覃雪晶 王雨涵 曹一博 張凌云

（北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院 森林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

HAP（histone or heme-associated protein）是一種異源多聚體的蛋白復(fù)合物，作為一種常見的轉(zhuǎn)錄因子能夠特異性結(jié)合順式作用元件調(diào)控基因表達(dá)［1-2］。HAP類轉(zhuǎn)錄因子包含HAP2、HAP3和HAP5三個(gè)蛋白亞基，有報(bào)道稱HAP復(fù)合物會(huì)在植物和酵母中與CCAAT的啟動(dòng)子序列結(jié)合，特異性地識(shí)別靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控［3-5］。這3個(gè)亞基會(huì)在植物中產(chǎn)生大量的HAP2、HAP3、HAP5異源三聚體組合，從而為HAP復(fù)合物在高等植物中廣泛參與基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程和發(fā)揮多種作用提供了可能［6］。

現(xiàn)有研究顯示，水稻XS11的OsHAP3H突變體抽穗期較野生型發(fā)生顯著變化，說(shuō)明OsHAP3H在抑制水稻光周期開花過(guò)程中起著關(guān)鍵作用［7］。部分HAP基因參與調(diào)控水稻抽穗期，這部分基因的過(guò)表達(dá)株系相較于WT都出現(xiàn)了花期延遲的現(xiàn)象［8-9］。此外，部分HAP基因也參與了水稻種子及胚乳發(fā)育的過(guò)程［10］。過(guò)表達(dá)水稻血紅素激活蛋白基因（OsHAP2E）可以顯著提高水稻對(duì)鹽、干旱及病原菌的抗性，并提升光合速率和增加分蘗數(shù)［11］。過(guò)表達(dá)細(xì)菌植酸酶PaPhyC（HAP型）的擬南芥植株蓮座葉面積和直徑增大，磷含量增加，地上部干重增加，表明植物能夠利用植酸作為磷源進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)育［12］。也可通過(guò)AtHAP5A與AtXTH21的CCAAT結(jié)合來(lái)參與響應(yīng)擬南芥的抗凍機(jī)制［5，13］，AtHAP5A可能在缺鐵擬南芥中調(diào)控鐵轉(zhuǎn)運(yùn)［14］。由此可見，HAP家族廣泛參與了水稻和擬南芥花期調(diào)控、種子發(fā)育、光合作用等生長(zhǎng)發(fā)育和干旱、鹽堿、凍害等非生物脅迫響應(yīng)的過(guò)程。目前HAP轉(zhuǎn)錄因子的研究大多集中在HAP2和 HAP3，關(guān)于HAP5功能的研究報(bào)道很少，HAP5作為HAP轉(zhuǎn)錄因子的重要成員之一，與其他亞基有密切的聯(lián)系。由前人的研究推測(cè)，HAP5可能廣泛參與多種植物花期調(diào)控及響應(yīng)逆境脅迫反應(yīng)等過(guò)程，需要深入研究其功能和參與調(diào)控的機(jī)制，為后續(xù)植物品種改良奠定研究基礎(chǔ)。

青杄（Picea wilsonii）是松科（Pinaceae）云杉屬（Picea）的常綠高大喬木，因美觀的樹型和優(yōu)良的材質(zhì)成為我國(guó)北方多個(gè)地區(qū)常見的園林綠化、造林、用材樹種［15］。但隨著近年來(lái)全球氣候異常和環(huán)境污染加劇，干旱、鹽堿化、凍害及高溫脅迫等非生物脅迫因子嚴(yán)重影響了青杄的生存環(huán)境和生長(zhǎng)?，F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展推動(dòng)了青杄抗逆的相關(guān)研究，通過(guò)一系列生物學(xué)手段挖掘青杄抗逆基因并驗(yàn)證基因功能、揭示轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控機(jī)制等研究已有陸續(xù)報(bào)道。前人通過(guò)測(cè)序、結(jié)構(gòu)分析、同源性及進(jìn)化分析等方法發(fā)現(xiàn)青杄轉(zhuǎn)錄因子PwHAP5和擬南芥存在相近的親緣關(guān)系［16］。本課題組前期從青杄中分離出HAP5亞基，驗(yàn)證了PwHAP5參與調(diào)控青杄花粉管的生長(zhǎng)方向［17］，經(jīng)模式植物擬南芥驗(yàn)證了HAP5亞基在鹽堿、干旱等非生物脅迫的過(guò)程中起到重要作用［4］。也通過(guò)制備目的蛋白的多克隆抗體分析青杄的蛋白定位和蛋白互作情況，這為研究PwHAP5基因參與調(diào)控青杄抗逆機(jī)制提供了方法參考［18］。

