關(guān)志秀 汪燕 梁成剛 韋春玉 黃娟 陳慶富

（貴州師范大學生命科學學院蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心，貴陽 550001）

植物類鈣調(diào)磷酸酶B蛋白（calcineurin B-like protein，CBL）是細胞中游離鈣的感受器，在調(diào)控植物生長發(fā)育和響應逆境脅迫中發(fā)揮重要作用［1-2］。CBL具有典型的EF-hand結(jié)構(gòu)，EF-hand結(jié)構(gòu)及其結(jié)構(gòu)數(shù)目與Ca2+結(jié)合有著密切關(guān)系［3-4］。1998年，在擬南芥中首次發(fā)現(xiàn)了CBL蛋白，與動物的鈣調(diào)神經(jīng)素調(diào)節(jié)B亞基和神經(jīng)細胞的鈣感受蛋白序列高度同源，能響應鹽脅迫［5］。植物中CBL家族蛋白成員數(shù)量具有明顯差異，例如，在水稻［6］、玉米［7］中發(fā)現(xiàn)CBL家族包含10個成員。Li等［8］在茄子中共鑒定到5個CBL蛋白，能響應Na+、Mg2+、K+、Cl-離子脅迫。Feng等［9］在甜根子草中鑒定出9個CBL基因，其中SsCBL01蛋白參與低K+脅迫響應。Xi等［10］在葡萄中鑒定出了8個CBL基因，VvCBLs基因在低溫脅迫下起重要作用。Jung等［11］在白菜中鑒定的BrCBL基因能響應冷、干旱以及鹽脅迫。另外，不同CBLs基因響應非生物脅迫的表達模式也存在差異。例如，Su等［12］研究表明ScCBL2-1和ScCB L3-1在PEG、NaCl、CuCl2等脅迫下表達上調(diào)，而ScCBL4基因表達下調(diào)。玉米ZmCBL9基因可負調(diào)控ABA信號、生物合成與分解代謝途徑的基因表達［13］。

苦蕎起源于中國的西南部，是我國重要的特色雜糧作物［14-15］?？嗍w富含的黃酮類化合物對改善糖脂代謝以及預防糖尿病等具有積極作用［16-19］?？嗍w主要栽植于西南高寒山區(qū)，其種植區(qū)大多為典型的喀斯特石漠化地域［20］。喀斯特地貌是由碳酸類的巖石發(fā)育而來，特殊的地質(zhì)使得水土流失嚴重［21-22］。土壤退化且時常伴有干旱發(fā)生，土壤中高濃度的Ca2+嚴重影響了植物的生長［23-24］。長期的栽培馴化使得苦蕎具備了較好的耐瘠薄、抗干旱等生長特性，能夠很好的適應干旱高鈣環(huán)境生長［25］。植物CBL蛋白為Ca2+感受器，在響應逆境脅迫中起重要作用。本研究利用生物信息學方法鑒定苦蕎FtCBL基因，并通過干旱高鈣脅迫處理，研究苦蕎FtCBLs基因的表達量變化規(guī)律，為解析苦蕎耐干旱高鈣機理以及FtCBL基因功能提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選用苦蕎品種晉蕎麥2號種子為材料，將飽滿度一致的種子放入裝有預滅菌珍珠巖的發(fā)芽盤（25 cm ×15 cm ×5 cm）里，置于人工智能光照培養(yǎng)箱（25℃/20℃，12 h/12 h）中種植培養(yǎng)。待種子出苗后第10天分別使用濃度為15%聚乙二醇（PEG）［26］、0.15 mol/L CaCl2［27］、15% PEG+0.15 mol/L CaCl2分別模擬干旱、高鈣、干旱高鈣的脅迫，以添加蒸餾水為對照，3次重復。分別于處理后8 h、24 h取整株幼苗，迅速使用液氮速凍，然后置于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 苦蕎FtCBL基因序列分析 登錄擬南芥基因庫網(wǎng)站（https://www.arabidopsis.org/about/datasources.jsp）查詢AtCBL基因序列。利用苦蕎基因組（http://mbkbase.org/Pinku1/）與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（https://ngdc.cncb.ac.cn/search/?dbId=&q=PRJNA007201），基 于基因功能注釋與AtCBL同源序列分析，篩選和鑒定 苦 蕎FtCBL基 因。使 用ExPASy-ProtParam tool（https://web.expasy.ory/protparam/）對篩選到的5個FtCBL基因（無剔除）進行理化性質(zhì)預測。運用MapChart 2.32繪制基因在染色體上的定位圖。利用http://xfam.org/網(wǎng)站對苦蕎FtCBL進行結(jié)構(gòu)域分析。利用http://gsds.gao-lab.org/在線網(wǎng)站對FtCBL進行基因結(jié)構(gòu)分析。使用TBtools軟件和PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線工具分析FtCBL啟動子順式元件。分別運用https://npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html與SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.ory）在線工具預測FtCBL二級與三級結(jié)構(gòu)。將苦蕎FtCBL蛋白序列置于NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）網(wǎng)站進行Blast選出與苦蕎同源的CBL蛋白，使用MEGA5.0軟件ClustalW進行多重序列分析，Neighobr-joining構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，重復次數(shù)5 000次。利用DNAMAN比較分析FtCBL及其同源蛋白序列。

