劉廣超 葉青 車永梅 李雅華 安東 劉新

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 山東省高校植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266109）

磷元素是植物生長發(fā)育必需的大量元素之一，是構(gòu)成核酸、蛋白質(zhì)和磷脂等重要物質(zhì)的組成成分，廣泛參與植物的各種代謝過程。植物對(duì)磷的需求量大，土壤中磷含量較高，但大部分磷并不能被植物直接吸收利用，土壤中有效磷含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足植物的需求，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中通常通過施用化學(xué)磷肥補(bǔ)充植物所需的磷［1］。解磷菌是存在于土壤中的一類根際促生菌，可以將土壤中植物難以吸收利用的磷轉(zhuǎn)化為可被植物利用的形態(tài)。開發(fā)微生物肥料，利用解磷微生物將土壤中的無效磷轉(zhuǎn)化為有效磷，提高土壤磷的利用效率，改善土壤結(jié)構(gòu)，減少化肥用量，對(duì)于發(fā)展綠色可持續(xù)農(nóng)業(yè)具有重要意義。

解磷菌的種類與土壤質(zhì)地、植物種類、根際環(huán)境等相關(guān)，主要包括細(xì)菌、真菌和放線菌等，其中細(xì)菌占絕大多數(shù)。目前已分離鑒定了多種解磷菌，并研究了其解磷功能、作用機(jī)理及對(duì)植物生長的影響，根據(jù)作用底物不同又可以將解磷菌分為解無機(jī)磷微生物和解有機(jī)磷微生物［2］。解磷菌主要通過分泌葡萄糖酸、乙酸、草酸及檸檬酸等有機(jī)酸溶解無機(jī)磷，通過分泌堿性和酸性磷酸酶分解有機(jī)磷［3-4］。不同解磷菌對(duì)不同形式的磷轉(zhuǎn)化能力存在差異。Wu等［5］以及Yang等［2］從杭州西湖和武漢巢湖等地分離到多種解有機(jī)磷菌和解無機(jī)磷菌；從缺磷土壤中分離的馬昆德擬青霉（Paecilomyces marquandii）AA1對(duì)不同產(chǎn)地的磷礦有不同分解能力［6］；從綠豆根際分離到的解磷菌泡盛曲霉（Aspergillus awamori）S29對(duì)二磷酸鈣分解能力強(qiáng)，其次是磷酸三鈣［7］；從香蕉根際分離到40株解磷菌，具有溶解Ca3(PO4)2的作用，其中3株可以分解大豆卵磷脂，但均無分解FePO4的作用［8］；從大豆根際分離的解磷菌成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans）R-42具有一定分解FePO4和AlPO4的能力［9］。多數(shù)解磷菌對(duì)植物生長有促進(jìn)作用，可以促進(jìn)綠豆、水稻、小麥、薄荷以及大豆和白菜等作物生長（Mentha arvensisL）［7，10-13］，但泛菌屬（Pantoeasp.）解磷菌A34和科薩克氏菌屬（Kosakoniasp.）解磷菌B7對(duì)番茄根和幼苗生長起抑制作用［14］。因此分離鑒定不同性質(zhì)和功能、對(duì)植物有良好促生作用的解磷微生物，可以為微生物肥料的生產(chǎn)提供充足的微生物資源，以滿足更廣條件下農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需求。

植物根際土壤（rhizosphere soil）是植物能量和物質(zhì)代謝最活躍的部位之一。在植物根際土壤中生存著大量的微生物，其數(shù)量遠(yuǎn)高于非根際土壤。本研究從煙草根際土壤中分離篩選到一株同時(shí)解有機(jī)磷和無機(jī)磷的不動(dòng)桿菌屬的細(xì)菌3P29，對(duì)其進(jìn)行生理生化和分子生物學(xué)鑒定，并通過煙草促生試驗(yàn)驗(yàn)證該菌株對(duì)煙草的促生作用，為該菌株在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的開發(fā)利用及生物肥料的研發(fā)提供微生物資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 土壤樣品取自山東省濰坊市高密市方市鄉(xiāng)煙草根際土壤，采樣深度10-20 cm，置于4℃冰箱中保存，備用。

1.1.2 培養(yǎng)基 以下培養(yǎng)基配方均為液態(tài)培養(yǎng)基，固態(tài)培養(yǎng)基需在此基礎(chǔ)上添加15 g瓊脂。

