許靜靜，李思琪，任夢圓, 薛雨欣，李永強(qiáng)

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院, 農(nóng)業(yè)部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西 楊凌 712100)

幾丁質(zhì)是昆蟲體內(nèi)一種天然含量僅次于纖維素的氨基多糖[1]，主要存在于昆蟲表皮、氣管和圍食膜中，起支撐和滲透屏障的作用，使蟲體減少或免于機(jī)械損傷和毒素及病原菌的侵染[2～3]，因此對(duì)昆蟲的正常生長發(fā)育有著至關(guān)重要的作用[3]。由于植物和脊椎動(dòng)物體內(nèi)不含幾丁質(zhì)，調(diào)控幾丁質(zhì)合成與代謝相關(guān)酶便為新型高效殺蟲劑的設(shè)計(jì)和開發(fā)提供了潛在的優(yōu)良靶標(biāo)。針對(duì)這些關(guān)鍵酶的化學(xué)抑制劑以及基于RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù)的害蟲防控新途徑的研究和開發(fā)，一直是近些年農(nóng)業(yè)害蟲防治領(lǐng)域的研究前沿和熱點(diǎn)[2,4]。苯甲?；孱愂巧蟼€(gè)世紀(jì)70年代初研究最早、最具代表性的一種昆蟲幾丁質(zhì)合成抑制劑，通過結(jié)構(gòu)的不斷修飾，已有多個(gè)品種實(shí)現(xiàn)了商品化[5]。近年隨著RNAi技術(shù)介導(dǎo)的害蟲防治策略的提出[6]，憑借其專一性強(qiáng)、潛在靶標(biāo)多、環(huán)境安全等諸多優(yōu)點(diǎn)，其在害蟲防控方面的研究和應(yīng)用不斷取得進(jìn)展。本文對(duì)近些年利用RNAi技術(shù)針對(duì)幾丁質(zhì)合成關(guān)鍵酶在害蟲防控研究及應(yīng)用中的重要進(jìn)展、存在問題及潛在的解決途徑進(jìn)行了較為系統(tǒng)的總結(jié)和歸納，期望為利用RNAi技術(shù)進(jìn)行害蟲防治研究提供有價(jià)值的理論指導(dǎo)。

1 幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能

幾丁質(zhì)是N-乙酰氨基葡萄糖組成的線性聚合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與植物纖維素相似，因此也被稱為動(dòng)物纖維素[7]。通過X射線分析發(fā)現(xiàn)，幾丁質(zhì)具有α、β和γ三種晶體類型，α晶型中幾丁質(zhì)鏈以反向平行的方式排列，β晶型中以平行的方式排列，γ晶型則以平行和反向平行交替的方式排列。由于幾丁質(zhì)鏈反向平行排列產(chǎn)生了大量的氫鍵，形成的緊密微纖維有助于提高機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性，因此α晶型主要存在于昆蟲的體壁中。相比之下，β晶型和γ晶型鏈間氫鍵較少、緊密度較低，但二者能與水形成大量氫鍵，使形成的微纖維更具有可塑性和柔軟性，因此其主要存在于昆蟲圍食膜等中[8]。

幾丁質(zhì)主要與蛋白質(zhì)等共同形成昆蟲的表皮及圍食膜，從而起到保持昆蟲形態(tài)和滲透屏障的作用[3]。但幾丁質(zhì)形成的堅(jiān)硬體壁在阻礙外源物侵害的同時(shí)，也阻礙了昆蟲的生長發(fā)育。因此，昆蟲必須進(jìn)行幾丁質(zhì)有規(guī)律的合成與代謝，保證周期性的正常蛻皮，以適應(yīng)正常生長發(fā)育的需求[9]。在研究果蠅的幾丁質(zhì)合成酶1突變中發(fā)現(xiàn)，幾丁質(zhì)的正常合成對(duì)表皮的完整性、形態(tài)的維持至關(guān)重要，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)合成酶1還參與了角質(zhì)層色素的沉著過程[10]。而有些昆蟲在饑餓或蛻皮時(shí)，圍食膜可能完全停止形成，直至昆蟲再次取食時(shí)，并排出舊的圍食膜或重吸收產(chǎn)生新的圍食膜[3]，因此昆蟲的生長發(fā)育嚴(yán)格依賴于體內(nèi)幾丁質(zhì)的含量。有研究表明，昆蟲蛻皮的干物質(zhì)中幾丁質(zhì)含量高達(dá)40%，而圍食膜中的幾丁質(zhì)含量通常在3%～13%之間[3]。

