索青青 吳楠 楊慧 李莉 王錫鋒

（中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所 植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

木質(zhì)素是植物生長發(fā)育過程中重要的次生代謝產(chǎn)物，也是合成其它疏水聚合物（如角質(zhì)、木栓素和孢粉素）以及一系列可溶性特殊代謝物（包括類黃酮、羥基肉桂酸酯、木脂素、單寧和二苯乙烯）所必需的［1］。木質(zhì)素具有極其重要的生物學功能。首先，它是植物細胞壁的重要組分［2］，幾乎所有的陸地植物和一些藻類都能合成木質(zhì)素；其次，它在保護植物抵御機械損傷、外來病原物入侵、脅迫響應（如紫外線輻射），水分和養(yǎng)分運輸?shù)确矫姘l(fā)揮著重要作用［3］。木質(zhì)素的生物合成主要是通過苯丙氨酸/酪氨酸代謝途徑［4］，首先苯丙氨酸或酪氨酸脫氨形成肉桂酸，經(jīng)過羥基化、甲基化和還原等一系列步驟后，形成3種主要單體（對香豆醇、松柏醇和芥子醇）［5］，最終由3種單體脫氫聚合形成一種復雜的酚類聚合物［6］。

咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（caffeoylcoenzyme A-O-methyltransferase，CCoAOMT）是木質(zhì)素合成過程中的關鍵酶之一，它是一類S-腺苷甲硫氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，在木質(zhì)素合成途徑中以咖啡酰輔酶A為底物，將S-腺苷甲硫氨酸上的甲基基團轉(zhuǎn)移到底物苯環(huán)上，形成阿魏酰輔酶A［7］?？Х弱］o酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶與木質(zhì)素合成過程中的其他酶相比發(fā)現(xiàn)較晚。Pakusch等［8］于1989年首次發(fā)現(xiàn)并提出可能存在一種催化咖啡酰輔酶A甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶，且該酶的活性受真菌激活誘導。后在擬南芥、水稻、棉花、煙草等多種植物中都相繼成功克隆到CCoAOMT基因［7］。有研究表明，在煙草中表達CCoAOMT基因序列的反義拷貝導致總木質(zhì)素含量減少，并伴隨著矮化表型以及葉片和花的形態(tài)改變［9］。小麥TaCCoAOMT1基因在莖和根中高表達，它對木質(zhì)素的生物合成很重要，與莖的成熟度有關［3］。在CCoAOMT基因表達被抑制的轉(zhuǎn)基因煙草與楊樹中，木質(zhì)素含量顯著降低［10-11］。由于木質(zhì)素具有支撐細胞壁的功能，也被認為與植物的抗逆或抗病性有關［12］。甜菜M14品系BvM14-CCoAOMT基因的過量表達能夠提高煙草對干旱、高鹽脅迫的抗性［13］。最新研究表明擬南芥CCoAOMT1基因可通過調(diào)節(jié) H2O2積累和脫落酸信號傳導在響應干旱脅迫中發(fā)揮積極作用［14］。該酶對于水稻生長發(fā)育以及抗逆抗病性等方面中的功能研究少見報道，目前僅有研究證明水稻中3個OsCCoAOMT基因（OsCCoAOMT1、OsCCoAOMT20、OsCCoAOMT26）可能與植物中木質(zhì)化進程有關［15］。

為進一步了解OsCCoAOMT1基因在水稻生長發(fā)育、營養(yǎng)利用和抗病中的重要作用，急需制備該基因所編碼蛋白的抗體。本研究通過PCR擴增技術克隆得到OsCCoAOMT1基因，并將其構(gòu)建在原核表達載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，表達重組蛋白，蛋白經(jīng)純化后，注射新西蘭公兔，成功獲得了多克隆抗體。對該抗體進行純化后檢測其特異性與有效性，并通過免疫熒光手段將抗體標記水稻原生質(zhì)體觀察該蛋白在水稻細胞中的定位情況，為后續(xù)對水稻咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的功能研究奠定良好基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試水稻品種為鎮(zhèn)稻99，由本實驗室長期保存，置于光期14 h，溫度為30℃；暗期10 h，溫度為28℃的光照培養(yǎng)箱中生長。

1.1.2 菌株和載體 原核表達載體pET30a（+）購自Invitrogen公司（美國），原核表達菌株大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）購自全式金公司。

