王大全，夏丹丹，縱凱莉，孫永鑫，楊劍婷

(安徽科技學(xué)院 食品工程學(xué)院，安徽 滁州 233100)

桑葚又名桑果、桑棗，作為一種很古老的水果和中藥[1]，已經(jīng)被國家列為“藥食同源產(chǎn)品”[2]。桑葚中除了含有有機(jī)酸、維生素、氨基酸等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外[3-4]，還含有花色苷和酚類等多種功能成分[5]。研究顯示，桑葚能有效地清除自由基[6]，具有抗腫瘤[7]、降血糖[8]、降低脂肪[9]等多種功效。藍(lán)莓又稱“越橘”，其果實(shí)中富含花色苷、黃酮、多酚等多種活性成分，具有延緩衰老、預(yù)防心血管疾病、降血脂等多種對(duì)人體非常有益的功能[10]。桑葚和藍(lán)莓由于不易儲(chǔ)藏，少部分用于鮮食，主要用于生產(chǎn)加工，例如果酒、果醬、果醋等制品。但是由于桑葚和藍(lán)莓中果膠含量豐富，在果實(shí)破碎制汁的加工中影響花青素從細(xì)胞中的溶出[11]，因此常用果膠酶、纖維素酶以及復(fù)合酶使得花色苷便于從細(xì)胞中溶出。研究發(fā)現(xiàn)果膠酶不僅可以提高楊梅花色苷的提取量，而且不影響花色苷的抗氧化活性[12]。藍(lán)莓和桑葚含有豐富的花色苷，其結(jié)構(gòu)中的酚羥基在植物組織中具有保護(hù)易氧化成分的作用，具有很強(qiáng)的抗氧化活性[13]，利用這一特性，開發(fā)出一款具有抗氧化活性的桑葚藍(lán)莓復(fù)合飲料。

本研究以桑葚、藍(lán)莓為原材料制備桑葚藍(lán)莓復(fù)合飲料，利用復(fù)合果膠酶對(duì)桑葚、藍(lán)莓原汁進(jìn)行前處理，提高花色苷溶出量，確定最佳酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度，在此基礎(chǔ)上添加一定量的檸檬酸、蔗糖，通過復(fù)配制備桑葚藍(lán)莓復(fù)合飲料，并以DPPH、ABTS自由基清除率、總還原力為指標(biāo)與相同質(zhì)量濃度的維生素C相比較，對(duì)該功能性復(fù)合飲料的抗氧化活性進(jìn)行研究，旨在為富含花色苷功能性飲品的開發(fā)提供理論依據(jù)和方法基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓，安徽省鳳陽縣健民藍(lán)莓農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司；桑葚，亳州鑫地生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司；復(fù)合果膠酶(酶活力100000 U/g)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸，合肥盛潤(rùn)生物制品有限公司；蔗糖，合肥徽宣食品有限公司；鹽酸、氯化鉀、六水合三氯化鐵、六氰合鐵(Ⅲ)酸鉀(鐵氰化鉀)、三氯化鐵、三氯乙酸、無水乙醇(95%)、2,2’-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑林-6-磺酸)二銨鹽(2,2’-Azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid Ammonium Salt)ABTS)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1,1-聯(lián)苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical DPPH)，北京百奧萊博科技有限公司，以上化學(xué)試劑皆為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

pH計(jì)(PHS-3C)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；分析天平(JA303P)，常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司；紫外分光光度計(jì)(SP-752)，上海光譜儀器有限公司；均質(zhì)機(jī)(D-500Pro)，上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；離心機(jī)(RJ-TDL-50A)，無錫市瑞江分析儀器有限公司。

1.3 桑葚藍(lán)莓復(fù)合飲料的制備方法

選擇無機(jī)械損傷和腐爛的桑葚、藍(lán)莓，去除果梗，置于破壁機(jī)處理3 min，得到桑葚果漿和藍(lán)莓果漿，加入適量復(fù)合果膠酶，在一定溫度下處理一段時(shí)間，200目濾布過濾取濾液即為桑葚、藍(lán)莓原汁，避光冷藏備用。將處理好的桑葚、藍(lán)莓原汁按一定比例混合均勻，添加適宜含量的檸檬酸、蔗糖進(jìn)行調(diào)配。用玻璃瓶進(jìn)行灌裝后，采用高溫瞬時(shí)殺菌法(121 ℃，10 s)對(duì)復(fù)合飲料進(jìn)行滅菌[14]。

