馮帥華，徐無忌，仇湘中，吳官保，張信成，謝 芳，廖建暉

(1.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410006；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410005)

腰椎間盤退變(Lumbar disc degeneration，LDD)是臨床導(dǎo)致下腰痛常見的原因之一，其以髓核細(xì)胞增殖活性及數(shù)量減少、細(xì)胞外基質(zhì)的合成與分解失衡為病理特點(diǎn)[1]。根據(jù)《全球疾病負(fù)擔(dān)》報(bào)告，下腰痛是導(dǎo)致殘疾的主要原因之一，占總致殘率的10.7%[2]。六味地黃丸是滋陰補(bǔ)腎的經(jīng)典名方，對(duì)腎陰虛型LDD有突出療效[3]。目前，六味地黃丸干預(yù)LDD的具體作用機(jī)制尚不明確，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，挖掘六味地黃丸治療LDD的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 資料來源 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)、Gene Cards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、Uniprot數(shù)據(jù)庫。

1.2 研究方法

1.2.1 六味地黃丸有效成分及作用靶點(diǎn)篩選：應(yīng)用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索六味地黃丸中熟地黃、山茱萸、牡丹皮、山藥、澤瀉、茯苓的有效成分。以口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)>30%、類藥性(Drug likeness，DL)>0.18為檢索條件對(duì)檢索結(jié)果進(jìn)行篩選，得到六味地黃丸的有效成分。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索六味地黃丸有效成分的全部靶點(diǎn)，通過Perl插件篩選出六味地黃丸有效成分的作用靶點(diǎn)。

1.2.2 LDD疾病靶點(diǎn)篩選：本研究設(shè)置檢索詞為“Lumbar disc degeneration”，檢索Gene Cards數(shù)據(jù)庫及OMIM數(shù)據(jù)庫，以相關(guān)性分?jǐn)?shù)≥7為限制條件對(duì)檢索結(jié)果進(jìn)行篩選，并應(yīng)用Uniprot數(shù)據(jù)庫對(duì)疾病靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.3 共同靶點(diǎn)篩選及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：應(yīng)用相關(guān)軟件篩選出六味地黃丸中藥物有效成分與LDD的共同作用靶點(diǎn)。在String數(shù)據(jù)庫中輸入共同作用靶點(diǎn)，物種設(shè)置為人類蛋白，以0.7為最低互動(dòng)分?jǐn)?shù)，通過數(shù)據(jù)庫建立蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(Protein protein interaction，PPI)。通過R軟件統(tǒng)計(jì)分析獲得共同靶點(diǎn)在PPI網(wǎng)絡(luò)中出現(xiàn)的頻次，并依次排序。

1.2.4 構(gòu)建六味地黃丸-LDD調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖：應(yīng)用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建六味地黃丸-LDD調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)圖中每一個(gè)節(jié)點(diǎn)代表有效成分或靶點(diǎn)，每一條連線代表節(jié)點(diǎn)之間的相互關(guān)系。

1.2.5 GO和KEGG通路富集分析：在Bioconductor數(shù)據(jù)庫中下載相關(guān)數(shù)據(jù)，應(yīng)用R軟件對(duì)藥物與疾病共同作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析和KEGG富集分析，應(yīng)用Perl插件對(duì)部分結(jié)果進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

2 結(jié) 果

2.1 六味地黃丸有效成分與作用靶點(diǎn) 根據(jù)設(shè)定的檢索條件，得到六味地黃丸的有效成分。從結(jié)果來看，熟地黃有效成分2種，山藥有效成分16種，山茱萸有效成分20種，茯苓有效成分15種，澤瀉有效成分10種，丹皮有效成分11種，刪除重復(fù)部分后得到六味地黃丸藥物有效成分69種，藥物作用靶點(diǎn)102個(gè)。根據(jù)藥物-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)篩選出對(duì)LDD疾病靶點(diǎn)相關(guān)的有效成分18種，見表1。

表1 六味地黃丸干預(yù)LDD的藥物有效成分

2.2 LDD疾病靶點(diǎn)篩選 以“Lumbar disc degeneration”為關(guān)鍵詞，相關(guān)性分?jǐn)?shù)≥7為篩選條件，通過檢索Gene Cards、OMIM數(shù)據(jù)庫得到LDD疾病靶點(diǎn)990個(gè)。