1.1.3 實驗試劑 RNA isolater Total RNA Extraction Reagent，2 × Phanta Max Master Mix（Dye Plus），2× Universal Ligation Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；限制性內(nèi)切酶NdeI和Hind III購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司（GenStar）；IPTG、NC膜購自Sigma公司（美國）；DNA回收試劑盒購自艾德科技（北京）有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自Axygen公司（美國）；Dylight 568購自美國KPL公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計及目的基因的克隆 根據(jù)OsCCoAOMT1基因編碼區(qū)序列設計帶酶切位點NdeI和Hind III的引物OsCCoAOMT1-F1：5'-CATATGATGGCCGAGGCGGCGTCG-3'（引入酶切位點NdeI）；OsCCoAOMT1-R1：5'-AAGCTTTCACTTGACGCGGCGGCAGAG-3'（引入酶切位點Hind III）。

利用Trizol法提取水稻總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板，利用帶有酶切位點的上下游引物進行PCR擴增得到同樣帶有酶切位點的目的基因片段。

1.2.2 原核表達載體的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶NdeI和Hind III雙酶切純化后的目的基因片段和pET30a（+）載體，將酶切后的目的基因片段和pET30a（+）載體用2 × Universal Ligation Mix連接，得到原核表達載體pET30a（+）-OsCCoAOMT1。

1.2.3 重組蛋白誘導表達 將重組質(zhì)粒pET30a（+）-OsCCoAOMT1轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中。挑選3個生長良好的陽性克隆，分別接種到含有50 μg/mL卡那霉素的4 mL 液體LB培養(yǎng)基中。置于37℃的搖床中，以200 r/min的轉(zhuǎn)速搖動。當OD600值達到0.6-0.8時，在其中兩個離心管中加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，分別在15℃下誘導16 h和37℃下誘導4 h，最后一個離心管作為陰性對照不加入IPTG。后將菌液離心，收集沉淀，加入300 μL裂解緩沖液（50 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，5%甘油pH = 8.0）在超聲破碎儀中超聲破碎1 min。將50 μL 5×Loading buffer與100 μL細胞裂解液混合，作為全細胞裂解液樣品。100℃沸水中加熱樣品10 min，并在15 000 r/min下離心5 min。將剩余的200 μL細胞裂解液在15 000 r/min下離心10 min，收集細胞裂解液上清液和沉淀，分別將90 μL 5×Loading buffer與180 μL上清液混合，作為細胞裂解液上清液樣品。用150 μL 5×Loading buffer重懸沉淀，作為細胞裂解液沉淀樣品。將樣品在100℃沸水中加熱10 min，15 000 r/min下 離 心5 min，利 用SDSPAGE電泳對所得上清和沉淀樣品進行檢測。

1.2.4 抗體制備和Western blot檢測 為了進一步得到OsCCoAOMT1可溶性蛋白，將其按照最優(yōu)條件誘導，菌體經(jīng)超聲破碎后離心，收集上清，Ni2+-NTA抗原親和柱純化蛋白，純化后的蛋白注射于新西蘭公兔，經(jīng)3次加強免疫后收集相應的抗血清。提取水稻莖和葉總蛋白，通過Western blot對抗體進行特異性檢測。

1.2.5 免疫熒光法標記原生質(zhì)體 原生質(zhì)體來源于本實驗室前期創(chuàng)制的超表達帶有GFP熒光標記OsCCoAOMT1的轉(zhuǎn)基因水稻（轉(zhuǎn)錄倍數(shù)提高21倍）及其野生型水稻品種鎮(zhèn)稻99，利用酶解法提取水稻莖部原生質(zhì)體，向細胞培養(yǎng)皿中加入500 μL 原生質(zhì)體懸液，再用滴管小心的滴入4%多聚甲醛，室溫固定1 h；300 r/min離心5 min，用寬口槍頭小心吸除固定液，8%甘露醇洗3次，每次5 min；向培養(yǎng)皿中加入300 μL 制備的OsCCoAOMT1蛋白抗體稀釋液（抗體用3% BSA按1∶100稀釋），于室溫孵育1-2 h；300 r/min離心5 min，用寬口槍頭小心吸去抗體稀釋液，8%甘露醇洗3次，每次5 min；考慮到轉(zhuǎn)基因水稻帶有GFP熒光標記，采用Dylight 568標記的二抗，37℃孵育1-2 h；8%甘露醇洗去殘留的二抗，制片，利用激光共聚焦顯微鏡觀察該蛋白在原生質(zhì)體中的定位。