本研究通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-48b-PwHAP5并轉(zhuǎn)入大腸桿菌，經(jīng)誘導(dǎo)生成蛋白產(chǎn)物并純化獲得重組蛋白PwHAP5，將蛋白注射入新西蘭兔體內(nèi)獲取抗PwHAP5兔血清，經(jīng)純化制備出高效價(jià)、特異性強(qiáng)的PwHAP5兔多克隆抗體，用于檢測(cè)PwHAP5蛋白在青杄花粉中的表達(dá)情況，以便后續(xù)開展PwHAP5基因的功能研究。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)青杄花粉樣品采自中科院植物所北京植物園，樣品室溫晾干后存儲(chǔ)于-80℃超低溫冰箱備用。pET-48b載體由清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張大鵬實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，健康成年的新西蘭大白兔2只。

主要試劑：AP標(biāo)記的羊抗兔抗體IgG、聚偏二氟乙烯膜（PVDF轉(zhuǎn)印膜）、His標(biāo)簽抗體購(gòu)于北京亞太恒信生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌感受態(tài)BL21、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、RNA提取試劑盒、DNA marker、DNA純化回收試劑盒購(gòu)于北京天根生化科技有限公司；其他常用化學(xué)試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)的分析純。

1.2 方法

1.2.1 青杄PwHAP5基因序列克隆 從數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank獲取PwHAP5基因序列，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物P1，P2，得到序列如表1所示。通過(guò)試劑盒提取青杄花粉RNA，再反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

表1 引物信息Table 1 Quote sequence information

以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增PwHAP5基因CDS全長(zhǎng)序列。反應(yīng)體系如下：模板1 μL，2×Tap酶10 μL，上下游引物P1、P2各0.5 μL，ddH2O加8 μL。通過(guò)切膠回收目的片段。

1.2.2 pET-48b-PwHAP5原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定通過(guò)BamH I和Hind Ⅲ將上述擴(kuò)增的PwHAP5基因片段與表達(dá)載體pET-48b雙酶切處理后再連接，導(dǎo)入大腸桿菌BL21，在LB培養(yǎng)基（含有50 μg /mL卡那霉素）活化與擴(kuò)增，篩選出陽(yáng)性菌落分別用于PCR檢測(cè)和擴(kuò)增培養(yǎng)進(jìn)行質(zhì)粒抽提。待擴(kuò)增的陽(yáng)性菌落需挑入上述LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。經(jīng)BamH I和HindⅢ對(duì)重組質(zhì)粒pET-48b-PwHAP5進(jìn)行雙酶切鑒定后測(cè)序。

1.2.3 重組蛋白PwHAP5的誘導(dǎo)表達(dá) 將測(cè)序正確的陽(yáng)性菌落接種入LB液體培養(yǎng)基（含有50 μg /mL卡那霉素），在37℃條件下培養(yǎng)至菌液OD600值為0.5-1.0，加入IPTG（終濃度為0.25 mmol/L）誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)設(shè)置有4、6、8、10 h共4個(gè)處理，之后取相同體積菌液離心收集沉淀，再加入適量PBS重懸菌體，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)PwHAP5融合蛋白表達(dá)情況。參考上述步驟，對(duì)離心溫度和轉(zhuǎn)速設(shè)置不同組合試驗(yàn)篩選最佳的轉(zhuǎn)速和溫度。

1.2.4 重組蛋白PwHAP5表達(dá)形式鑒定 當(dāng)大腸桿菌菌液OD600值為0.5-1.0時(shí)，添加IPTG稀釋菌液終濃度至5×10-4mol/L，在37℃條件下，培養(yǎng)8 h后離心收集菌落沉淀。此時(shí)加入NBB緩沖液（0.5 mol/L NaCl，50 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L 咪 唑，pH值為8.0）、蛋白酶抑制劑和溶菌酶混合重懸菌落沉淀。在冰上將菌體超聲破碎，加入180 μL TritonX-100，繼續(xù)在冰上振蕩處理15 min，4℃離心收集澄清上清液和沉淀。

用NAA緩沖液重懸沉淀，按上述步驟離心保留沉淀備用。之后加入裂解液重懸，冰浴裂解包涵體1 h后，離心取上清液經(jīng)由SDS-PAGE鑒定重組蛋白PwHAP5表達(dá)形式。

