶液的制備：精密量取BHA、BHT對(duì)照品貯備液各2 mL，分別置20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。BHA和BHT混合對(duì)照品溶液的制備：精密量取BHA、BHT對(duì)照品儲(chǔ)備液各2 mL，置同一20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。陰性樣品溶液的制備：按復(fù)方非潑羅尼滴劑處方配制不加BHA、BHT的陰性樣品，取約1.0 g，精密稱(chēng)定，置20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。供試品溶液的制備：取復(fù)方非潑羅尼滴劑約1.0 g，精密稱(chēng)定，置20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.3 專(zhuān)屬性 按1.2.1項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取空白溶劑、1.2.2項(xiàng)下BHA對(duì)照品溶液、BHT對(duì)照品溶液、BHA和BHT混合對(duì)照品溶液、陰性樣品溶液、供試品溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，對(duì)色譜圖進(jìn)行比對(duì)。

1.2.4 線性 分別精密吸取1.2.2項(xiàng)下BHA、BHT對(duì)照品貯備液1.0、2.0、2.0、3.0、3.0 mL，分別置同一20、25、20、25、20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到一系列濃度的BHA、BHT混合對(duì)照品溶液。分別精密吸取20 μL，從低濃度到高濃度依次注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以溶液濃度(C，mg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出回歸方程。

1.2.5 檢測(cè)限與定量限 分別取1.2.2項(xiàng)下BHA、BHT對(duì)照品溶液，加甲醇逐步稀釋后進(jìn)樣20 μL，以信噪比S/N=3的濃度作為檢測(cè)限，以信噪比S/N=10的濃度作為定量限。

1.2.6 進(jìn)樣精密度 取1.2.2項(xiàng)下BHA和BHT混合對(duì)照品溶液，精密吸取20 μL注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6針，記錄峰面積，計(jì)算其峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.2.7 重復(fù)性 按照1.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別制備6份，精密吸取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算BHA、BHT含量，計(jì)算RSD。

1.2.8 中間精密度 另一名分析人員在不同的日期使用不同的儀器獨(dú)立建立系統(tǒng)，按照1.2.2項(xiàng)下方法重新制備6份供試品溶液，精密吸取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算BHA、BHT含量，計(jì)算RSD。

1.2.9 溶液穩(wěn)定性 按照1.2.2項(xiàng)下方法制備BHA、BHT對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算其峰面積RSD。

1.2.10 加樣回收率 取復(fù)方非潑羅尼滴劑(批號(hào)：20180401)0.5 g，精密稱(chēng)定，置20 mL量瓶中，平行9份，3個(gè)一組，分別精密加入BHA、BHT對(duì)照品儲(chǔ)備液(BHA：0.05 mg/mL，BHT：0.025 mg/mL)1.0、2.0、3.0 mL，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算回收率。

1.2.11 耐用性試驗(yàn) 取1.2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液和供試品溶液，通過(guò)改變柱溫(25、30、35 ℃)、流動(dòng)相比例(±1%)、流速(0.8、0.9、1.0 mL/min)以及使用同一品牌不同型號(hào)的色譜柱及不同品牌的色譜柱(Agilent Zorbax SB-C18柱(250×4.6 mm，5 μm)，序列號(hào)：USCL079103、USCL083984；Waters SunFire C18 序列號(hào)：01753614013846；Kromasil 100-5-C18 序列號(hào)：E168478)考察對(duì)BHA、BHT含量測(cè)定的影響。

1.2.12 樣品測(cè)定 取本品三批，按1.2.2項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液及對(duì)照品溶液，分別精密吸取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中BHA、BHT的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 專(zhuān)屬性 結(jié)果見(jiàn)圖1，在該色譜條件下，空白溶劑中溶劑峰及陰性樣品不干擾主峰含量測(cè)定。

A-空白溶劑 B-BHA、BHT混合對(duì)照品溶液 C-陰性樣品溶液 D-供試品溶液A- Diluent B-Reference substance of BHA and BHT C- Negative control D- Test sample

2.2 線性 以溶液濃度(C，mg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出回歸方程。結(jié)果表明BHA在5.13～ 15.39 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y= 21755x+ 3853.5，相關(guān)系數(shù)為0.9996，BHT在2.56 ～ 7.66 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=8620.6x+2531，相關(guān)系數(shù)為0.9990。

2.3 檢測(cè)限與定量限 以信噪比S/N=3的濃度作為檢測(cè)限，測(cè)得BHA、BHT的檢測(cè)限分別為0.08 μg/mL和0.19 μg/mL；以信噪比S/N=10的濃度作為定量限，測(cè)得BHA、BHT的定量限分別為0.31 μg/mL和0.77 μg/mL。

2.4 進(jìn)樣精密度 對(duì)進(jìn)樣精密度試驗(yàn)記錄的色譜圖進(jìn)行處理，計(jì)算6次進(jìn)樣BHA、BHT保留時(shí)間的RSD分別為0.1%、0.1%，峰面積的RSD分別為0.3%、0.8%，表明進(jìn)樣精密度良好。

2.5 重復(fù)性 對(duì)重復(fù)性試驗(yàn)記錄的色譜圖進(jìn)行處理，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算BHA、BHT含量，6次測(cè)定結(jié)果BHA含量RSD為0.4%，BHT含量RSD為1.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.6 中間精密度 對(duì)中間精密度試驗(yàn)記錄的色譜圖進(jìn)行處理，結(jié)果2人12次測(cè)定結(jié)果BHA含量RSD為0.6%，BHT含量RSD為1.4%，表明方法中間精密度良好。