1.4 復(fù)合果膠酶酶解最佳條件的確定

以花色苷溶出量為指標(biāo)，選取酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間三個(gè)因素，確定最佳酶解條件。因素水平見表1。

表1 復(fù)合果膠酶酶解試驗(yàn)因素水平表

1.5 復(fù)合飲料最佳配方的確定

將桑葚原汁和藍(lán)莓原汁及檸檬酸、蔗糖進(jìn)行調(diào)配(以100 mL為標(biāo)準(zhǔn))，以感官評(píng)分為指標(biāo)確定最佳配方，因素水平見表2。

表2 復(fù)合飲料配比實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表3 正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

1.7 感官評(píng)價(jià)

桑葚藍(lán)莓復(fù)合飲料的配方評(píng)價(jià)采用感官綜合評(píng)分法，參照GB7101-2015食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)飲料進(jìn)行評(píng)價(jià)[15]，制定出評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，如表4所示。邀請(qǐng)具備飲料感官評(píng)價(jià)能力的10名感官評(píng)價(jià)者，根據(jù)飲料的色澤、口感、氣味與質(zhì)地進(jìn)行評(píng)分。

表4 桑葚藍(lán)莓復(fù)合飲料的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.8 桑葚、藍(lán)莓原汁和復(fù)合飲料中花色苷測(cè)定

采取pH示差法[16]測(cè)定。精確量取1 mL原汁或飲料于25 mL試管中，分別用pH值為1.0和4.5的緩沖溶液定容，低溫(4 ℃)靜置120 min，測(cè)定其在520 nm和700 nm處的吸光度值，按公式(1)計(jì)算花色苷含量。

(1)

公式(1)中，A=(A520-A700)pH1.0-(A520-A700)pH4.5；M：Cy-3-Glu(矢車菊色素-3-葡萄糖苷)的相對(duì)分子量(449.2)；Df：稀釋倍數(shù)；ε：Cy-3-Glu的摩爾消光系數(shù)(26900)；L：光程長(zhǎng)度(1 cm)。

1.9 桑葚藍(lán)莓復(fù)合飲料抗氧化活性測(cè)定

將制備好的復(fù)合飲料根據(jù)其花色苷含量，將其質(zhì)量濃度調(diào)整為20、40、60、80、100 μg/mL，分別測(cè)定其DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、總還原力，并與相同濃度下的維生素C進(jìn)行比較。

DPPH自由基清除率的測(cè)定：取稀釋后不同濃度的復(fù)合飲料2.0 mL與0.1 mmol/LDPPH乙醇溶液2.0 mL充分反應(yīng)30 min，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值A(chǔ)1；將復(fù)合飲料和DPPH乙醇溶液用無水乙醇進(jìn)行替換，按照上述方法，分別測(cè)定其吸光值A(chǔ)0、A2。采用相對(duì)應(yīng)濃度的維生素C作為復(fù)合飲料的對(duì)照，重復(fù)測(cè)定3次。DPPH自由基清除率按公式(2)計(jì)算[17]。

(2)

公式(2)中，A1：復(fù)合飲料的吸光度；A2：無水乙醇取代復(fù)合飲料的吸光度；A0：無水乙醇取代DPPH乙醇溶液的吸光度。

ABTS自由基清除率的測(cè)定：取7 mmol/L的ABTS溶液10 mL和140 mmol/L的過硫酸鉀溶液0.440 mL混合均勻，存放于室溫、避光條件下12-16 h。用0.1 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋混合后的溶液至其在734 nm處的吸光值為(0.70±0.02)。準(zhǔn)確吸取1 mL不同質(zhì)量濃度的復(fù)合飲料樣液加入到4 mL ABTS溶液中，在30 ℃水浴中反應(yīng)6 min。以去離子水為參比溶液，以相同濃度的維生素C溶液作為對(duì)照，在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，每組分別設(shè)置3個(gè)平行，根據(jù)公式(3)計(jì)算ABTS自由基清除率[18]。