2 結(jié)果

2.1 目的基因OsCCoAOMT1的克隆

以水稻幼苗總RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，用PCR擴增方法得到目的基因OsCCoAOMT1全長782 bp，與預期結(jié)果相符（圖1）。將目的基因片段切膠回收，并用限制性內(nèi)切酶NdeI和Hind III進行雙酶切。

圖1 OsCCoAOMT1基因的PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplifying product of OsCCoAOMT1 gene

2.2 原核表達載體的構(gòu)建

將pET30a（+）載體用限制性內(nèi)切酶NdeI和Hind III進行雙酶切，與酶切后的目的片段相連接，并轉(zhuǎn)化E. coliBL21（DE3）感受態(tài)細胞中，涂布在帶有卡那霉素抗性的平板上，篩選陽性克隆后提取重組質(zhì)粒pET30a（+）-OsCCoAOMT1，將陽性質(zhì)粒測序并以NdeI和HindIII雙酶切驗證。測序結(jié)果顯示克隆片段序列與目的序列相似性為100%，酶切陽性質(zhì)?？傻玫絻蓷l帶，分別為5 422 bp和782 bp（圖2），表明該載體已成功構(gòu)建。

圖2 重組質(zhì)粒pET30a（+）-OsCCoAOMT1的酶切鑒定Fig.2 Restriction identification of recombinant plasmid pET30a（+）-OsCCoAOMT1

2.3 重組蛋白的表達與純化

挑取陽性單菌落于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，分別在15℃條件下誘導16 h和37℃條件下誘導4 h后，加入細胞裂解液得到全細胞裂解液、上清和沉淀樣品，經(jīng)SDSPAGE電泳（圖3）與Western blot（圖4）對所得樣品進行檢測，結(jié)果表明該蛋白最佳誘導條件為IPTG終濃度為0.5 mmol/L下37℃下誘導4 h，并且該蛋白在上清中有較高的含量。在該誘導條件誘導重組蛋白大量表達，菌體經(jīng)超聲破碎后離心，收集上清，Ni2+-NTA抗原親和柱純化蛋白，純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳（圖5）可知其蛋白條帶單一，并通過BCA法測定純化后的蛋白濃度達到0.83 mg/mL。

圖3 重組質(zhì)粒pET30a（+）-OsCCoAOMT1不同誘導條件下的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant plasmid pET30a（+）-OsCCoAOMT1 under the different inducing condition

圖4 重組質(zhì)粒pET30a（+）-OsCCoAOMT1不同誘導條件下的Western blot分析Fig.4 Western blot analysis of recombinant plasmid pET30a（+）-OsCCoAOMT1 under the different inducing condition

圖5 OsCCoAOMT1蛋白的純化Fig.5 Purification of OsCCoAOMT1 protein

2.4 OsCCoAOMT1抗體制備和Western blot

將純化后的OsCCoAOMT1蛋白注射于新西蘭公兔，經(jīng)3次加強免疫后收集相應的抗血清。為了檢測 OsCCoAOMT1抗體的特異性，分別提取水稻莖、葉總蛋白，以同樣的OsCCoAOMT1抗體濃度（1∶1 000）進行Western blot，結(jié)果表明，不同組織的水稻總蛋白均顯示目的大小的條帶（圖6），且由條帶強弱可知該蛋白在水稻不同部位的表達量不同，莖中的表達量要高于葉。同時將水稻幼苗總蛋白（3.8 mg/mL）分別稀釋2倍、4倍、8倍、16倍，在相同抗體濃度（1∶1 000）下孵育，均可得到單一目的條帶，并且條帶逐漸變?nèi)酰▓D7）。以上結(jié)果表明該抗體可以廣泛應用于水稻的不同組織和部位，并且具有較高的靈敏度和良好的特異性。

圖6 水稻莖、葉中OsCCoAOMT1的Western blot 檢測Fig.6 Western blot analysis of OsCCoAOMT1 in rice stem and leaf

圖7 水稻不同蛋白濃度Western blot檢測Fig.7 Western blot analysis of different protein concentrations in rice