2 幾丁質(zhì)合成途徑關(guān)鍵酶

2.1 海藻糖酶

海藻糖酶(Trehalase，Tre)是幾丁質(zhì)生物合成的第一個(gè)催化酶，也是昆蟲體內(nèi)唯一一類水解海藻糖的非還原性酶[11]，參與昆蟲的幾丁質(zhì)的合成和能量代謝過程[12]。昆蟲Tre屬于糖苷水解酶家族，理論分子量約為63.4～74.2 kD，理論等電點(diǎn)為酸性(4.66～6.23)，含有兩個(gè)氨基酸標(biāo)簽序列：“PGGRFREFYYWDSY”和“QWDYPNAWPP”，以及一個(gè)甘氨酸富集區(qū)“GGGGEY”。昆蟲含有兩種海藻糖酶，即可溶性海藻糖酶(Tre1)和膜結(jié)合型海藻糖酶(Tre2)。將部分已知昆蟲Tre的氨基酸序列利用MEGA6軟件中的Align功能進(jìn)行比對(duì)，再通過Neighbor-Joining進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，可以得到已知的昆蟲Tre基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)。從該系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，不同目昆蟲的Tre基因均聚為兩大類，即Tre1和Tre2。同一種昆蟲中二者之間氨基酸序列相似性較低，但二者在不同昆蟲中卻分別存在較高的相似性。例如鱗翅目昆蟲的Tre1和Tre2在系統(tǒng)發(fā)育樹上各聚為一大類，表明二者之間同源性較低；而同屬鱗翅目昆蟲的草地貪夜蛾、斜紋夜蛾和甜菜夜蛾的Tre1在系統(tǒng)發(fā)育樹上所處的位置卻較近，表明序列同源性較高(圖1)。

通過RNAi技術(shù)對(duì)海藻糖酶功能進(jìn)行研究，結(jié)果表明Tre1主要與昆蟲表皮中幾丁質(zhì)含量高低有關(guān)，而Tre 2主要與昆蟲圍食膜幾丁質(zhì)含量高低有關(guān)[13-14]，二者的基因沉默會(huì)直接影響昆蟲的正常生長發(fā)育。Chen等[14]通過顯微注射法對(duì)甜菜夜蛾海藻糖酶SeTre1和SeTre2進(jìn)行RNAi研究發(fā)現(xiàn)，基因轉(zhuǎn)錄水平降低60%和80%，且注射dsSeTre1的昆蟲角質(zhì)層幾丁質(zhì)含量顯著下降約30%，注射dsSeTre2的昆蟲中腸幾丁質(zhì)含量下降約25%。張倩等[13]通過飼喂法干擾灰飛虱海藻糖酶LSTre1和LSTre2，基因轉(zhuǎn)錄水平分別降低49%和41%，并導(dǎo)致昆蟲體重減輕、死亡率顯著升高。由此可見，通過dsRNA干擾海藻糖酶，打破了幾丁質(zhì)合成的平衡可能是導(dǎo)致昆蟲蛻皮困難甚至死亡的主要原因[15]。

圖1 部分已知昆蟲海藻糖酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2 幾丁質(zhì)合成酶

幾丁質(zhì)合成酶(Chitin synthetase，CHS)是幾丁質(zhì)生物合成的最后一個(gè)催化酶。大多數(shù)昆蟲含有兩種幾丁質(zhì)合成酶，即幾丁質(zhì)合成酶1(CHS1)和幾丁質(zhì)合成酶2(CHS2)[16]，但在褐飛虱、豌豆蚜和大豆蚜等半翅目昆蟲中，只發(fā)現(xiàn)了CHS1。將部分已知昆蟲CHS的氨基酸序列使用MEGA6軟件進(jìn)行同源比對(duì)，再使用Neighbor-Joining法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，從而得到昆蟲CHS基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。從CHS系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，昆蟲的CHS基因也被分成了兩大類，即CHS1和CHS2。例如，所有的半翅目昆蟲的CHS1形成了一個(gè)亞分支，其中桔蚜、大豆蚜和豌豆蚜CHS1同源性較近(圖2)。幾丁質(zhì)合成酶是高度保守的大分子跨膜蛋白，屬于糖基轉(zhuǎn)移酶家族，理論分子量約為160 ～180 kD，具有約14 ～17個(gè)跨膜螺旋，理論等電點(diǎn)偏酸性(5.43～7.08)。CHS含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為A、B、C結(jié)構(gòu)域。其中位于中心的結(jié)構(gòu)域B相對(duì)較為保守，含有兩個(gè)特有的識(shí)別序列“EDR”和“QRRRW”。