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大部分醫(yī)護(hù)工作者認(rèn)為醫(yī)護(hù)職業(yè)風(fēng)險(xiǎn)大、責(zé)任重，在日常診治、護(hù)理中經(jīng)常會(huì)面臨一些突發(fā)狀況。因此，應(yīng)關(guān)注醫(yī)護(hù)工作者生存狀態(tài)，制定相關(guān)政策法規(guī)，維護(hù)醫(yī)護(hù)工作者的合法權(quán)益。同時(shí)，借助大眾傳媒在公眾心目中樹立良好的醫(yī)護(hù)工作者職業(yè)形象，突出其在社會(huì)發(fā)展中的重要作用和無私奉獻(xiàn)精神，提高公眾對(duì)醫(yī)護(hù)工作者的尊重和信任，以增強(qiáng)醫(yī)護(hù)工作者的職業(yè)認(rèn)同程度。

公式(3)中，A1：加入復(fù)合飲料后的吸光度；A2：用去離子水代替ABTS溶液的吸光度；A0：用去離子水代替復(fù)合飲料的吸光度。

總還原力的測(cè)定：采用鐵氰化鉀還原顯色法[19]。將0.2 mL不同質(zhì)量濃度的復(fù)合飲料置于試管內(nèi)，按順序添加0.2 mol/L的磷酸鈣緩沖液1.0 mL和1%的鐵氰酸鉀1.0 mL，在50 ℃下熱水浴20 min，然后添加1.0 mL 10%三氯醋酸溶液，使該反應(yīng)過程終止，在4 ℃下3000 r/min離心10 min，取上清液2.0 mL，加入2.0 mL蒸餾水和0.4 mL 0.1%FeCl3溶液，混和均勻后靜置15 min，在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值A(chǔ)1，用蒸餾水取代復(fù)合飲料樣品液，測(cè)定吸光值A(chǔ)2。采用相對(duì)應(yīng)濃度的維生素C作為對(duì)照，每個(gè)條件下的實(shí)驗(yàn)都重復(fù)測(cè)定三次?？傔€原力按公式(4)計(jì)算。

總還原力 =A1-A2

(4)

式中，A1：復(fù)合飲料的吸光度；A2：蒸餾水取代復(fù)合飲料的吸光度。

1.10 數(shù)據(jù)處理

每組樣品試驗(yàn)做3次平行，圖表的繪制分別采用Origin 2022和Excel軟件，利用IBM SPSS 25.0對(duì)其進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶添加量對(duì)桑葚、藍(lán)莓原汁中花色苷含量影響

如圖1，酶添加量為0.02%-0.06%時(shí)，桑葚、藍(lán)莓的花色苷溶出量增速較快，在酶添加量為0.06%時(shí)，二者均達(dá)到最大值，其中花色苷含量：桑葚(52.08±0.36) mg/L，藍(lán)莓(313.67±0.35) mg/L。當(dāng)果膠酶添加量超過0.06%后，花色苷的溶出量逐漸下降，這是過量的果膠酶使花色苷的糖苷鍵水解斷裂導(dǎo)致的[20]。研究表明，部分果膠酶具有β-糖苷酶和肉桂酸酯酶活性，從而使花色苷去糖基化形成不穩(wěn)定的花色苷元，也會(huì)使花色苷的含量降低[21]。

2.2 酶解溫度對(duì)桑葚和藍(lán)莓花色苷含量的影響

如圖2所示，在20-60 ℃的酶解溫度范圍內(nèi)，桑葚和藍(lán)莓花色苷含量變化趨勢(shì)相一致。在30 ℃之前，桑葚和藍(lán)莓花色苷含量隨酶解溫度升高而增加，在30 ℃時(shí)二者均達(dá)到最大值，其中桑葚(76.148±1.28) mg/L，藍(lán)莓(278.14±2.28) mg/L。溫度大于30 ℃時(shí)，花色苷的溶出速率出現(xiàn)了明顯的降低，這是因?yàn)闇囟壬撸ㄉ盏姆纸馑俣燃涌?，穩(wěn)定性降低。研究顯示將桑葚花色苷分別在60 ℃、80 ℃和100 ℃恒溫下保存4 h，對(duì)其花色苷降解率進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)60 ℃時(shí)花色苷降解率最小，隨溫度升高花色苷嚴(yán)重降解[22]。測(cè)定凍干野生藍(lán)莓粉在25、42、60、80 ℃ 4個(gè)不同溫度下花色苷的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)在25 ℃時(shí)花色苷的穩(wěn)定性最好[23]。