2.5 原生質(zhì)體標記

參考本實驗室已有的方法［16］，對野生型和轉(zhuǎn)基因水稻莖原生質(zhì)體進行免疫熒光標記，野生型和轉(zhuǎn)基因水稻在激光共聚焦顯微鏡下均可檢測到抗體信號（圖8），且轉(zhuǎn)基因水稻的GFP信號可以與抗體的信號共定位。同時對水稻莖的細胞質(zhì)與細胞核蛋白進行分離，而后分別對細胞質(zhì)蛋白和細胞核蛋白進行Western blot，結(jié)果（圖9）表明，同等樣品下胞質(zhì)中OsCCoAOMT1蛋白含量遠高于其在細胞核中的含量，說明OsCCoAOMT1蛋白主要存在于細胞質(zhì)中。因此可以充分說明該抗體特異性良好，且可特異性的用于免疫熒光分析。

圖8 OsCCoAOMT1蛋白在野生型（A）和轉(zhuǎn)基因（B）水稻莖原生質(zhì)體中的定位分析Fig.8 Location analysis of OsCCoAOMT1 protein in the wild-type（A）and transgenic（B）rice stem protoplasts

圖9 OsCCoAOMT1蛋白在水稻細胞質(zhì)和細胞核中的表達量分析Fig. 9 Expression level analysis the OsCCoAOMT1 protein in rice cytoplasm and nucleus

3 討論

利用原核表達重組蛋白免疫動物來制備抗體是研究蛋白質(zhì)功能的重要手段之一［17］。通過原核表達獲得大量的抗原蛋白，可用于蛋白性質(zhì)、功能、蛋白間相互作用及多種生化功能的研究［18］。本文首先構(gòu)建原核表達載體pET30a（+）-OsCCoAOMT1，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中。誘導條件是原核表達系統(tǒng)表達外源蛋白的重要因素［19］，因此我們選擇了在IPTG終濃度為0.5 mmol/L時，在不同的溫度，不同時間下誘導，優(yōu)化獲得了該蛋白高效表達的最佳誘導條件：37℃條件下誘導4 h。當制備多克隆抗體時，作為抗原的蛋白質(zhì)純度越高，獲得的抗體特異性越好［20］。由于OsCCoAOMT1蛋白在上清中的表達量更高，因此我們選擇Ni2+-NTA親和柱純化，獲得高純度的蛋白后將其免疫新西蘭公兔，成功制備了多克隆抗體。

關于OsCCoAOMT1蛋白的具體功能及其在水稻生長發(fā)育以及抗病防御機制中的研究較少。最近有研究表明，編碼玉米咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因ZmCCoAOMT2對多種病原菌具有數(shù)量抗性，且在擬南芥Col-0中，CCoAOMT1基因也在病原體或激發(fā)子處理后被誘導，推測其可能在抗性功能中起重要作用［21］。OsCCoAOMT1基因作為水稻木質(zhì)素合成過程中的重要酶，僅有研究表明其可能參與調(diào)控水稻的木質(zhì)化進程［15］。本研究用制備的抗體對水稻不同組織和部位進行Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)OsCCoAOMT1蛋白在水稻莖部和葉部均有表達，且莖中表達量高于葉中表達量，由此推測其可能在水稻莖的伸長及營養(yǎng)運輸?shù)确矫姘l(fā)揮重要作用。通過免疫熒光法對轉(zhuǎn)基因和野生型水稻莖原生質(zhì)體進行標記，激光共聚焦顯微鏡可觀察到轉(zhuǎn)基因水稻的GFP信號可以與抗體的信號共定位，說明該抗體特異性好，可后續(xù)用于免疫熒光分析，同時將水稻莖核質(zhì)蛋白分離，經(jīng)Western blot檢測可知該蛋白主要定位在細胞質(zhì)中，推測其可能參與細胞質(zhì)相關代謝過程。但也有相關研究表明甜菜M14品系BvM14-CCoAOMT蛋白可定位于細胞核、質(zhì)膜上［22］，因此關于該蛋白的定位情況還有待深入研究。

4 結(jié)論

本研究利用重組DNA技術成功構(gòu)建了pET30a（+）-OsCCoAOMT1原核表達載體，確定了該蛋白的最佳誘導條件為IPTG終濃度0.5 mmol/L，37℃下誘導4 h，在該條件下大量表達和純化該蛋白，成功制備了OsCCoAOMT1蛋白的多克隆抗體。OsCCoAOMT1蛋白在水稻莖部表達量更高，推測其可能參與水稻莖部生長發(fā)育和營養(yǎng)運輸，且該抗體可特異性的用于免疫熒光分析，為后續(xù)研究其在水稻生長發(fā)育以及抵抗病原侵染等功能奠定了基礎。