1.2.5 重組蛋白PwHAP5純化 上述上清液經(jīng)0.45 μm濾膜濾除雜質(zhì)后，在含有瓊脂糖親和層的His-NTA純化柱中與樹脂混合，置于冰上振蕩處理3 h。經(jīng)Wash Buffer洗滌3次去除雜質(zhì)，再用Elution Buffer洗脫3次，各組分需分開收集保存。取各離心管中蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化效果。

1.2.6 重組蛋白PwHAP5兔多克隆抗體制備與鑒定

在抗體制備前需進(jìn)行本底反應(yīng)，排除試驗(yàn)動(dòng)物血清背景對(duì)結(jié)果的干擾。從未進(jìn)行免疫反應(yīng)的兔子耳緣靜脈抽取0.5 mL血液，提取的兔抗血清和AP標(biāo)記山羊抗兔IgG（免疫球蛋白G）分別為一抗、二抗，重組蛋白PwHAP5作為抗原，用Western blot檢測(cè)結(jié)果，選出符合試驗(yàn)要求的健康兔子。

通過(guò)對(duì)兔子皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行免疫反應(yīng)。第一次注射的蛋白劑量為600 μg/只，蛋白液按1∶1比例與弗氏完全佐劑混合乳化；初次免疫后次日進(jìn)行第二次注射，蛋白劑量為400 μg/只，蛋白液按1∶1比例與弗氏不完全佐劑混合乳化；之后分別在第35天和49天進(jìn)行第3、4次免疫反應(yīng)，免疫劑量和操作參考第2次免疫反應(yīng)。

4次免疫試驗(yàn)結(jié)束后，在第10 天按上述相同步驟采血，間接ELISA法檢測(cè)免疫試驗(yàn)后兔抗血清效價(jià)。重組蛋白PwHAP5稀釋為2 μg/mL 的濃度，按照100 μL /孔的劑量加入酶標(biāo)板中，置于4℃冰箱過(guò)夜處理，次日用PBST清洗3次，每次處理5 s。接著按每孔300 μL的劑量添加5%脫脂奶粉。之后在37℃條件下封閉2 h，以每孔100 μL的劑量往酶標(biāo)板中加入按照1∶1 000、1∶3 000、1∶9 000、1∶27 000、1∶81 000、1∶243 000，1∶729 000倍數(shù)稀釋的血清，37℃下孵育2 h后使用PBST清洗（參考上述步驟）。按100 μL/孔加帶HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（需按1∶10 000比例稀釋），37℃條件下溫育50 min后使用PBST清洗。在避光條件下，按100 μL /孔加TMB顯色處理，5 min后每孔添加50 μL終止液（2 mol/L的H2SO4）停止反應(yīng)。經(jīng)ddH2O清洗后，使用酶標(biāo)儀讀取各孔中蛋白樣品OD450值。檢測(cè)效價(jià)達(dá)到試驗(yàn)要求后，次日穿刺心臟采集兔全血后提取抗血清。

1.2.7 抗體純化 通過(guò)Protein A純化抗體。兔抗血清經(jīng)離心分離后取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后，按1∶1比例加入Binding Buffer緩沖液混合均勻上柱純化，收集抗體穿流液重復(fù)上柱，再收集經(jīng)由Eluting Buffer洗脫的樣品，樣品需通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白PwHAP5兔多克隆抗體純度。純化后抗體需在PBS中保存，分別通過(guò)全自動(dòng)蛋白定量檢測(cè)儀、SDS-PAGE檢測(cè)純化后總IgG（免疫球蛋白G）的濃度和純度。

1.2.8 Western blot檢測(cè)評(píng)價(jià)抗體 制備的抗體經(jīng)SDS-PAGE電泳處理后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜轉(zhuǎn)膜處理80 min，電壓和電流分別為100 V和400 A。在室溫下用含5% BSA的TBST溶液（封閉液）處理蛋白膜，封閉處理2 h。用封閉液按1∶3 000比例稀釋抗體后作為一抗保存于4℃冰箱過(guò)夜孵育，用TBST溶液洗膜。用封閉液按照1∶5 000的比例稀釋含有AP標(biāo)記的山羊抗兔IgG后作為二抗保存于室溫孵育2 h，用TBST溶液洗膜。在室溫進(jìn)行NBT/BCIP顯色反應(yīng)檢測(cè)PwHAP5兔多克隆抗體特異性。

