廖予菲,王 萍，張瑞瑞，程茜菲

(陜西國際商貿(mào)學(xué)院 ,陜西 咸陽 712046)

黃曲霉毒素(Aflatoxins，AFs)是一類結(jié)構(gòu)類似的真菌(黃曲霉Aspergillus flavus和寄生曲霉A.parasiticus等)代謝產(chǎn)物，目前發(fā)現(xiàn)的20余種黃曲霉毒素中毒性較強(qiáng)主要有B1、B2、G1、G2等[1]。黃曲霉毒素具有致癌、致畸、致突變作用，可導(dǎo)致動(dòng)物全身性損害，其中黃曲霉毒素B1被聯(lián)合國確定為Ⅰ類致癌物[2]。傳統(tǒng)中藥材儲(chǔ)存運(yùn)輸中極易發(fā)生霉變，滋生黃曲霉毒素，其中以種子果實(shí)類為最?，F(xiàn)行的2020版《中國藥典》規(guī)定24種中藥材應(yīng)檢測黃曲霉毒素，相對(duì)2015版《中國藥典》增加了土鱉蟲、延胡素等5個(gè)品種。本文研究對(duì)象豬膽粉是中醫(yī)藥傳統(tǒng)藥物，來源于豬膽汁的干燥品，雖未納入中國藥典規(guī)定應(yīng)檢測的藥材品種，但其生產(chǎn)加工過程較易產(chǎn)生黃曲霉毒素，同樣值得關(guān)注。

現(xiàn)行中國藥典規(guī)定的黃曲霉毒素檢測方法包括HPLC-FLD(高效液相色譜-熒光檢測法)、UPLC-MS/MS、ELISA(酶聯(lián)免疫法)。因黃曲霉毒素為痕量檢測，中藥往往基質(zhì)復(fù)雜，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果[3]。較其他兩種方法，UPLC-MS/MS法靈敏高、專屬性強(qiáng)，能有效排除強(qiáng)干擾基質(zhì)影響，適用于中藥黃曲霉毒素的檢測[4]。

藥典中與色譜法配套的樣品前處理方法為免疫親和柱法，該方法利用高度專一性的抗體與黃曲霉毒素產(chǎn)生特異性結(jié)合，從而達(dá)到有效分離干擾物質(zhì)的作用，凈化效果較好，但該法操作步驟多，成本較高，較難實(shí)現(xiàn)快速高效檢測中藥中黃曲霉毒素。QuEChERS法是一種快速高效的樣品前處理方法，近年來，在以農(nóng)藥殘留量檢測為代表的中藥外源性污染物檢測領(lǐng)域該方法得到了廣泛應(yīng)用，中國藥典2020版中將該方法作為禁用農(nóng)藥殘留測定的前處理方法之一，也有部分學(xué)者將其應(yīng)用于中藥黃曲霉毒素檢測中[5]。

筆者對(duì)比了免疫親和柱法及QuEChERS法兩種樣品前處理方法，以期為快速高效測定中藥中的黃曲霉毒素提供思路。此外，準(zhǔn)確快速檢驗(yàn)國藥，對(duì)于“三農(nóng)”中家畜豬的養(yǎng)殖，充分利用家畜副產(chǎn)品具有重要意義。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Acquity UPLC H-Class XEVO TQD超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(Waters科技有限公司)；TE124S型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)； PriboFast固相萃取裝置(普瑞邦科技有限公司)； HC-3018R型高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

黃曲霉毒素混合對(duì)照品溶液(Bepure，批號(hào)D0017654)，其中黃曲霉毒素G2濃度為0.3 μg/mL；黃曲霉毒素G1濃度為1.0 μg/mL；黃曲霉毒素B2濃度為0.3 μg/mL；黃曲霉毒素B1濃度為1.0 μg/mL。

免疫親合柱(美國Romer Labs)；QuEChERS dSPE 樣品萃取凈化管(島津制作所),甲醇、乙腈(美國Fiher公司，色譜純)、乙酸銨(德國Merck公司，色譜純)，氯化鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，優(yōu)級(jí)純)。豬膽粉(批號(hào)：Y1-190102，Y1-191013，福建省仙游縣南豐生化有限公司)，由陜西國際商貿(mào)學(xué)院王萍副教授鑒定為豬科動(dòng)物豬Sus scrofa domestica Brisson.膽汁的干燥品，其中經(jīng)前期檢測Y1-190102未檢出黃曲霉素污染，可作為陰性空白，Y1-191013檢出黃曲霉毒素B2。