有機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，硫酸銨0.5 g，酵母浸粉0.5 g，氯化鈉0.3 g，氯化鉀0.3 g，硫酸鎂0.3 g，硫酸亞鐵0.03 g，硫酸錳0.03 g，卵磷脂0.2 g，碳酸鈣1.0 g，pH 7.0-7.5，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌15 min。

無機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，硫酸銨0.5 g，酵母浸粉0.5 g，氯化鈉0.3 g，氯化鉀0.3 g，硫酸鎂0.3 g，硫酸亞鐵0.03 g，硫酸錳0.03 g，磷酸鈣5.0 g，pH 7.0-7.5，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌30 min。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，pH 7.0-7.2，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 解磷菌的初篩 將供試根際土壤稱取10 g，置于含玻璃珠和90 mL 無菌水的三角瓶中，28℃，120 r/min振蕩20 min，靜置30 min，取上清即得到稀釋度為10-1的根際土壤稀釋液，用10倍稀釋法分別配制10-3、10-4、10-5、10-6g/mL的土壤懸液，分別涂布到有機(jī)磷及無機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)4 d，觀察出現(xiàn)溶磷圈的菌落，根據(jù)能否產(chǎn)生溶磷圈及測定溶磷指數(shù)（溶磷指數(shù)=透明圈直徑/菌落直徑）來初步確定菌株的溶磷能力。將篩選出的菌株利用平板劃線法分離純化后，4℃下保存于LB斜面培養(yǎng)基，-80℃保存菌種于甘油管中。

1.2.2 解磷菌株的復(fù)篩 250 mL三角瓶中分別裝入有機(jī)磷及無機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基100 mL，高壓滅菌121℃、25 min備用。將在LB斜面培養(yǎng)基上生長24 h的細(xì)菌制成菌懸液（菌數(shù)約為1×107CFU/mL），將解磷菌菌懸液1 mL接種于上述滅菌的液體細(xì)菌培養(yǎng)基中，以不接菌為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)，搖床培養(yǎng)（28℃，120 r/min）3 d，利用鉬銻抗比色法［5］測定可溶性磷含量。

1.2.3 解磷菌的生理生化及分子生物學(xué)分析

1.2.3.1 篩選解磷菌株形態(tài)學(xué)特征 菌落形態(tài)：將篩選得到的菌株劃線接種到LB固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24 h，觀察其菌落大小、形狀、透明度、光滑度、顏色等特點(diǎn)。

個(gè)體形態(tài)：革蘭氏染色，用接種環(huán)挑取18-24 h菌株培養(yǎng)液于載玻片無菌水中，室溫自然干燥后火焰固定，滴加適量草酸銨結(jié)晶紫染色l min，傾去染色液，用水沖洗至無色，然后用革蘭氏碘液染色2 min，水洗，乙醇脫色30 s，水洗后用石炭酸復(fù)紅染10 s，水洗，晾干后鏡檢。

1.2.3.2 篩選解磷菌株生理生化特征 糖類發(fā)酵試驗(yàn)、動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、解鉀性試驗(yàn)、固氮性試驗(yàn)、產(chǎn)生長素試驗(yàn)、產(chǎn)鐵載體試驗(yàn)的方法均參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第8版）進(jìn)行。

1.2.3.3 溶磷菌株分泌IAA特性測定 將分離純化的菌株接種于 LB 液體培養(yǎng)基中（添加L-色氨酸，使終濃度為0.5 g/L），37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，離心后取50 μL上清液加入等體積Sackowcki’s顯色劑在比色皿中避光顯色30 min后觀察，若出現(xiàn)粉紅色則為陽性，說明該菌株能夠分泌IAA。

1.2.3.4 解磷菌分子生物學(xué)鑒定 菌株劃板后挑取單菌落，接種于20 mL三角瓶振蕩培養(yǎng)16-18 h，取1 mL菌液10 000 r/min離心1 min，棄上清，沉淀加200-300 μL無菌水，沸水浴10 min，立即置于-20℃處理3 min后12 000 r/min 4℃離心5 min，取上清即為模板，采用采用細(xì)菌16S rDNA通用引物：27f（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）、1492r（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）及gyrB通 用 引物：gyrBf（5'-CAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3'）、gyrBr（5'-CCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3'）進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片斷長度為1.5 kb。PCR程序?yàn)?4℃預(yù)變性4 min，94℃變性0.5 min，51℃退火0.5 min，72℃延伸1.5 min，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化回收，交由上海生物工程有限公司進(jìn)行測序，將16S rDNA基因序列與RDP數(shù)據(jù)庫中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析，在BLAST數(shù)據(jù)庫搜索gyrB基因同源序列，使用MEGA 6.0軟件，以Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 土壤營養(yǎng)元素含量和酶活性檢測 將187.5 mL解磷菌（菌數(shù)約為3.5×108CFU/mL）菌液經(jīng)離心棄上清后，將菌體沉淀用等體積滅菌水懸浮，再接種到裝有750 g泥炭土的塑料花盆里，同時(shí)設(shè)置滅活解磷菌的對(duì)照組，置于28℃溫室中培養(yǎng)，每周澆水一次，每隔10 d進(jìn)行土壤氮、磷和鉀元素含量以及酶活性測定。