圖1 不同酶添加量的桑葚、藍(lán)莓原汁中花色苷含量

圖2 不同酶解溫度的桑葚、藍(lán)莓原汁中花色苷含量

2.3 酶解時(shí)間對(duì)桑葚、藍(lán)莓花色苷含量的影響

如圖3所示，酶解時(shí)間范圍為30-150 min時(shí)，花色苷含量隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)先升高后降低，在120 min時(shí)花色苷含量達(dá)到最大值，其中桑葚(77.48±1.35) mg/L，藍(lán)莓(295.76±1.68) mg/L。本實(shí)驗(yàn)中花色苷含量隨酶解時(shí)間的變化趨勢(shì)與Buchert等的研究結(jié)果相一致[24]。在120 min時(shí)，酶解過程基本完成，當(dāng)花色苷的含量達(dá)到最大時(shí)，隨著時(shí)間的增加，因其不穩(wěn)定而發(fā)生氧化分解，使其溶解速率降低，可能是由于長(zhǎng)時(shí)間的氧或光照直接促進(jìn)了花色苷的降解[25-26]。

圖3 不同酶解溫度的桑葚、藍(lán)莓原汁中花色苷含量

2.4 不同比例的桑葚藍(lán)莓原汁對(duì)復(fù)合飲料感官評(píng)分的影響

不同比例桑葚藍(lán)莓原汁對(duì)感官評(píng)分的影響如圖4所示。在桑葚、藍(lán)莓原汁比例為3∶2時(shí)，各項(xiàng)感官評(píng)分最高。桑葚原汁比例過低或過高其感官評(píng)分都有所降低，是由于桑葚原汁或藍(lán)莓原汁過多會(huì)掩蓋對(duì)方的香氣風(fēng)味，導(dǎo)致風(fēng)味缺失，引起口感不適。

圖4 不同比例桑葚、藍(lán)莓原汁對(duì)復(fù)合飲料感官評(píng)分的影響

2.5 檸檬酸添加量對(duì)復(fù)合飲料感官評(píng)分的影響

檸檬酸是一種有機(jī)酸，可以適量添加于飲料中，具有提升口感的作用。如圖5所示，檸檬酸的添加量在0.15%時(shí)，復(fù)合飲料酸甜可口，表現(xiàn)出較好的口感，各項(xiàng)感官評(píng)分均為最高。添加量大于或小于0.15%時(shí)，復(fù)合飲料的感官評(píng)分均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其原因?yàn)闄幟仕岬奶砑訉?dǎo)致復(fù)合飲料糖酸比例失調(diào)，飲料表現(xiàn)出過酸和酸味缺失的狀況，致使口感不佳。

2.6 蔗糖添加量對(duì)復(fù)合飲料感官評(píng)分的影響

在飲料中添加蔗糖不僅可以增加飲料的甜度，而且可以掩蓋飲料中的澀味。如圖6所示，在蔗糖添加量為8%時(shí)，復(fù)合飲料的感官評(píng)分最高，添加量高于8%時(shí)，飲料甜度過大，掩蓋復(fù)合飲料所特有的風(fēng)味，導(dǎo)致口感不佳。添加量低于8%時(shí)，復(fù)合飲料的酸澀味突顯出來，引起口感不適，使各項(xiàng)感官評(píng)分有所降低。

圖5 檸檬酸添加量對(duì)復(fù)合飲料感官評(píng)分的影響

圖6 蔗糖添加量對(duì)復(fù)合飲料感官評(píng)分的影響

2.7 復(fù)合飲料配比正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如表5所示，通過對(duì)比分析得出最優(yōu)組合為A1B1C2D2，即桑葚原汁添加量60 mL，藍(lán)莓原汁添加量40 mL，檸檬酸添加量0.15%，蔗糖添加量8%。通過R值的比較得出各個(gè)因素對(duì)復(fù)合飲料的感官品質(zhì)影響依次為A> B>C>D，即桑葚原汁的添加量對(duì)復(fù)合飲料的影響是最大的，其次是藍(lán)莓原汁的添加量、檸檬酸的添加量，蔗糖的添加量對(duì)復(fù)合飲料的影響最小。

表5 復(fù)合飲料正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表

比較表5中數(shù)據(jù)可得，在9個(gè)試驗(yàn)結(jié)果中試驗(yàn)1和2的分?jǐn)?shù)最高，但二者差異不顯著；正交試驗(yàn)所得最優(yōu)組合是A1B1C2D2，因此需要進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)來確定最終的水平組合。驗(yàn)證試驗(yàn)得出，組合A1B1C2D2的復(fù)合飲料感官評(píng)分最高，為(94.5±2.14)分，因此認(rèn)為A1B1C2D2為最優(yōu)配方。