2 實(shí)驗(yàn)過程

2.1 質(zhì)譜條件

離子源模式(ESI源)：正電離模式；掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)；離子源溫度：150 ℃；毛細(xì)管電壓：0.5 KV；脫溶劑氣溫度：450 ℃；脫溶劑氣流速：900 L/Hr；錐孔氣流速：30 L/Hr。質(zhì)譜采集參數(shù)信息見表1。

表1 質(zhì)譜采集參數(shù)信息

2.2 色譜條件

色譜柱：waters ACQUITY UPLC C18(2.1×100 mm，1.7 μm)；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：2 μL。以10 mmol/L乙酸銨溶液為流動(dòng)相A , 以甲醇為流動(dòng)相B，按表2中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫。

表2 液相色譜梯度條件

2.3 對(duì)照品溶液配制

精密吸取1 mL黃曲霉毒素混合對(duì)照品溶液，加70%甲醇定容于10 mL量瓶，制備成黃曲霉毒素G2濃度為29.55 ng/mL、黃曲霉毒素G1濃度為99.50 ng/mL、黃曲霉毒素B2濃度為29.70 ng/mL、黃曲霉毒素B1濃度為99.80 ng/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

移取上述混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，加70%甲醇稀釋得黃曲霉毒素G2濃度分別為0.06、0.15、0.30、0.59、1.48、2.36、2.96 ng/mL，黃曲霉毒素G1濃度分別為0.20、0.50、1.00、1.99、4.98、7.96、9.95 ng/mL，黃曲霉毒素B2濃度分別為0.06、0.15、0.30、0.59、1.49、2.38、2.97 ng/mL，黃曲霉毒素B1濃度分別為0.20、0.50、1.00、2.00、4.99、7.98、9.98 ng/mL的1-7號(hào)標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。

2.4 樣品前處理

2.4.1 免疫親和柱法 取供試品粉末約2 g，精密稱定，置于均質(zhì)瓶中，加入氯化鈉3 g，精密加入70%甲醇溶液75 mL，高速攪拌2 min(攪拌速度大于11 000 r/min)，離心5 min(離心速度4 000 r/min)，精密量取上清液15 mL，置50 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，離心10 min(離心速度4 000 r/min)，精密量取上清液20 mL，通過免疫親合柱，流速每分鐘3 mL，用淋洗緩沖液10 mL洗脫，再用水10 mL洗脫，棄去洗脫液，使空氣進(jìn)入柱子，將水?dāng)D出柱子，再用適量甲醇洗脫收集洗脫液，置2 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.22 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.2 QuEChERS法 取供試品粉末2 g，精密稱定，置50 mL離心管中，加入乙腈20 mL，渦旋1 min，超聲10 min，離心5 min(離心速率10 000 r/min)，取上清液，倒入QuEChERS dSPE 凈化管，充分渦旋振蕩2 min，離心5 min(離心速率5 000 r/min)，取上清液1 mL用50 ℃氮?dú)獯蹈?，快速加入甲? mL，過微孔濾膜(0.22 μm)，取濾液，即得。

2.5 測定法

按“2.2”項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液和“2.4”項(xiàng)下兩種前處理方法所制供試品溶液注入液相色譜儀，測得色譜圖見圖1、圖2。

圖1 黃曲霉毒素混合對(duì)照品總離子流

圖2 豬膽粉供試品總離子流

2.6 線性關(guān)系

精密吸取“2.3項(xiàng)”下標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液各濃度2μL分別注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，每個(gè)濃度重復(fù)測定2次，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如表3所示。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

結(jié)果表明黃曲霉毒素G2在0.06～2.96 ng/mL、黃曲霉毒素G1在0.20～9.95 ng/mL、黃曲霉毒素B2在0.06～2.97 ng/mL、黃曲霉毒素B1在0.20～9.98 ng/mL濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)r>0.999，濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系，可用于標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

2.7 重復(fù)性對(duì)比研究

取批號(hào)為Y1-191013的供試品分別按照“2.4” 項(xiàng)下兩種前處理方法各制備6份樣品，每份重復(fù)測定2次，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算出樣品中黃曲霉毒素B2含量，結(jié)果顯示免疫親和柱法RSD為3.9%、QuEChERS法RSD值為2.7%。

2.8 回收率對(duì)比研究

2.8.1 免疫親和柱法 取批號(hào)為Y1-191013的供試品粉末，精密稱定9份，分別按表4加入高、中、低濃度的 “2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液各三份，按“2.4.1”項(xiàng)下的方法制備，每份重復(fù)測定2次。

表4 免疫親和柱法加標(biāo)回收率結(jié)果

2.8.2 QuEChERS法 取批號(hào)為Y1-191013的供試品粉末，精密稱定9份，分別按表5加入高、中、低濃度的 “2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液各三份，按“2.4.2”項(xiàng)下的方法制備，每份重 復(fù)測定2次。