土壤中總氮采用凱氏定氮法測定，速效氮采用滴定法測定，總磷和速效磷采用鉬銻抗比色法測定，總鉀和速效鉀采用火焰分光光度計(jì)法測定［15］。脲酶采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定［16］；酸性磷酸酶采用磷酸苯二鈉比色法測定［17］；蔗糖酶采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定［18］。

1.2.5 解磷菌促生作用分析 消毒的煙草種子于28℃黑暗條件下催芽，發(fā)芽后移栽至含750 g泥炭土的塑料花盆中。實(shí)驗(yàn)設(shè)滅活解磷菌（對(duì)照）和接種解磷菌兩組處理。接種解磷菌的煙草幼苗每盆澆含187.5 mL菌液（菌 數(shù)約3.5×108CFU/mL），經(jīng)離心棄上清后，等體積無菌水懸浮后接種，對(duì)照每盆施等量滅活菌液。兩組處理每盆澆花無缺營養(yǎng)液100 mL（花無缺水溶肥購自上海永通化工有限公司），于25℃，12 h/12 h光周期，光強(qiáng)200 μmol/（m2·s）條件下培養(yǎng)，每周澆水兩次，培養(yǎng)45 d后進(jìn)行生長指標(biāo)和葉片氮、磷和鉀含量的測定。

2 結(jié)果

2.1 根際土壤高效解磷菌的分離篩選

經(jīng)稀釋平板涂布法從供試煙草根際土壤中分離純化出50株菌株，依據(jù)溶磷指數(shù)分別在固體有機(jī)磷篩選培養(yǎng)基和無機(jī)磷篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行初篩，共有10株菌株具有解磷功能，分別命名為2P1、2P10、2P14、2P23、2P24、3P25、3P28、3P29、3P33、3P37。

將篩選出的10株解磷菌接種到液體有機(jī)磷篩選培養(yǎng)基和無機(jī)磷篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)篩，振蕩培養(yǎng)7 d后，檢測發(fā)酵液中可溶性磷含量，結(jié)果如表1所示，菌株3P29在有機(jī)磷篩選培養(yǎng)基中磷含量為13.38 mg/L，無機(jī)磷篩選培養(yǎng)基中磷含量為19.83 mg/L，說明菌株3P29同時(shí)具有高效分解有機(jī)磷及無機(jī)磷的功能。

表1 解磷菌3P29的解磷能力Table 1 Phosphorus solubilizing ability of strain 3P29

2.2 解磷菌3P29的生理生化及分子生物學(xué)鑒定

經(jīng)平板劃線、革蘭氏染色，觀察解磷菌3P29形態(tài)特征，可見解磷菌3P29在菌落較小時(shí)為圓形，初期為無色透明，后期為淡黃色，表面光滑、濕潤、黏稠、邊緣整齊、直徑2-3 mm，為革蘭氏陰性菌，生理生化指標(biāo)檢測結(jié)果表明，3P29同時(shí)具有解鉀、固氮及產(chǎn)硫化氫、生長素的能力（圖1）。

圖1 解磷菌3P29的菌落形態(tài)、革蘭氏染色及分泌生長素的能力Fig.1 Colony morphology，Gram staining and auxin secretion ability of strain 3P29

以菌株3P29的基因組DNA為模板，分別用通用測序引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得3P29的16S rDNA和gyrB序列。通過在RDP數(shù)據(jù)庫比對(duì)16S rDNA，得到20株相似菌株，進(jìn)而在NCBI數(shù)據(jù)庫下載相似菌株對(duì)應(yīng)gyrB基因，應(yīng)用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2-圖3）。經(jīng)16S rDNA及gyrB進(jìn)化樹圖譜綜合分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，解磷菌3P29與皮特不動(dòng)桿菌LMG 1035同源性最高，結(jié)合形態(tài)及生理生化特征鑒定結(jié)果，將菌株3P29鑒定為皮特不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter pittii）。