2.3 藥物有效成分、疾病共同靶點(diǎn)篩選及PPI網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 應(yīng)用R軟件篩選得到990個(gè)LDD疾病靶點(diǎn)與102個(gè)藥物有效成分作用靶點(diǎn)的30個(gè)共同靶點(diǎn)，分別為PTGS1、PLAU、BCL2、CASP9、CASP3、CASP8、PON1、ESR1、ADH1B、RELA、VEGFA、HIF1A、MTOR、MAPK8、ICAM1、VCAM1、EGFR、CCND1、FOS、IL-6、CAV1、MYC、BIRC5、NFE2L2、PARP1、COL3A1、HSF1、CRP、RUNX2、CTSD。在String數(shù)據(jù)庫輸入30個(gè)共同靶點(diǎn)，按互動(dòng)分?jǐn)?shù)>0.7構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)。應(yīng)用R軟件統(tǒng)計(jì)各靶點(diǎn)在PPI網(wǎng)絡(luò)中的出現(xiàn)頻次，頻次較高的MAPK8出現(xiàn)18次；ESR1、IL-6、VEGFA均為14次。

圖1 六味地黃丸與LDD共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 六味地黃丸-LDD調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖 采用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建六味地黃丸-LDD調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，其中黃色節(jié)點(diǎn)為六味地黃丸，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)為藥物有效成分，紅色節(jié)點(diǎn)為LDD，綠色節(jié)點(diǎn)為共同作用靶點(diǎn)，見圖2。

圖2 六味地黃丸-LDD調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO功能分析與KEGG通路富集分析 對(duì)共同作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能分析顯示，共有35種不同細(xì)胞生物活動(dòng)，排名前20的分子功能條目，見圖3。主要與DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活物活性、RNA聚合酶Ⅱ特異性、組蛋白脫乙?；附Y(jié)合、細(xì)胞凋亡過程的半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性等生物過程相關(guān)。對(duì)共同作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析顯示，共有105個(gè)生物途徑，排名前20的通路，見圖4。主要與卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、結(jié)直腸癌、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡等相關(guān)。

圖3 共同靶點(diǎn)GO功能分析

圖4 共同靶點(diǎn)KEGG富集分析

3 討 論

LDD是盤源性腰痛、腰椎間盤突出癥、腰椎管狹窄癥等下腰痛疾患發(fā)生的主要病理基礎(chǔ)[4]。LDD在中醫(yī)理論中屬于“腰痹病”范疇，素體稟賦不足，腎精虧損，風(fēng)寒濕邪侵襲，氣血運(yùn)行不暢，血瘀脈阻，不通則痛，故其病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)[5-6]。六味地黃丸出自錢乙《小兒藥證直決》，由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮、茯苓6味中藥組成。方中熟地黃、山茱萸、山藥滋補(bǔ)腎、肝、脾三臟之陰，是為“三補(bǔ)”，其中熟地黃甘陰補(bǔ)腎，且為君藥，用量較大，故以補(bǔ)腎為主。澤瀉、牡丹皮、茯苓為“三泄”，共為佐藥，使滋補(bǔ)而不留邪。六藥合用，三補(bǔ)三泄是補(bǔ)腎陰之基本方，擅于治療腎陰虛型腰腿疼痛[7]?，F(xiàn)代研究表明，六味地黃丸能有效促進(jìn)椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)中蛋白多糖、軟骨素及Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)，抑制p38MAPK和JNK信號(hào)通路的激活，降低髓核細(xì)胞凋亡，從而延緩腰椎間盤退變[8-10]。但上述實(shí)驗(yàn)研究均在動(dòng)物體內(nèi)或體外模型中完成，目前仍缺乏六味地黃丸干預(yù)人腰椎間盤退變的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

本研究以人類LDD疾病靶點(diǎn)為研究對(duì)象，在PPI網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置的主要是MAPK8、ESR1、IL-6、VEGFA等分子，這提示六味地黃丸可能主要通過以上靶點(diǎn)干預(yù)LDD。MAPK8是MAPKs家族的重要成員之一，MAPK8是JNK信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子，對(duì)細(xì)胞凋亡、自噬、壞死、炎癥反應(yīng)等有顯著調(diào)控作用，在多種疾病中存在異常表達(dá)[11]。ESR1是雌激素受體的亞型之一，在經(jīng)典的雌激素信號(hào)通路中，雌激素直接與細(xì)胞核內(nèi)的ESR1結(jié)合，激活下游靶基因表達(dá)，并且能促進(jìn)細(xì)胞自噬，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖[12]。IL-6是白介素分子家族的重要成員，目前大量的研究表明，IL-6與細(xì)胞的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，能促進(jìn)髓核細(xì)胞凋亡和壞死，抑制Ⅱ型膠原合成，在腰椎間盤退變過程中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用，也是導(dǎo)致炎性疼痛的主要原因之一[13]。VEGFA是血管內(nèi)皮生長因子家族成員，是促進(jìn)腫瘤血管形成的重要細(xì)胞因子，通過PI3K/AKT及NF-κB信號(hào)通路參與細(xì)胞炎癥反應(yīng)[14]。綜上，六味地黃丸對(duì)LDD的干預(yù)作用是多方面的，這可能與中藥多途徑、多靶點(diǎn)干預(yù)疾病的特點(diǎn)有關(guān)。