1.2.9 花粉萌發(fā)實(shí)驗(yàn) 花粉培養(yǎng)時(shí)間設(shè)置有12、16、20、24 h，通過(guò)顯微鏡觀察不同處理下花粉萌發(fā)情況、花粉管長(zhǎng)度并記錄。

1.2.10 PwHAP5兔多克隆抗體間接免疫熒光檢測(cè) Poly-Lysine包被載玻片制片前需清洗干凈。將載玻片均勻涂上0.1%多聚-L-賴氨酸，此步驟不能有褶皺，室溫晾干備用。載玻片和4%多聚甲醛都需要即做即用。

花粉經(jīng)離心洗滌后用PBS溶液重懸（此步驟重復(fù)2次）。室溫條件下，花粉重懸液細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105個(gè)/mL，滴于載玻片預(yù)留位置，靜置10 min后加入4%多聚甲醛，孵育2 h后去除并用PBS溶液清洗2次。使用PBS溶液（含0.2% Triton X-100）處理載玻片5 min，PBS溶液清洗5次。將載玻片放入PBS溶解的3%脫脂奶粉中，封閉1 h。

采用濕孵的方法，將PwHAP5兔多克隆抗體用PBS溶液（含1%脫脂奶粉）按1∶40比例進(jìn)行稀釋后，作為一抗孵育2 h。添加有FITC標(biāo)記的1%脫脂奶粉用PBS溶液按1∶100比例稀釋，孵育1 h。以上孵育步驟結(jié)束后需用PBS溶液清洗5次。通過(guò)共聚焦激光掃描顯微鏡觀察一抗、二抗的結(jié)合情況。

2 結(jié)果

2.1 PwHAP5基因全長(zhǎng)擴(kuò)增及原核表達(dá)載體鑒定

如圖1-A所示，以青杄花粉總RNA反轉(zhuǎn)錄的青杄cDNA為模板，PCR擴(kuò)增PwHAP5全長(zhǎng)，得到長(zhǎng)約603 bp的條帶，與理論分子量相符。

圖1 PwHAP5基因片段的PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒鑒定Fig. 1 PCR products of PwHAP5 and identification of the recombinant plasmid

重組質(zhì)粒pET-48b-PwHAP5經(jīng)BamH I和HindⅢ雙酶切后，產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到兩條條帶，大條帶位置與pET-48b空載質(zhì)粒吻合，小條帶與PwHAP5大小相符。結(jié)果表明，原核表達(dá)載體pET-48b-PwHAP5構(gòu)建成功。

2.2 目的蛋白表達(dá)形式與表達(dá)量鑒定

設(shè)置了不加IPTG誘導(dǎo)的對(duì)照組。超聲波粉碎經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌，分離上清液與沉淀物，分別進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。如圖2-A可知，對(duì)照組中融合蛋白的表達(dá)并不明顯，而經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白明顯多于其他分子量的蛋白，說(shuō)明有大量重組蛋白表達(dá)。且在沉淀物中的蛋白表達(dá)量顯著多于上清液的表達(dá)量，說(shuō)明重組蛋白PwHAP5主要以包涵體形式表達(dá)。

經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組大腸桿菌，經(jīng)離心溫度和轉(zhuǎn)速組合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)37℃、260 r/min的處理下重組蛋白表達(dá)量最高，以此作為最優(yōu)條件培養(yǎng)，再對(duì)比不同時(shí)長(zhǎng)處理下IPTG對(duì)蛋白表達(dá)量的誘導(dǎo)情況。如圖2-B所示，蛋白產(chǎn)物經(jīng)IPTG誘導(dǎo)明顯增加，在4、6、8 h三種不同培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)處理下均在45 kD有條帶出現(xiàn)，且隨著時(shí)長(zhǎng)增加，產(chǎn)物表達(dá)量也在增加，在8 h處理時(shí)，蛋白產(chǎn)物表達(dá)量較高，說(shuō)明在此條件下重組蛋白PwHAP5高效表達(dá)。

圖2 目的蛋白PwHAP5表達(dá)形式和表達(dá)量鑒定Fig.2 Identification of expression form and expression amount of target protein PwHAP5

2.3 PwHAP5蛋白純化

通過(guò)His-NTA鎳柱純化帶有His標(biāo)簽的PwHAP5蛋白。由SDS-PAGE鑒定收集的多組份洗脫液成分。如圖3-A所示，第3次洗脫處理后雜蛋白含量最低，重組蛋白條帶清晰，濃度不低于1 mg/mL，由此可知第3次洗脫純化效果最好。