通過RNAi技術(shù)對(duì)幾丁質(zhì)合成酶的功能進(jìn)行研究，結(jié)果表明CHS1主要負(fù)責(zé)昆蟲的表皮中幾丁質(zhì)的合成，而CHS2主要負(fù)責(zé)圍食膜的幾丁質(zhì)形成[3]。Zhang等[17]對(duì)東亞飛蝗幾丁質(zhì)合成酶LmCHS1進(jìn)行基因沉默后，發(fā)現(xiàn)LmCHS1的轉(zhuǎn)錄水平降低了約80%；若蟲表現(xiàn)為發(fā)育遲緩、身體扭曲，無法完成正常的蛻皮，即使完成了蛻皮，新形成的體壁顏色較淺且后足因彎曲而無法正常行走。余志濤等[18]對(duì)中華稻蝗OcCHS1進(jìn)行基因沉默后，若蟲齡期普遍增長，多數(shù)試蟲由于無法完成蛻皮而死亡，少數(shù)進(jìn)入下一齡期的若蟲也因無法羽化為成蟲而死亡，死亡率高達(dá)85%。劉曉健等[19]對(duì)東亞飛蝗若蟲幾丁質(zhì)合成酶LmCHS2進(jìn)行基因沉默后，中腸幾丁質(zhì)含量的降低使圍食膜殘缺不全，進(jìn)食難以消化和吸收，最終因?yàn)轲囸I而死亡。此外還發(fā)現(xiàn)，CHS2基因在昆蟲進(jìn)食期間高表達(dá)，而蛹等非進(jìn)食期間低表達(dá)[20]。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明兩種幾丁質(zhì)合成酶分布和功能的差異性。

圖2 部分已知昆蟲幾丁質(zhì)合成酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹

除此之外，許多昆蟲CHS1基因具有的可變剪接已經(jīng)被報(bào)道，包括褐飛虱[21]、東亞飛蝗[17]和赤擬谷盜[22]等。值得注意的是，迄今尚未發(fā)現(xiàn)CHS2有可變剪切機(jī)制[22]。CHS1的兩個(gè)交替外顯子編碼的多肽長度均為59個(gè)氨基酸，且各編碼一個(gè)高度保守的跨膜結(jié)構(gòu)域。CHS1a主要負(fù)責(zé)昆蟲表皮幾丁質(zhì)的合成，而CHS1b主要負(fù)責(zé)氣管幾丁質(zhì)的合成[12,21]。例如，張傳溪等[21]對(duì)稻褐飛虱幾丁質(zhì)合成酶NlCHS1基因研究結(jié)果表明，使用dsNlCHS1處理的五齡若蟲在羽化前全部死亡，而dsNlCHS1a處理的五齡若蟲，45%在羽化前死亡，42%的個(gè)體在轉(zhuǎn)化成成蟲后死亡，僅有13%的個(gè)體存活；但NlCHS1b卻有高達(dá)73%的成蟲存活率，表明dsRNA能夠降低特定序列表達(dá)從而產(chǎn)生特定的效應(yīng)。在東亞飛蝗中，干擾LmCHS1和其兩個(gè)可變剪接，也得到了相似的結(jié)果[17]。

2.3 幾丁質(zhì)合成途徑其它催化酶

幾丁質(zhì)的生物合成是一類高度復(fù)雜的生理生化過程，由一系列的酶催化完成，該過程共涉及8種酶，目前幾丁質(zhì)合成通路中研究較多的是Tre和CHS，這兩類酶在多種昆蟲中已經(jīng)完成了基因克隆和功能分析。相對(duì)而言，與幾丁質(zhì)合成有關(guān)的其它酶，例如果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶(Gructose-6-phosphate aminotransferase，Gfat)、葡糖胺-6-磷酸-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(Glucosamine-6-phosphate N-acetyltransferase，GNA)和UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶(UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase，UAP)等酶研究的則相對(duì)較少。

Gfat研究主要集中在酵母菌等的重要生物學(xué)功能和蛋白修飾方式方面，Gfat在昆蟲幾丁質(zhì)合成途徑中的作用方面研究較少[23]。張歡歡等[23]研究表明飛蝗的果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶基因LmGfat在蟲體表皮高表達(dá)，且LmGfat基因沉默后，試蟲主要因蛻皮失敗而死亡，推測飛蝗LmGfat與幾丁質(zhì)的合成密切相關(guān)。而飛蝗的葡糖胺-6-磷酸-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶LmGNA在蝗蟲各個(gè)組織均有表達(dá)且干擾后未出現(xiàn)特殊表型，通過與CHS1相似的表達(dá)模式，推測可能與幾丁質(zhì)的合成有關(guān)。陳潔等[24]對(duì)5齡甜菜夜蛾UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶SeUAP進(jìn)行干擾，甜菜夜蛾幾丁質(zhì)合成酶SeCHS2表達(dá)水平明顯的下調(diào)，并出現(xiàn)了畸形蛹和死亡的現(xiàn)象。陸承聰?shù)萚25]對(duì)西花薊馬UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶FoccUAP進(jìn)行了基因沉默，西花薊馬的羽化率和存活率均顯著降低，并出現(xiàn)了翅膀和腹部等畸形現(xiàn)象。這些試驗(yàn)結(jié)果表明幾丁質(zhì)合成相關(guān)酶的基因沉默會(huì)對(duì)昆蟲的生長發(fā)育產(chǎn)生顯著的影響，但這些酶的具體功能還有待進(jìn)一步研究和闡明。