1.2.2 苦蕎酶活性與FtCBL基因表達分析 稱取鮮樣約0.200 g，置于預冷的研缽中，加入1.6 mL 50 mmol/L預冷的磷酸緩沖液（pH 7.8）研磨成勻漿，后轉(zhuǎn)入離心管中在4℃、12 000×g下離心20 min，取上清液進行酶活性測定。參考李合生［28］方法測定過氧化氫酶（CTA）活性，以PBS為對照。參照曾秀存等［29］方法進行抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測定，以不加H2O2為空白對照。

按照EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒步驟進行苦蕎RNA的提取，按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟合成cDNA。使用Primer premier 5軟件設計特征引物（表1）。參考梁成剛等［30］方法進行RT-qPCR分析，以FtActin為內(nèi)參基因，3次生物學重復。

表1 RT-qPCR基因表達的引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR of gene expression

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 使用Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)整理，使用SPSS 19.0軟件中t-test進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 苦蕎FtCBL序列分析

2.1.1 苦蕎FtCBL基因理化性質(zhì)與序列分析 利用生物信息學方法共鑒定到5個苦蕎FtCBL的基因，cDNA序列長度在642-684 bp間，編碼氨基酸213-227個，分子質(zhì)量為24 305.5-26 265.9 Da，等電點在4.7-4.9間，脂肪族氨基酸指數(shù)在86.01-90.62間（表2）。

表2 苦蕎FtCBL基因理化性質(zhì)分析Table 2 Physicochemical properties analysis of FtCBL in F. tataricum

苦蕎FtPinG0007340500.01和FtPinG00039819-00.01分別位于第3條染色體的20859357-20862492和4518499-4521025區(qū)域，F(xiàn)tPinG0008915000.01位于第4條染色體的55388613-55393127區(qū)域，F(xiàn)tPin G0000638500.01和FtPinG0003042400.01分 別 位 于第5條染色體的3296504-3300052和14628581-14634047區(qū)域（圖1）?；蚪Y(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，5個FtCBL基因均含有7個內(nèi)含子和8個外顯子（圖2-A）。啟動子順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)苦蕎FtCBL基因啟動子區(qū)域存在光響應元件、茉莉酸甲酯響應元件、水楊酸響應元件、赤霉素響應元件、生長素響應元件、脫落酸響應元件、低溫響應元件以及防御脅迫響應元件，其中，F(xiàn)tPinG0000638500.01基因含有6類共18個順式元件，F(xiàn)tPinG0003042400.01存在3類共16個順式元件，F(xiàn)tPinG0003981900.01含有6類共15個順式元件，F(xiàn)tPinG0007340500.01含有6類共24個順式元件，F(xiàn)tPinG0008915000.01含有3類共14個順式作用元件（圖2-B）。

圖1 苦蕎FtCBL的染色體定位圖Fig.1 Chromosome location of FtCBL in F. tataricum

圖2 苦蕎FtCBL基因結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Analysis of FtCBL gene structure in F. tataricum

2.1.2 苦蕎FtCBL蛋白的聚類與結(jié)構(gòu)分析 利用苦蕎FtCBL蛋白與其同源的蛋白序列進行聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20個蛋白被聚成4組，組II中包括3個苦蕎FtCBL蛋白，其中苦蕎FtPinG0007340500.01（FtCBL2）與葡萄VvCBL2、擬南芥AtCBL2、油菜BnaCBL2聚在一起，苦蕎FtPinG0003042400.01（Ft-CBL3-1）和FtPinG0008915000.01（FtCBL3-2）與葡萄VvCBL3聚在一起。類III中包括2個苦蕎FtCBL蛋白，F(xiàn)tPinG0003981900.01（FtCBL1）和FtPinG00-00638500.01（FtCBL9）聚在一起（圖3）。將擬南芥AtCBL與苦蕎FtCBL蛋白進行多重序列比對發(fā)現(xiàn)，苦蕎與擬南芥CBL蛋白序列相似度達到75.25%，序列保守度較高（圖4）。