2.4 未免疫兔血清本底反應(yīng)

如圖3-B所示，對(duì)多只未進(jìn)行免疫反應(yīng)的健康成年兔子血清進(jìn)行Western blot檢測(cè)。以兔血清為一抗，AP標(biāo)記山羊抗兔IgG為二抗篩選出在45 kD位置無(wú)明顯條帶的兩只兔子的血清，選定這兩只兔子進(jìn)行免疫試驗(yàn)。

圖3 純化蛋白SDS-PAGE分析及未免疫兔血清的本底反應(yīng)Fig.3 SDS-PAGE analysis of purified recombinant protein and Western blotting assay

2.5 抗體效價(jià)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)組為PwHAP5多克隆抗體，對(duì)照組為未免疫兔血清。如圖4所示，以P/N＞2.1為參考標(biāo)準(zhǔn)［19］，當(dāng)血清按1∶729 000比例稀釋時(shí)，實(shí)驗(yàn)組A450值為0.577，對(duì)照組A450為0.042，P/N＞2.1，檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性。結(jié)果證明本試驗(yàn)制備的兔抗血清效價(jià)在1∶729 000以上，說(shuō)明PwHAP5多克隆抗體具備較高的靈敏度。

圖4 間接ELISA法檢測(cè)效價(jià)Fig.4 Detected titer of antibody detected by indirect ELISA

2.6 純化后抗體的檢測(cè)

兔抗血清經(jīng)純化后的體積為27 mL，測(cè)得總IgG量為50.49 mg，由此可知抗體濃度為1.87 mg/mL。如圖5所示，由SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果可知純化后的抗體在45 kD位置出現(xiàn)單一清晰的條帶，與目的蛋白分子量相符，說(shuō)明抗體純度高。

圖5 純化后抗體純度檢測(cè)Fig.5 Purity detection of purified antibody

2.7 抗體特異性檢測(cè)

以不含目的蛋白的凝膠作為抗原，制備的兔抗血清作為對(duì)照組。如圖6所示，以抗PwHAP5蛋白兔多克隆抗體為一抗，與AP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體雜交，在膜上45 kD位置出現(xiàn)條帶，與重組蛋白PwHAP5大小相符。未經(jīng)誘導(dǎo)的大腸桿菌菌體未出現(xiàn)條帶，說(shuō)明制備的PwHAP5多克隆抗體能夠特異性識(shí)別PwHAP5蛋白。

圖6 抗體特異性檢測(cè)結(jié)果Fig. 6 Specificity of rabbit polyclonal antibody of PwHAP5

2.8 青杄花粉萌發(fā)試驗(yàn)

如圖7-A所示，青杄花粉在培養(yǎng)至16 h時(shí)開始萌發(fā)，26 h的培養(yǎng)液污染情況嚴(yán)重。由此可知，18-26 h的培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)適宜花粉管萌發(fā)，選用該處理下的花粉管作為間接免疫熒光試驗(yàn)材料。

2.9 抗體間接免疫熒光檢測(cè)

預(yù)處理萌發(fā)的青杄花粉，在相同的處理?xiàng)l件下，設(shè)置不同的對(duì)照，PwHAP5兔多克隆抗體為一抗，帶有FITC標(biāo)記的1%脫脂奶粉（PBS溶解）作為二抗。如圖7-B所示，a和d為未經(jīng)一抗二抗處理的花粉管，花粉有微弱自發(fā)熒光，但不明顯。b和e中以一抗處理花粉管，不加二抗，出現(xiàn)微弱的熒光信號(hào)，也不明顯。c和f中同時(shí)添加了一抗二抗，可觀察到圖中熒光信號(hào)強(qiáng)烈，說(shuō)明制備的抗體具有活性，可以結(jié)合FITC標(biāo)記的二抗。

圖7 花粉管萌發(fā)試驗(yàn)和間接免疫熒光檢測(cè)Fig.7 Pollen tube germination test and indirect immunofluorescence assay