3 幾丁質(zhì)合成關(guān)鍵酶調(diào)控在害蟲防治中的研究進(jìn)展

3.1 針對(duì)幾丁質(zhì)合成途徑的化學(xué)抑制劑

幾丁質(zhì)合成抑制劑的作用相當(dāng)于生長調(diào)節(jié)劑，通過對(duì)昆蟲的幾丁質(zhì)合成關(guān)鍵酶活性產(chǎn)生重要影響，或通過和底物競爭性與Tre或CHS結(jié)合，阻斷昆蟲幾丁質(zhì)的正常合成，從而導(dǎo)致蟲體出現(xiàn)畸形和死亡[3]。幾丁質(zhì)合成酶最具代表性的化學(xué)抑制劑是苯甲?；孱惡碗幕塑疹惢衔?表1)，其中苯甲?；孱愔饕种评ハx的生長發(fā)育，是幾丁質(zhì)合成抑制劑中商品種類最多的一類[26]，其致毒方式特別，具有選擇性強(qiáng)、作用范圍大和殘留少等特點(diǎn)，已在害蟲防治中得到廣泛應(yīng)用[7]。苯甲酰基脲類殺蟲劑主要包括除蟲脲、氟蟲脲、噻嗪酮和抑食肼等。另一類肽基核苷類化合物，例如多樣霉素和尼可霉素，其結(jié)構(gòu)類似于UDP-GlcNAc，作用于CHS的催化部位，具有極高的殺菌活性[27]，被認(rèn)為是有效的殺菌劑。雖然，目前并不認(rèn)為核苷肽類化合物是殺蟲劑，但有研究發(fā)現(xiàn)，多氧霉素使蝗蟲在羽化時(shí)出現(xiàn)死亡，還導(dǎo)致紅頭麗蠅的圍食膜重量減輕[28]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，由于這類化合物均是極性分子，較難通過昆蟲體壁或取食后被降解，但通過注射，具有顯著的抑制效果[26]。

目前，尚未見專門針對(duì)昆蟲海藻糖酶的化學(xué)抑制劑正式登記。不過，有研究發(fā)現(xiàn)井岡霉素和海藻唑啉等均被發(fā)現(xiàn)具有顯著抑制昆蟲Tre活性的作用，因此被認(rèn)為是潛在、有效的海藻糖酶抑制劑型殺蟲劑[29-30]。研究發(fā)現(xiàn)使用含有井岡羥胺A(Validoxylamine A)的飼料飼喂棉鈴蟲，試蟲表現(xiàn)為取食量減少，體重減輕，繁殖率與存活率下降等癥狀，表明對(duì)棉鈴蟲的生長發(fā)育產(chǎn)生了明顯的抑制作用[31]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)注射了海藻唑啉的蝗蟲，首先試蟲活動(dòng)減少，隨后取食量減少[29]。盡管作為有效的殺菌劑的井岡霉素和海藻唑啉，對(duì)昆蟲的Tre離體活性很高，但進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)對(duì)昆蟲活體致死效果很差。因而，研究人員希望通過對(duì)Tre抑制劑結(jié)構(gòu)的改造來保證其應(yīng)用效果，從而開發(fā)出具有實(shí)際應(yīng)用意義的產(chǎn)品[32]。昆蟲生長調(diào)節(jié)劑的適當(dāng)應(yīng)用有利于減少環(huán)境污染，促進(jìn)綠色食品生產(chǎn)，在農(nóng)業(yè)害蟲防治中具有重要意義。

3.2 基于RNAi技術(shù)的幾丁質(zhì)合成調(diào)控

RNAi是指利用雙鏈RNA(doubled-stranded RNA, dsRNA)或者小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)特異性地高效誘導(dǎo)害蟲體內(nèi)重要功能基因的mRNA降解碎片化，而導(dǎo)致該靶基因表達(dá)沉默(即后續(xù)的翻譯表達(dá)無法正常進(jìn)行)，產(chǎn)生相應(yīng)的生理功能缺失，最終導(dǎo)致害蟲生長發(fā)育受阻甚至致死的一種技術(shù)。該現(xiàn)象包含的機(jī)制最早于1998年在秀麗隱桿線蟲中得以闡明[33]。在2001年，RNAi技術(shù)被《Science》雜志評(píng)為十大科學(xué)進(jìn)展之一，并位于2002年十大科學(xué)進(jìn)展之首。隨后，RNAi成為了昆蟲基因功能研究的熱點(diǎn)和前沿，越來越多昆蟲的功能基因被克隆和鑒定，Mao等[34]在2007年提出將RNAi技術(shù)應(yīng)用于害蟲防治中，而Price等[6]在2008年提出將RNAi技術(shù)作為新型害蟲防治策略，并將之視為第四代殺蟲劑。