圖3 苦蕎CBL家族蛋白序列的聚類圖Fig.3 Dendrogram of CBL family protein sequence inF. tataricum

圖4 苦蕎與擬南芥CBL家族蛋白序列的多重比較分析Fig.4 Multiple comparison analysis of CBL family protein sequence in F. tataricum and Arabidopsis

蛋白結(jié)構(gòu)域預測發(fā)現(xiàn)，苦蕎5個FtCBL蛋白均含有EF-hand-7結(jié)構(gòu)域，其中FtCBL9蛋白還含有EF-hand-8結(jié)構(gòu)域。蛋白二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)tCBL蛋白中α-螺旋占49.3%-56.0%，延長鏈占4.44%-7.51%，β-折疊占6.1%-8.37%，無規(guī)卷曲占30.84%-36.15%（表2，圖5）。FtCBL蛋白三維結(jié)構(gòu)均以α-螺旋為主，其中FtCBL9蛋白構(gòu)象與其余4個FtCBL蛋白差異較明顯，這可能與FtCBL9蛋白具有兩個EF-hand結(jié)構(gòu)域有關(guān)（圖5）。

圖5 苦蕎FtCBL蛋白結(jié)構(gòu)域（A）與三維結(jié)構(gòu)（B）預測Fig.5 Prediction of domain（A）and tertiary structure（B）in FtCBL protein in F. tataricum

2.2 干旱高鈣對苦蕎逆境響應代謝酶活性的影響

使用15% PEG、0.15 mol/L CaCl2、15% PEG+0.15 mol/L CaCl2分別模擬干旱、高鈣和干旱高鈣環(huán)境對苦蕎幼苗進行處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫后8 h苦蕎過氧化氫酶（CAT）與抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性急劇升高，在8 h和24 h時活性均顯著或極顯著高于對照；高鈣脅迫后8 h和24 h苦蕎CAT和APX活性與對照差異未達到顯著水平；干旱+高鈣脅迫后8 h和24 h苦蕎CAT和APX活性均顯著或極顯著高于對照（圖6）。

圖6 不同脅迫對苦蕎CAT與APX活性的影響Fig.6 Effects of different stress on the CAT and APX activities in F. tataricum

2.3 干旱高鈣對苦蕎FtCBL基因表達的影響

由圖7可知，干旱脅迫下FtCBL1基因在8 h、24 h表達量顯著下降，F(xiàn)tCBL2基因表達量在處理后8 h、24 h均極顯著提高，F(xiàn)tCBL3-1基因表達量在處理后8 h極顯著提高，但FtCBL3-2和FtCBL9基因表達量差異不顯著；高鈣脅迫下FtCBL1基因在8 h、24 h表達量顯著下降，F(xiàn)tCBL2在8 h、24 h表達量顯著或極顯著提高，F(xiàn)tCBL9基因在24 h表達量顯著下降，但FtCBL3-1、FtCBL3-2基因表達量差異不顯著；干旱+高鈣脅迫下FtCBL3-1在8 h、24 h表達量顯著和極顯著提高，F(xiàn)tCBL1、FtCBL2、FtCBL3-2、FtCBL9基因表達量與對照差異不顯著。

圖7 不同脅迫下苦蕎FtCBL基因的表達分析Fig. 7 Analysis of FtCBL expression in F. tataricum under different stress

3 討論

植物CBL是一類鈣感受器，可參與特定信號轉(zhuǎn)導。研究發(fā)現(xiàn)，CBL被Ca2+激活后，可與CIPK結(jié)合，進而激活下游基因，參與逆境響應［9］。植物CBL蛋白具有特殊的EF-hand結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)與Ca2+的結(jié)合位置有關(guān)［3，12，31］。一般認為，EF-hand結(jié)構(gòu)的數(shù)目與Ca2+結(jié)合能力有關(guān)［4］。本研究共鑒定到5個苦蕎FtCBL蛋白，均包含有EF-hand結(jié)構(gòu)域。其中FtCBL9存在兩個結(jié)構(gòu)域，推測該蛋白與Ca2+的結(jié)合能力更強。

趙晉鋒等［32］在谷子中鑒定到7個SiCBL基因，其序列非常保守，與擬南芥、水稻、高粱、玉米、苔蘚和火炬松CBL一起被聚為4個組，存在垂直同源基因?qū)εc平行同源基因?qū)Α｜S瓜CBL4則與擬南芥CBL2為直系同源，且蛋白序列的相似度高達89.82%［33］。另外，蒺藜苜蓿CBL［34］、馬鈴薯CBL［4］等都存在直系的同源基因也存在垂直同源基因?qū)?。本研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎5個FtCBL蛋白序列與擬南芥相似度達75.25%，高度保守。聚類分析將苦蕎與其同源CBL蛋白序列聚為4組，這與趙晉鋒等［32］研究結(jié)果一致。不過，苦蕎中僅包含兩組CBL蛋白，但同樣存在垂直同源基因?qū)εc平行同源基因?qū)Α?/p>