六味地黃丸-LDD網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖體現(xiàn)了中藥多途徑、多靶點(diǎn)干預(yù)疾病的特點(diǎn)，圖中有18種六味地黃丸的藥物有效成分，30個(gè)疾病調(diào)控靶點(diǎn)。調(diào)控靶點(diǎn)較多的藥物有效成分主要是槲皮素、豆甾醇，兩者均具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用[15-16]。研究表明，槲皮素通過抑制NF-κB信號(hào)通路活化，降低TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子表達(dá)[17-18]。研究發(fā)現(xiàn)，豆甾醇對(duì)動(dòng)物手術(shù)切口疼痛、坐骨神經(jīng)痛、內(nèi)臟疼痛等均表現(xiàn)出較好的鎮(zhèn)痛效果[19]。以上從側(cè)面反映了六味地黃丸對(duì)LDD導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)和疼痛的治療效果。綜上，MAPK8、ESR1、IL-6、VEGFA應(yīng)是開展LDD相關(guān)病理生理研究的良好切入點(diǎn)，但作者查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，LDD涉及MAPK8、ESR1、VEGFA、槲皮素、豆甾醇的研究寥寥無幾，這或許是本研究對(duì)LDD相關(guān)研究方向的提示。

KEGG分析結(jié)果顯示，六味地黃丸治療LDD主要涉及細(xì)胞凋亡、TNF、HIF-1等信號(hào)通路。髓核細(xì)胞的過度凋亡是LDD發(fā)生的主要病理基礎(chǔ)之一，抑制髓核細(xì)胞凋亡能有效的延緩椎間盤退變[20]。周文明等[21]研究表明，補(bǔ)腎壯督方含藥血清通過抑制髓核細(xì)胞線粒體凋亡通路的激活延緩椎間盤退變。六味地黃丸對(duì)髓核細(xì)胞的調(diào)控作用是否有異曲同工之妙還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。TNF信號(hào)通路是細(xì)胞凋亡通路的上游通路之一，與細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和凋亡關(guān)系密切。TNF信號(hào)通路的相關(guān)下游分子大多參與了細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，并且能調(diào)控下游MAPK、NF-κB等炎性信號(hào)通路活化[22]。這提示六味地黃丸干預(yù)LDD與抑制椎間盤退變過程中的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。低氧為椎間盤內(nèi)的正常生理環(huán)境，應(yīng)力刺激與生化環(huán)境的相互干預(yù)加速了椎間盤的退變。HIF-1信號(hào)通路是細(xì)胞在低氧刺激下做出應(yīng)激反應(yīng)的主要信號(hào)通路。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1的表達(dá)與MAPK、NF-κB信號(hào)通路相關(guān)，并能影響其下游因子VEGF的表達(dá)[23-24]。這提示在生物應(yīng)力刺激下的椎間盤內(nèi)細(xì)胞炎癥反應(yīng)可能與HIF-1信號(hào)通路有關(guān)，而六味地黃丸可能通過干預(yù)此過程延緩腰椎間盤退變。

綜上所述，本研究以六味地黃丸中藥物有效成分和LDD疾病靶點(diǎn)為研究對(duì)象，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)藥物與疾病的共同靶點(diǎn)進(jìn)行相應(yīng)分析，預(yù)測(cè)六味地黃丸可能通過MAPK8、ESR1、IL-6、VEGFA等靶點(diǎn)干預(yù)腰椎間盤退變，涉及組蛋白去乙酰化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄、整合素結(jié)合等分子功能，作用機(jī)制可能與細(xì)胞凋亡、TNF、HIF-1等信號(hào)通路相關(guān)，為六味地黃丸干預(yù)LDD的機(jī)制研究提供新方向。