RNAi介導(dǎo)的害蟲靶基因沉默途徑具有特異、高效的優(yōu)點(diǎn)，以及技術(shù)過程的簡便性，現(xiàn)已被廣泛用于重要農(nóng)業(yè)害蟲綠色防控新技術(shù)研究和開發(fā)中。已有研究表明，通過注射或飼喂的方法，均可降低昆蟲幾丁質(zhì)的含量，產(chǎn)生預(yù)期的效果(表2)。鑒于幾丁質(zhì)合成關(guān)鍵酶的環(huán)境安全性和靶標(biāo)專一性，其做為潛在的開發(fā)新型高效綠色殺蟲劑的靶標(biāo)具有巨大的應(yīng)用潛力。

表1 針對(duì)幾丁質(zhì)合成的化學(xué)抑制劑對(duì)昆蟲生長發(fā)育的影響

3.2.1 植物介導(dǎo)的RNAi(表達(dá)dsRNA的轉(zhuǎn)基因抗蟲作物)在害蟲防治中的應(yīng)用 RNAi技術(shù)應(yīng)用于害蟲防治的研究已取得較大進(jìn)展。寄主誘導(dǎo)的基因沉默(host-induced gene silencing，HIGS)技術(shù)已在稻縱卷葉螟[44～47]、甜菜夜蛾[48]和蚜蟲[49～50]等害蟲中取得了較大進(jìn)展(表2)。例如，Tian等[48]在甜菜夜蛾中報(bào)道通過飼喂在體壁和氣管特異性表達(dá)的SeCHS1的dsRNA后，顯著抑制甜菜夜蛾的生長發(fā)育，并導(dǎo)致昆蟲死亡。Zhao等[50]構(gòu)建了含麥長管蚜幾丁質(zhì)合成酶CHS1基因片段的轉(zhuǎn)基因抗蚜小麥品系，研究發(fā)現(xiàn)取食第三代(T3)小麥品系的試蟲，其CHS1基因表達(dá)水平下降了50%左右，存活和羽化的試蟲數(shù)量均顯著下降。Ye等[51]對(duì)豌豆蚜幾丁質(zhì)合成酶ApisCHS進(jìn)行RNAi研究發(fā)現(xiàn)，取食dsApisCHS7 2 h后導(dǎo)致44.7%的試蟲死亡，只有51.3%的試蟲成功蛻皮。王爽[52]構(gòu)建了含稻縱卷葉螟海藻糖酶CmTre基因片段的轉(zhuǎn)基因水稻品種，室外活體實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻的卷葉率和白葉率均明顯降低，表明含有CmTre的轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)稻縱卷葉螟具有一定的防治效果。

3.2.2 dsRNA核酸農(nóng)藥 上述研究表明，通過在植物中表達(dá)來增強(qiáng)抗蟲性是害蟲防治的重要手段。但相對(duì)于植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)，直接體外噴灑dsRNA的方法更為簡便、快捷。大田噴施核酸用藥能夠針對(duì)不同害蟲、不同的發(fā)育時(shí)期設(shè)計(jì)特定的dsRNA，而且也能夠同時(shí)以多個(gè)基因?yàn)榘袠?biāo)，混合應(yīng)用或者交替應(yīng)用提高基因干擾和致死效率[53]。結(jié)合實(shí)際應(yīng)用，噴灑及灌根是最為簡單、通用的方式。雖然，截止目前尚未有dsRNA在大田噴灑使用的報(bào)道，但室內(nèi)已有用dsRNA重組菌株的菌液涂在蘿卜葉片上飼喂小菜蛾，造成其幼蟲的死亡、產(chǎn)卵量降低等現(xiàn)象，表明菌液確實(shí)對(duì)小菜蛾產(chǎn)生了干擾效應(yīng)[57]。Hunter等[58]通過浸根和注射樹干的方式處理果樹，在7周后仍能在樹苗中檢測到dsRNA。Li等[59]通過浸根的方式處理水稻和玉米，飼喂飛虱和玉米螟，昆蟲的死亡率明顯提高。這些研究結(jié)果表明，基于RNAi技術(shù)，開發(fā)直接噴灑外用的核酸農(nóng)藥(dsRNA)具有很大潛力。