2.8 桑葚藍(lán)莓復(fù)合飲料對(duì)DPPH自由基的清除率

DPPH是一類重要的自由基，其主要作用是研究其抗氧化性。其原理是以DPPH的脫色為基礎(chǔ)，通過將DPPH溶液與供氫體進(jìn)行混合，使其苦味醇肼基(紫色)還原為苦味醇肼(淡黃)[27]。DPPH的還原性能取決于它在517 nm處的吸收率。由圖7可知，DPPH自由基清除能力隨著復(fù)合飲料濃度的增大而增強(qiáng)。在20-60 ug/mL的復(fù)合飲料中，其DPPH自由基清除率顯著提高。維生素C對(duì)DPPH的清除能力始終很強(qiáng)。在100 ug/mL的質(zhì)量濃度下，復(fù)合飲料與維生素C對(duì)照組均能最大限度地清除DPPH，清除率分別為 (87.48±1.26)%和(94.14±1.62)%，此時(shí)，復(fù)合飲料的清除能力達(dá)到維生素C清除率的92.93%，具有與其相當(dāng)?shù)目寡趸芰Α?/p>

圖7 不同濃度桑葚藍(lán)莓復(fù)合飲料和維生素C的

2.9 桑葚藍(lán)莓復(fù)合飲料對(duì)ABTS自由基的清除率

從圖8可以看出，在相同的質(zhì)量濃度下，復(fù)合飲料的ABTS的清除能力一直低于維生素C。隨著質(zhì)量濃度的增大，復(fù)合飲料與維生素C對(duì)照組的ABTS清除率逐漸升高，復(fù)合飲料的增大幅度大于維生素C。當(dāng)質(zhì)量濃度在20-60 ug/mL之間時(shí)，對(duì)ABTS來說，復(fù)合飲料與維生素C對(duì)照組清除能力差距較大，但隨著質(zhì)量濃度的增加兩者之間的差值越來越小。復(fù)合飲料清除率在質(zhì)量濃度為100 ug/mL時(shí)達(dá)到最大為(75.78±1.4)%，達(dá)到維生素C清除率的80.02%，說明該復(fù)合飲料已經(jīng)具有較好的抗氧化能力。

圖8 不同濃度桑葚藍(lán)莓復(fù)合飲料溶液和維生素C的

2.10 桑葚藍(lán)莓復(fù)合飲料總還原力的測(cè)定

還原能力越強(qiáng)，抗氧化活性越強(qiáng)[28]。從圖9可以看出，當(dāng)質(zhì)量濃度增大時(shí)，復(fù)合飲料和維生素C的還原能力均提高。復(fù)合飲料的還原性能比相同質(zhì)量濃度維生素C的要差。在60-100 ug/mL的質(zhì)量濃度下，該復(fù)合飲料的還原能力增幅較大，在100 ug/mL的質(zhì)量濃度下，復(fù)合飲料的還原力達(dá)到最大為(1.024±0.02)，達(dá)到同等質(zhì)量濃度維生素C還原力的83%，具有較好的抗氧化能力。

圖9 不同濃度桑葚藍(lán)莓復(fù)合飲料

3 結(jié)論

采用單因素以及正交實(shí)驗(yàn)確定桑葚藍(lán)莓復(fù)合飲料制備的最佳工藝，即復(fù)合果膠酶前處理桑葚藍(lán)莓原汁，酶解時(shí)間120 min、酶添加量0.06%、酶解溫度30 ℃時(shí)，桑葚藍(lán)莓花色苷溶出量最高。最佳復(fù)配比例為桑葚藍(lán)莓原汁每百毫升比例為3∶2，檸檬酸添加量0.15%、蔗糖添加量8%，所制備的復(fù)合飲料口感潤(rùn)滑，澄清度高，感官評(píng)分最高為(94.5±2.14)分。其DPPH、ABTS自由基清除率、總還原力分別達(dá)到同質(zhì)量濃度維生素C的92.92%、80.02%、83%，說明該復(fù)合飲料具有較好的抗氧化活性。本研究不僅為富含花色苷功能性飲品的開發(fā)提供了理論依據(jù)和方法基礎(chǔ)，而且為桑葚藍(lán)莓資源的高效利用提供了技術(shù)支持。