3 討論

本研究克隆得到PwHAP5基因序列，并成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-48b-PwHAP5，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)重組蛋白PwHAP5表達(dá)。在誘導(dǎo)重組蛋白生成的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)離心溫度、轉(zhuǎn)速、IPTG誘導(dǎo)時(shí)間等因素對(duì)蛋白表達(dá)量有影響，超聲波處理時(shí)長(zhǎng)、次數(shù)、IPTG濃度等步驟無(wú)顯著影響。此外，大腸桿菌菌株活性會(huì)逐漸下降，為保證重組蛋白高效表達(dá)，大腸桿菌不宜存放太久。

青杄PwHAP5重組蛋白以包涵體的形式穩(wěn)定高效地表達(dá)。由于包涵體的不溶性，需用緩沖液清洗去除雜質(zhì)，經(jīng)裂解液處理包涵體，離心收集到的上清液再純化，可以有效提高目的蛋白的純度。試驗(yàn)過(guò)程中為提高目的蛋白濃度，可適量減少Elution Buffer的用量。

本試驗(yàn)經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)純化后的蛋白液，再通過(guò)切膠收集富含重組蛋白條帶的方法，操作簡(jiǎn)單，回收效率高。且PAGE膠可起到緩慢釋放抗原的作用，也可作為惰性載體，可確保蛋白純度且免于在兔體內(nèi)被降解或被免疫細(xì)胞吞噬［20］。制備的多克隆抗體經(jīng)間接ELISA檢測(cè)可知效價(jià)在1∶729 000以上，確認(rèn)PwHAP5多克隆抗體具備良好的靈敏度。經(jīng)Protein A柱子純化的抗體通過(guò)Western blot檢測(cè)可知能特異性識(shí)別抗原。

以青杄萌發(fā)的花粉為材料，進(jìn)行間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PwHAP5蛋白在花粉管中的定位。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的熒光信號(hào)強(qiáng)度發(fā)生明顯變化，說(shuō)明PwHAP5在青杄花粉中有表達(dá)，但不能確定具體位置，這可能是因?yàn)榛ǚ郾诒砻嫖綗晒馊玖显斐筛蓴_，這需要后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

目前HAP家族已經(jīng)在多種植物中發(fā)現(xiàn)，以HAP2和HAP3亞基功能研究報(bào)道最多，其廣泛參與到植物的生長(zhǎng)發(fā)育、花期調(diào)控、非生物脅迫等多個(gè)過(guò)程［21-24］。為我們了解HAP家族在多種植物中的功能和作用提供了重要的信息和參考依據(jù)，如在青杄中HAP家族可能會(huì)參與花期調(diào)控、非生物脅迫等，指明今后PwHAP5基因的研究方向。但關(guān)于HAP5的研究較少，尤其缺乏HAP5亞基功能研究，其分子生物學(xué)機(jī)制尚未形成體系，還有很多亟須解決的問(wèn)題。如青杄PwHAP5是否與擬南芥、水稻等植物的HAP家族具有相同的作用方式、功能之間的差異、在細(xì)胞中發(fā)揮的作用及作用的靶基因等方面都需要更深入的研究。免疫膠體金法是研究蛋白定位和功能的常見方法，制備和目的蛋白特異性結(jié)合的抗原是使用本方法的關(guān)鍵［25］。染色質(zhì)免疫共沉淀方法也需要通過(guò)特異性結(jié)合的蛋白檢測(cè)生物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的下游靶基因［26］。本試驗(yàn)制備的PwHAP5多克隆抗體與目的蛋白雜交時(shí)有清晰的單一條帶，證明抗體特異性強(qiáng)，可應(yīng)用于染色質(zhì)免疫共沉淀等技術(shù)。這對(duì)進(jìn)行PwHAP5轉(zhuǎn)錄因子亞細(xì)胞定位和尋找下游作用靶基因，開展PwHAP5轉(zhuǎn)錄因子參與青杄生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)等過(guò)程研究奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)克隆青杄目的基因PwHAP5與載體pET-48b相連構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-48b-PwHAP5，轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生目的蛋白PwHAP5。經(jīng)Ni-His柱和樹脂純化后的重組蛋白作為抗原注射入兔子體內(nèi)，制備抗重組蛋白PwHAP5兔血清，再通過(guò)Protein A純化獲得青杄PwHAP5多克隆抗體。制備的血清抗體效價(jià)可達(dá)1∶729 000，所制抗體純度高、特異性良好。青杄PwHAP5多克隆抗體和二抗共同處理的花粉管熒光信號(hào)強(qiáng)烈，說(shuō)明制備的抗體可以結(jié)合二抗，驗(yàn)證了PwHAP5在青杄花粉中有表達(dá)。