表2 針對(duì)幾丁質(zhì)合成途徑關(guān)鍵酶的RNAi對(duì)昆蟲生長發(fā)育的影響

4 RNAi技術(shù)應(yīng)用于防治農(nóng)業(yè)害蟲面臨的主要問題及應(yīng)對(duì)策略

4.1 RNAi技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)害蟲防治面臨的主要問題

基于害蟲體內(nèi)關(guān)鍵基因的RNAi技術(shù)開發(fā)dsRNA作為外用殺蟲劑，是新型綠色殺蟲劑創(chuàng)制的一個(gè)重要方向。核酸農(nóng)藥(dsRNA)用于農(nóng)業(yè)害蟲的防治具有以下優(yōu)點(diǎn)：第一，dsRNA能高效專一控制目標(biāo)害蟲，對(duì)天敵昆蟲無危害；其次，dsRNA的使用，能有效阻止或減緩害蟲抗藥性發(fā)生；第三，能顯著降低化學(xué)農(nóng)藥的施用量，保證食品安全；此外，dsRNA屬于核酸，對(duì)環(huán)境無任何污染，是一種真正環(huán)境友好型農(nóng)藥，這對(duì)減少農(nóng)殘和環(huán)境污均具有重要的意義。但是，目前在研究中發(fā)現(xiàn)要提高RNAi效率，還有一些瓶頸問題尚需深入研究。

首先，RNAi在不同種類昆蟲中基因沉默效率存在差異性，例如研究發(fā)現(xiàn)赤擬谷盜等鞘翅目害蟲、蝗蟲等直翅目害蟲，以及蟑螂等蜚蠊目害蟲對(duì)RNAi較為敏感，RNAi后靶基因沉默效率較高；而棉鈴蟲、小菜蛾、草地貪夜蛾等鱗翅目害蟲，以及蚜蟲等半翅目害蟲對(duì)RNAi較不敏感，對(duì)靶基因沉默效率較低[60]。隨后研究發(fā)現(xiàn)，這可能是與昆蟲腸道內(nèi)含有一種雙鏈RNA酶(dsRNA-specific ribonucleases , dsRNases)有關(guān)，因?yàn)槠淇梢越到馔鈦淼膁sRNA。其次，dsRNA進(jìn)入昆蟲體內(nèi)后的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和擴(kuò)散機(jī)制目前還不十分清楚隨，這會(huì)影響進(jìn)入昆蟲體內(nèi)的dsRNA/siRNA的有效到達(dá)靶標(biāo)位置，從而影響基因沉默效果[61]。此外，目前實(shí)驗(yàn)室中通常制備dsRNA是采用商用試劑盒微量合成，而要作為核酸外施噴灑藥劑，則需要制備大量的dsRNA。因此，如何規(guī)?；凸S化生產(chǎn)合成dsRNA，是限制dsRNA作為核酸農(nóng)藥能否最終得到應(yīng)用的另一重要因素。綜上，針對(duì)害蟲體內(nèi)的靶標(biāo)基因的RNAi效率的提高以及如何工廠化大量合成dsRNA還有許多深層問題需要闡明和解決。

4.2 主要解決途徑

4.2.1 高效基因的篩選 昆蟲體內(nèi)重要靶標(biāo)基因篩選和鑒定是RNAi技術(shù)應(yīng)用于害蟲防治的先決要素。不是害蟲體內(nèi)所有的基因都能有效沉默基因，也不是所有的基因干擾(沉默)都能殺死害蟲。根據(jù)RNAi作用的基本原理，要做為新一代高效農(nóng)藥，只有那些對(duì)于昆蟲生長發(fā)育特別重要的基因才有可能作為潛在的殺蟲靶標(biāo)基因。因此，在重要害蟲中篩選具有致死作用的靶標(biāo)基因是將RNAi 技術(shù)應(yīng)用于害蟲控制的關(guān)鍵之一[62]。目前普遍認(rèn)為，作為綠色殺蟲劑設(shè)計(jì)的靶標(biāo)生物分子(基因)至少要同時(shí)具備如下兩個(gè)特征：①對(duì)靶標(biāo)生物的生長發(fā)育至關(guān)重要，以保證基于靶標(biāo)設(shè)計(jì)的dsRNA殺蟲劑具有高效性；②在高等動(dòng)植物體內(nèi)不存在或顯著區(qū)別于高等動(dòng)植物體內(nèi)的同源分子，以保證殺蟲劑的特異性和安全性[63]。