圖2 基于解磷菌3P29和相關(guān)菌株的16S rDNA 序列采用鄰接法建立的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree established using the neighborjoining method，based on 16S rDNA sequences of strain 3P29 and related strains

圖3 基于解磷菌3P29和相關(guān)菌株的gyrB序列采用鄰接法建立的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree established using the neighborjoining method，based on gyrB sequences of strain 3P29 and related strains

2.3 解磷菌3P29對(duì)土壤礦質(zhì)營養(yǎng)元素含量及土壤酶活的影響

菌株3P29具有解磷、解鉀和固氮作用，因此檢測了3P29對(duì)土壤氮、磷和鉀含量的影響，結(jié)果（圖4）顯示，3P29對(duì)土壤總氮、總磷和總鉀含量無顯著性影響，但增加土壤堿解氮、速效磷和速效鉀含量。隨接種時(shí)間延長，堿解氮、速效磷和速效鉀含量呈升高趨勢(shì)，于接種30 d時(shí)達(dá)最高水平。與初始未接種時(shí)相比堿解氮含量提高229%，速效磷含量提高了156%，速效鉀含量提高了16%。

圖4 解磷菌3P29對(duì)土壤礦質(zhì)元素含量的影響Fig. 4 Effects of strain 3P29 on mineral element contents in soil

土壤中脲酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶參與土壤有機(jī)含碳、氮和磷化合物降解，在土壤碳、氮和磷的循環(huán)過程中發(fā)揮重要作用。3P29對(duì)土壤脲酶和酸性磷酸酶活性具有較大影響，脲酶和酸性磷酸酶活性隨時(shí)間延長呈先升高后降低趨勢(shì)，于接種后30 d左右達(dá)最高水平。而土壤蔗糖酶活性無顯著影響（圖5）。

圖5 解磷菌3P29對(duì)土壤酶活的影響Fig.5 Effects of strain 3P29 on soil enzyme activity

2.4 解磷菌3P29對(duì)煙草的促生試驗(yàn)

對(duì)菌株3P29進(jìn)行煙草促生試驗(yàn)，結(jié)果（圖6、表2）表明，接種3P29顯著促進(jìn)煙草的生長，在無磷霍格蘭營養(yǎng)液培養(yǎng)下煙草株高、葉面積和莖粗分別提高了12.4%、21.7%和36.1%；在花無缺全營養(yǎng)液培養(yǎng)下分別提高了40.1%、42.7%和29.1%。

表2 解磷菌3P29對(duì)煙草生長指標(biāo)的影響Table 2 Effects of strain 3P29 on the growth index of tobacco

圖6 解磷菌3P29對(duì)煙草生長的影響Fig. 6 Effects of strain 3P29 on tobacco growth

由表3可知，與對(duì)照組相比，接種3P29后煙草地上部分和地下部分的生物量亦顯著提高，煙草生長明顯優(yōu)于對(duì)照組。

表3 解磷菌3P29對(duì)煙草地上部分和地下部分生物量的影響Table 3 Effects of strain 3P29 on the biomass of aerial and underground parts of tobacco

進(jìn)一步檢測接種3P29對(duì)煙草葉片氮、磷和鉀元素含量的影響，結(jié)果如圖7所示，接種3P29后促進(jìn)煙草葉片氮、磷和鉀的積累，在無磷霍格蘭營養(yǎng)液和在花無缺營養(yǎng)液條件下，鉀元素含量分別提高了45%和10%，磷元素含量分別提高了134%和28%，氮元素含量分別提高了71%和49%。

圖7 解磷菌3P29對(duì)煙草葉片氮、磷和鉀元素含量的影響Fig. 7 Effects of strain 3P29 on contents of nitrogen，phosphorus and potassium in tobacco leaves