表5 QuEChERSF法加標(biāo)回收率結(jié)果

2.9 檢測限對(duì)比研究

取批號(hào)為Y1-190102的供試品粉末，通過比較低濃度分析物樣品與空白樣品測量的信號(hào)，依據(jù)信噪比為3∶>1對(duì)應(yīng)的最低濃度為檢出限的規(guī)定，倍比稀釋相應(yīng)濃度的對(duì)照品溶液加入供試品，分別按照“2.4”項(xiàng)下兩種前處理方法各制備3份樣品，分析可知，免疫親和柱法檢測限為黃曲霉毒素G2∶0.0 294 μg/kg，黃曲霉毒素G1∶>0.0 988 μg/kg，黃曲霉毒素B2∶>0.0 212 μg/kg，黃曲霉毒素B1∶0.0 888 μg/kg；QuEChERS法檢測限為黃曲霉毒素G2∶>0.0 344 μg/kg，黃曲霉毒素G1∶>0.1 256 μg/kg，黃曲霉毒素B2∶>0.0 279 μg/kg，黃曲霉毒素B1∶0.1 162 μg/kg。

3 結(jié)果與討論

3.1 前處理方法對(duì)比研究結(jié)果

兩種前處理方法所制樣品中雜質(zhì)對(duì)四種黃曲霉毒素峰均無干擾，能專屬的測定黃曲霉毒素，相對(duì)而言，免疫親和柱法處理效果更佳，雜質(zhì)較少，這與該方法能特異性結(jié)合黃曲霉毒素有關(guān)。

回收率對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)均采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P≤0.05認(rèn)為有顯著性差異。分析結(jié)果見表6。

表6 兩種前處理方法回收率結(jié)果比較

兩種方法對(duì)黃曲霉毒素G族回收率結(jié)果無顯著性差異，對(duì)黃曲霉毒素B族則QuEChERS法回收率更高，該方法操作簡單，步驟少，能相應(yīng)減少樣品處理過程中分析對(duì)象的損失。重復(fù)性、檢測限對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果，免疫親和柱法則略優(yōu)于QuEChERS法。整體來看，兩種方法均能專屬、快速、靈敏、準(zhǔn)確的實(shí)現(xiàn)樣品處理分析，均可作為豬膽粉黃曲霉毒素測定的前處理方法，但綜合經(jīng)濟(jì)成分和時(shí)間成本分析，QuEChERS成本低、操作方便、回收率高、污染小，更符合“綠色化學(xué)”的理念[6]。

3.2 提取方法考察

好的提取方法能夠充分提出待測組分，有利于后續(xù)的分離純化，對(duì)于黃曲霉毒素這種痕量污染物提取方法的優(yōu)劣直接影響分析結(jié)果。實(shí)驗(yàn)分別對(duì)高速均質(zhì)法和超聲提取法進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)對(duì)免疫親和柱處理的樣品，超聲提取法效果不如高速均質(zhì)法，而QuEChERS法兩者差異不大，因此在免疫親和柱處理前選擇了高速均質(zhì)法，QuEChERS法則出于方便考慮選擇渦旋后超聲處理樣品。

3.3 中藥豬膽粉黃曲霉毒素污染情況

實(shí)驗(yàn)對(duì)不同廠家生產(chǎn)的15批次豬膽粉藥材進(jìn)行了黃曲霉毒素的測定，結(jié)果顯示6批次有黃曲霉毒素檢出，雖均未超過中國藥典對(duì)黃曲霉毒素設(shè)定的限量：黃曲霉毒素B1不得超過5 μg/kg，黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素B2和黃曲霉毒素B1的總量不得超過10 μg/kg[7]。作為動(dòng)物來源藥材，豬膽粉雖未作為《中國藥典》2020年版中規(guī)定測定黃曲霉毒素的品種，其生產(chǎn)加工過程中易產(chǎn)生黃曲霉毒污染，藥品的安全值得我們關(guān)注。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)以中藥豬膽粉作為研究對(duì)象，采用UPLC-MS/MS作為測定方法，分別通過免疫親和柱法及QuEChERS法進(jìn)行樣品前處理，通過考察方法的穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率、檢測限，對(duì)兩種前處理方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明兩種前處理方法各有優(yōu)劣，但整體而言，從操作簡便，節(jié)約成本的角度來講，QuEChERS法更優(yōu)。該方法可考慮進(jìn)一步推廣到其他藥材及中成藥黃曲霉毒素檢測中，但中藥往往基質(zhì)復(fù)雜，基質(zhì)對(duì)痕量物質(zhì)檢測結(jié)果影響較大，QuEChERS法在黃曲霉毒素測定中是否具有普適性，仍需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。