目前主要是從害蟲消化系統(tǒng)(例如唾液腺、消化酶)、生長發(fā)育系統(tǒng)(例如幾丁質(zhì)合成和代謝途徑、昆蟲蛻皮變態(tài)過程)，以及繁殖系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)(例如致育因子、卵黃蛋白)中分離鑒定具有重要功能的靶標(biāo)基因[64]。通過在蝗蟲、蚜蟲、棉鈴蟲、東方粘蟲等一些昆蟲中的研究，發(fā)現(xiàn)除過CHS外，唾液腺蛋白[65](C002)、V-ATP酶[66](V-ATPase)和蛻皮激素受體[67](EcR)等一系列功能蛋白對(duì)昆蟲的生長發(fā)育、繁殖也起著重要的作用。昆蟲唾液相關(guān)蛋白C002是一種水溶性唾液蛋白，在取食過程中發(fā)揮著重要作用。例如，通過對(duì)麥長管蚜唾液蛋白C002基因的RNAi研究，發(fā)現(xiàn)蚜蟲在取食dsRNA后的第八天，死亡率達(dá)到64%[65]。Baum等[66]對(duì)V-ATPase基因有干擾作用的基因序列(WCR dsRNAs)導(dǎo)入玉米植株中，玉米根葉甲取食轉(zhuǎn)基因玉米植株后導(dǎo)致幼蟲發(fā)育延緩，明顯降低了害蟲取食對(duì)玉米生長的影響。Shen等[67]近年對(duì)棉花紅蜘蛛的蛻皮激素受體進(jìn)行基因沉默(RNAi)后，發(fā)現(xiàn)若蟲發(fā)育為成蟲的過程明顯受阻，并導(dǎo)致試蟲死亡。

有上述可見，隨著今后越來越多的昆蟲基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組等數(shù)據(jù)被公布，更多的重要功能基因也會(huì)被鑒定和挖掘出來，所以將會(huì)有數(shù)量眾多的高效靶標(biāo)基因可通過RNAi技術(shù)應(yīng)用于害蟲防治中，這將會(huì)加速實(shí)現(xiàn)RNAi技術(shù)在害蟲防治中的真正應(yīng)用。

4.2.2 促進(jìn)RNAi應(yīng)用的有效途徑 在實(shí)際應(yīng)用中，許多研究發(fā)現(xiàn)無論哪種傳遞方式，單個(gè)關(guān)鍵基因的dsRNA都很難較快達(dá)到致死的劑量[62]，只能通過調(diào)節(jié)昆蟲的生長發(fā)育使其緩慢死亡。因此，多方面的措施聯(lián)用，可增強(qiáng)防控效果。有助于RNAi在害蟲防治中應(yīng)用的聯(lián)用措施主要有以下途徑。

首先是RNAi技術(shù)與現(xiàn)有的殺蟲劑聯(lián)用。RNAi技術(shù)通過靶基因的沉默，打破了昆蟲的正常生長發(fā)育，協(xié)助化學(xué)或生物殺蟲劑突破昆蟲體壁或圍食膜的阻擋，增強(qiáng)殺蟲劑的殺蟲效果。通過dsRNA干擾來沉默非洲瘧蚊幾丁質(zhì)合成酶AgCHS1基因，使得AgCHS1基因的轉(zhuǎn)錄水平和幾丁質(zhì)含量分別降低了62.8%和33.8%，增加了其幼蟲對(duì)除蟲脲的敏感性[68]。郭菊馨等[69]對(duì)淡色庫蚊海藻糖酶Tre1和幾丁質(zhì)合成酶CHS1進(jìn)行基因沉默，結(jié)果表明試蟲對(duì)溴氰菊酯的敏感性提高。另外研究發(fā)現(xiàn)，RNAi技術(shù)與Bt農(nóng)藥聯(lián)用，可以累積兩種作用方式的效應(yīng)。對(duì)甜菜夜蛾3齡幼蟲的SeCHS2基因進(jìn)行沉默后，飼喂Bt毒素發(fā)現(xiàn)幼蟲對(duì)Cry毒素的敏感性顯著提高，甜菜夜蛾的高死亡率可能是靶基因SeCHS2的RNAi效應(yīng)和Cry毒性的協(xié)同作用的結(jié)果[70]。

其次是多靶基因RNAi。利用多個(gè)目標(biāo)基因同時(shí)沉默可進(jìn)一步提高RNAi效率。趙鳳通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)CmTre和CmCHS基因dsRNA的水稻，以其葉片飼喂稻縱卷葉螟，發(fā)現(xiàn)CmTre1、CmTre2、CmCHS1和CmCHS2基因表達(dá)量均顯著下降，幼蟲體型較小，畸形甚至死亡[71]。Tzin等[72]人對(duì)蚜蟲多個(gè)滲透調(diào)節(jié)基因(水通道蛋白、蔗糖酶、糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)進(jìn)行組合，聯(lián)合RNAi對(duì)血淋巴滲透壓的影響明顯大于單個(gè)基因的功能。由此可見，同時(shí)干擾多個(gè)具有相關(guān)作用的靶標(biāo)基因更能導(dǎo)致害蟲生物功能的改變和有助于殺死害蟲。與現(xiàn)有農(nóng)藥或多靶標(biāo)的聯(lián)用，不僅能夠減少害蟲防治中對(duì)dsRNA濃度的要求，同時(shí)能夠減少殺蟲劑的使用劑量，有效防止農(nóng)藥過量使用對(duì)環(huán)境和人的危害并延緩抗藥性的產(chǎn)生。