3 討論

土壤中的磷包括有機(jī)磷和無機(jī)磷，有機(jī)磷主要來源于動(dòng)植物殘?bào)w、堆肥和微生物組織等，無機(jī)磷大 部 分 以Ca3(PO4)2、CaHPO4、FePO4和AlPO4等難溶性磷酸鹽的形式存在，不能被植物直接吸收利用，土壤中無效磷含量占95%以上［9］。解磷菌能夠?qū)⑼寥乐胁蝗苄粤邹D(zhuǎn)化為可溶性磷，對(duì)于土壤磷的循環(huán)和改善土壤結(jié)構(gòu)具重要作用。目前已有多種對(duì)Ca3(PO4)2、CaHPO4、FePO4和AlPO4等不同形式無機(jī)磷具有溶解作用的微生物被分離鑒定［6-8，19-20］，也分離鑒定到一些解有機(jī)磷微生物［14］，但目前分離鑒定的解有機(jī)磷微生物種類相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)從煙草根際分離篩選到一株同時(shí)具有解有機(jī)磷和無機(jī)磷能力的菌株3P29。形態(tài)學(xué)、生理生化及分子生物學(xué)鑒定表明3P29屬于皮特不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter pittii）細(xì)菌。

目前研究發(fā)現(xiàn)不同解磷菌生理生化特性（如激素產(chǎn)生、解鉀和固氮等）存在差異，如Wu等［5］在杭州西子湖分離的固氮螺菌屬（Azospirillum）解有機(jī)磷菌OPB1同時(shí)具有固氮作用；從小麥根際分離的解磷菌Pseudomonassp. MS16和Enterobactersp.MS32具有解鋅作用及固氮酶活性［10］。本文結(jié)果表明，3P29在平板實(shí)驗(yàn)中兼具解鉀和固氮作用，是一株潛在的多功能菌，具有重要開發(fā)利用價(jià)值。土壤中的酶主要來源于土壤微生物，是反映土壤微生物活性的重要指標(biāo)，土壤中脲酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶參與土壤有機(jī)含碳、氮和磷化合物降解，在土壤碳、氮和磷的循環(huán)過程中發(fā)揮重要作用［21-22］。生物菌劑可以影響土壤酶活性，如根際促生菌和AM真菌接種可以提高脲酶和蔗糖酶等土壤酶活性［23］。含枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的生物肥料可以提高土壤脲酶和過氧化氫酶等酶活性［24］。因此本文進(jìn)一步分析了3P29對(duì)土壤營養(yǎng)元素含量，土壤酶活性以及對(duì)煙草生長的作用，結(jié)果表明3P29可以顯著提高土壤中堿解氮、速效磷和速效鉀的含量及土壤脲酶、酸性磷酸酶活性。

根際微生物生活在靠近植物根部的土壤區(qū)域，在調(diào)節(jié)植物養(yǎng)分供應(yīng)方面起著特別重要的作用［25-26］。如從玉米根中分離出的Burkholderia cenocepacia CR318通過提高玉米葉片葉綠素含量，根部鮮重等促進(jìn)玉米根系發(fā)育，增加玉米凈生物量［27］；玫瑰花天竺葵接種假單胞菌與未接種的對(duì)照相比，蒙特氏假單胞菌可增溶無機(jī)磷并使莖，根和精油的干生物量分別增加44%，48%和43%［28］。本文通過盆栽實(shí)驗(yàn)表明，接種3P29可以優(yōu)化煙草根系結(jié)構(gòu)，增加側(cè)根數(shù)量及主根長度，同時(shí)具有分泌生長素的能力，從而提高煙草對(duì)土壤營養(yǎng)物質(zhì)及水分的吸收與利用，葉片氮、磷和鉀的含量較對(duì)照組顯著升高，進(jìn)而增強(qiáng)煙草光合活性，促進(jìn)植株生長。因此，在缺磷的土壤環(huán)境中，3P29可被作為研制煙草促生生物肥料的候選菌株。但3P29能否直接參與煙草在缺磷時(shí)的根形態(tài)建成以及其可能的調(diào)節(jié)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究；同時(shí)，3P29促進(jìn)煙草體內(nèi)氮代謝過程與其固氮功能的關(guān)系也有待進(jìn)一步闡明。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)從煙草根際土壤中篩選得到一株同時(shí)解有機(jī)磷和無機(jī)磷的皮特不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter pittii）細(xì)菌3P29，其對(duì)卵磷脂的轉(zhuǎn)化量為13.38 mg/L，磷酸鈣的轉(zhuǎn)化量為19.83 mg/L。高效解磷菌3P29促進(jìn)煙草根系生長，形成更多側(cè)根，增強(qiáng)對(duì)土壤中營養(yǎng)元素的吸收和利用，生物量等生長指標(biāo)明顯優(yōu)于對(duì)照組，具有開發(fā)利用價(jià)值。