我國苦蕎主產(chǎn)區(qū)大多在喀斯特區(qū)域，長期的栽培馴化使得苦蕎具備了較好的非生物脅迫耐受力。本研究發(fā)現(xiàn)PEG模擬的干旱脅迫使苦蕎CAT與APX活性急劇升高，但在CaCl2處理下APX活性變化不明顯，說明苦蕎較能適應在喀斯特地區(qū)高鈣環(huán)境下生長。近年來已經(jīng)克隆到一些與苦蕎耐逆境脅迫相關(guān)的基因［35］。植物CBL基因能響應逆境環(huán)境，但在不同逆境程度與不同逆境脅迫下的表達模式并不相同［36］。例如，甜菜CBL基因在低濃度鹽脅迫下表達量高，而高濃度鹽脅迫下降低［31］。Wang等［37］研究發(fā)現(xiàn)，在PEG處理下玉米ZmCBL4表達量在2 h、6 h上升，但在12 h下降，不過隨后又上升，到24 h達到峰值。轉(zhuǎn)基因擬南芥中AtCBL1受干旱脅迫誘導表達上調(diào)，但受冷脅迫表達量下調(diào)［38］。本研究發(fā)現(xiàn)苦蕎FtCBL1在干旱脅迫下表達量顯著下調(diào)，推測不同物種間CBL1基因?qū)Ω珊档捻憫嬖诓町?。此外，苦蕎FtCBL1在高鈣脅迫下表達量顯著下調(diào)，不過，在干旱高鈣雙重脅迫下表達量與對照無明顯差異。韓玉燕等［39］研究發(fā)現(xiàn)蓮藕CBL2受NaCl與ABA誘導表達，推測CBL2基因可能參與ABA信號轉(zhuǎn)導途徑，進而調(diào)控蓮藕耐鹽能力。本研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎FtCBL2在干旱和高鈣單獨脅迫下表達量均極顯著上調(diào)，推測FtCBL2在響應干旱或高鈣脅迫下發(fā)揮重要作用，但在干旱高鈣雙重脅迫下FtCBL2表達量同樣差異不顯著。蔡瓊等［40］研究指出馬尾松PmCBL3基因受干旱脅迫誘導，在15 d表達量最高，但隨干旱脅迫加劇表達量逐漸降低。本研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎FtCBL3-1在干旱脅迫8 h、干旱高鈣脅迫8 h、24 h顯著或極顯著上調(diào)；但不同脅迫下FtCBL3-2表達量與對照均未達到顯著水平，表明FtCBL3-1可參與響應干旱、干旱高鈣脅迫。胡斐等［41］研究發(fā)現(xiàn)，過量表達擬南芥AtCBL9可提高甘蔗耐低鉀能力。本研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎FtCBL9僅在高鈣脅迫下表達量顯著下調(diào)，在干旱和干旱高鈣下表達量差異不顯著，說明FtCBL9僅能響應高鈣脅迫。本研究鑒定到的5個苦蕎FtCBL基因在干旱、高鈣、干旱高鈣脅迫下表達模式不盡相同，這可能與CBL基因響應脅迫的表達模式受逆境應答的不同信號途徑調(diào)控有關(guān)［32］。此外，有研究認為基因的表達還受到啟動子區(qū)域順式作用元件種類與數(shù)量的影響［42］。植物CBL基因含有多種激素與脅迫響應元件［34］?？嗍wFtCBL基因的啟動子區(qū)域間同樣存在多種順式作用元件，但不同基因間順式作用元件的種類與數(shù)量存在差異，例如FtCBL1和FtCBL2啟動子區(qū)域存在多個激素與脅迫響應元件，而FtCBL3-1和FtCBL3-2均不存在茉莉酸甲酯、水楊酸、赤霉素、生長素、脫落酸響應元件，說明FtCBL基因響應逆境脅迫的表達模式也受到了啟動子順式作用元件的調(diào)控。

4 結(jié)論

本研究鑒定到5個苦蕎FtCBL基因，編碼213-227個氨基酸，蛋白序列高度保守，均具有EF-hand結(jié)構(gòu)域。不同F(xiàn)tCBL基因在干旱、高鈣、干旱高鈣脅迫下表達模式存在差異，其中FtCBL1、FtCBL2響應干旱、高鈣脅迫，F(xiàn)tCBL3-1響應干旱、干旱高鈣脅迫，F(xiàn)tCBL9響應高鈣脅迫。