此外，還有納米粒子與dsRNA偶聯(lián)，制備納米dsRNA農(nóng)藥。納米材料具有可修飾性強(qiáng)、水溶液分散性好和光催化降解等特點(diǎn)為dsRNA的傳遞提供了新的思路[73]。為了增強(qiáng)dsRNA在應(yīng)用中的穩(wěn)定性，已經(jīng)研發(fā)出了無毒并可降解的納米材料，dsRNA搭載后穩(wěn)定性明顯提高，噴灑在葉面上不僅耐雨水沖刷且穩(wěn)定期達(dá)30 d[74]。納米材料的應(yīng)用，使dsRNA不僅可以通過昆蟲取食進(jìn)入昆蟲體內(nèi)，還可以直接通過體壁滲透。比如，沈杰教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)出利用納米材料介導(dǎo)dsRNA從蚜蟲體壁進(jìn)入體內(nèi)的方式，從而達(dá)到干擾昆蟲生長發(fā)育的目的[75]。與通過納米粒子包被增加dsRNA吸收、傳遞效率類似的策略，還有脂質(zhì)體修飾。研究表明，脂質(zhì)體修飾的dsRNA在德國小蠊、斑翅果蠅等昆蟲中RNAi能明顯提高靶標(biāo)基因的沉默效率[76～77]。

4.2.3 利用微生物發(fā)酵工程工廠化大規(guī)模合成生產(chǎn)dsRNA 利用商用試劑盒合成dsRNA雖然可以得到純度較高的dsRNA，但是成本太高，而且合成量極為有限，且操作復(fù)雜，無法滿足田間應(yīng)用的需求。因此，可以利用大腸桿菌HT115(DE3) 合成多個(gè)目的基因的重組dsRNA，這樣可以極大降低合成成本，簡化合成步驟。策略是設(shè)計(jì)帶有害蟲靶標(biāo)基因序列的RNAi 載體，再將載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，就可以不斷的得到大量目的基因的dsRNA[48,62,78～79]。馬中正[78]通過基因工程菌高效合成了靶向異色瓢蟲基因的dsRNA。Vatanparast[79]通過大腸桿菌(HT115)合成了甜菜夜蛾胰凝乳蛋白酶SeCHY2基因的dsRNA，并通過超聲預(yù)處理菌液，從而提高甜菜夜蛾幼蟲口服的死亡率。

5 RNAi技術(shù)應(yīng)用于害蟲防治的小結(jié)與展望

RNAi介導(dǎo)的靶基因沉默途徑具有特異、高效的優(yōu)點(diǎn)，以及技術(shù)過程的簡便性，現(xiàn)已被廣泛用于重要農(nóng)業(yè)害蟲綠色防控新技術(shù)開發(fā)中。昆蟲幾丁質(zhì)合成酶，是昆蟲幾丁質(zhì)代謝過程中的關(guān)鍵酶之一，由于高等動(dòng)物及植物體內(nèi)不存在該酶，而被認(rèn)為是理想的殺蟲劑靶標(biāo)[3]。目前已有眾多Tre、CHS等幾丁質(zhì)合成相關(guān)的關(guān)鍵酶基因被鑒定和研究。基于幾丁質(zhì)合成關(guān)鍵酶等的RNAi技術(shù)在害蟲防治中的應(yīng)用可通過兩種策略實(shí)現(xiàn)：一是植物介導(dǎo)的RNAi; 二是直接體外噴灑dsRNA(核酸農(nóng)藥)。雖然基于害蟲體內(nèi)重要基因?yàn)榘袠?biāo)的RNAi技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)害蟲潛力巨大、前景誘人，但是目前還面臨一些瓶頸問題，比如不同昆蟲靶基因的RNAi效率的差異性、dsRNA合成的高成本等問題尚需進(jìn)一步闡明和解決。此外，納米材料偶聯(lián)包被、脂質(zhì)體修飾、與BT等殺蟲劑聯(lián)用，以及多標(biāo)靶聯(lián)用等都需要系統(tǒng)深入開展，以促進(jìn)RNAi技術(shù)在防控害蟲中得到廣泛應(yīng)用。相信，隨著對(duì)幾丁質(zhì)合成途徑研究的不斷深入，基于該途徑的關(guān)鍵酶基因?yàn)榘袠?biāo)的RNAi技術(shù)在今后害蟲綠色防治中將會(huì)發(fā)揮重要作用。