2.7 溶液穩(wěn)定性 對(duì)照品溶液放置24 h，BHA、BHT峰面積RSD分別為1.0%、0.7%，供試品溶液放置24 h，BHA、BHT峰面積RSD分別為0.5%、1.0%，表明對(duì)照品溶液及供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率 對(duì)加樣回收率試驗(yàn)記錄的色譜圖進(jìn)行處理，按外標(biāo)法計(jì)算BHA、BHT含量，計(jì)算回收率，結(jié)果BHA平均回收率為98.5%，RSD為1.8%，BHT平均回收率為99.9%，RSD為2.8%，說(shuō)明方法準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見(jiàn)表1～表2。

表1 BHA加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Tab 1 The result of sample recovery rate of BHA(n=9)

表2 BHT加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Tab 2 The result of sample recovery rate of BHT(n=9)

2.9 耐用性 試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，結(jié)果表明，當(dāng)方法中流速、柱溫、流動(dòng)相比例發(fā)生較小變化時(shí)，對(duì)BHA、BHT的含量測(cè)定影響均較小，不同批次色譜柱對(duì)BHA、BHT的含量影響較小，使用不同品牌色譜柱時(shí)，對(duì)BHT的含量影響較大，BHT峰與相鄰雜質(zhì)峰未達(dá)到基線分離，受雜質(zhì)峰影響，導(dǎo)致其含量偏差較大，因此，規(guī)定本品采用Agilent Zorbax SB- C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱進(jìn)行測(cè)定。

表3 耐用性試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 The result of durability test

2.10 樣品測(cè)定 按外標(biāo)法計(jì)算三批樣品中BHA、BHT的含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 復(fù)方非潑羅尼滴劑抗氧劑測(cè)定結(jié)果Tab 2 Determination Results of BHA and BHT inCompound Fipronil Spot-On Solutions

3 討論與結(jié)論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 采用PDA檢測(cè)器，將BHA、BHT對(duì)照品溶液在190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，Empower 3數(shù)據(jù)工作站分析，取每個(gè)峰的紫外吸收光譜圖，記錄每個(gè)峰的主要最大吸收波長(zhǎng)，結(jié)果顯示BHA最大吸收波長(zhǎng)為290.3 nm，BHT最大吸收波長(zhǎng)為277.2 nm，研究發(fā)現(xiàn)，波長(zhǎng)設(shè)定為280 nm時(shí)，BHT峰左右兩側(cè)各有一雜質(zhì)峰，多次調(diào)整色譜條件均不能實(shí)現(xiàn)基線分離，方法耐用性差，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)BHT附近雜質(zhì)最大吸收波長(zhǎng)在266.5～277.2 nm，將檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為285 nm后，雜質(zhì)干擾有明顯改善，故將檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為285 nm。

3.2 色譜條件的建立 由于復(fù)方非潑羅尼滴劑中BHA、BHT的添加量比較低(分別為0.02%、0.01%，v/w)，為有效檢出抗氧劑的含量，供試品溶液的配制濃度較高，非潑羅尼、甲氧普烯及雜質(zhì)峰均有很強(qiáng)的響應(yīng)，檢測(cè)極易有干擾，本研究發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)外僅有與BHA、BHT測(cè)定相關(guān)的文獻(xiàn)[5-16]，且多為包材及植物油中的抗氧劑檢測(cè)，僅有少數(shù)用于藥品中的抗氧劑檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)有復(fù)方非潑羅尼滴劑中BHA、BHT檢測(cè)方法相關(guān)的文獻(xiàn)，本試驗(yàn)嘗試了文獻(xiàn)中甲醇-水系統(tǒng)、乙腈-水系統(tǒng)、甲醇-甲酸-水系統(tǒng)、甲醇-乙酸-水系統(tǒng)、乙腈-乙酸-水系統(tǒng)、乙腈-乙酸銨-水系統(tǒng)等多種流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在以上這些色譜條件下，其他色譜峰對(duì)BHA、BHT峰均有嚴(yán)重干擾，后參照2011年進(jìn)口再注冊(cè)獸藥“復(fù)方非潑羅尼滴劑(犬用)”質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)色譜條件乙腈-甲醇-1%醋酸溶液系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BHA、BHT峰型相對(duì)較好，干擾較小，在此基礎(chǔ)上對(duì)流動(dòng)相比例、梯度洗脫程序進(jìn)行不斷的優(yōu)化，同時(shí)比較了不同流速的影響，將流速調(diào)整為0.9 mL/min，分離效果相對(duì)較好，經(jīng)過(guò)多次調(diào)整，最終采用1.2.1項(xiàng)下色譜條件BHA、BHT峰型較好，與相鄰峰之間分離度良好，因此，最終確定1.2.1項(xiàng)下色譜條件作為抗氧劑檢查用色譜條件。

采用文獻(xiàn)所報(bào)道的方法均存在干擾，不適用于本品中抗氧劑的含量檢測(cè)，本文所建立的復(fù)方非潑羅尼滴劑中的抗氧劑含量測(cè)定方法，在BHA、BHT相同保留時(shí)間處，陰性樣品及空白稀釋液均無(wú)色譜峰出現(xiàn)，BHA、BHT的檢測(cè)限可達(dá)0.08 μg/mL和0.19 μg/mL；定量限可達(dá)0.31 μg/mL和0.77 μg/mL，說(shuō)明所建立的方法專(zhuān)屬性好、靈敏度高，加樣回收率及耐用性結(jié)果表明所建立的方法準(zhǔn)確度高、耐用性好，能準(zhǔn)確檢測(cè)出復(fù)方非潑羅尼滴劑中抗氧劑的含量。