周婷婷，譚 勁，吳 丹，劉 尋，李 群

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007)

口腔癌是最常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤之一，盡管目前在癌癥診斷和治療方面取得了一定進(jìn)展，但口腔癌患者的5年生存率僅為50%[1]?？谇话┑膫鹘y(tǒng)治療依賴(lài)于手術(shù)、放射治療(外束放射治療和/或近距離放射治療)及化療(順鉑等)，但口腔癌早期癥狀隱蔽，大部分患者確診時(shí)已是中晚期，錯(cuò)過(guò)最佳手術(shù)時(shí)機(jī)。雖然以上治療方式可提高患者生存率，但不良反應(yīng)較多，還會(huì)產(chǎn)生耐藥性，限制臨床療效。近年來(lái)，傳統(tǒng)中藥由于不良反應(yīng)少、安全性高、作用多靶點(diǎn)，且能夠有效抑制癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，在口腔癌的治療中表現(xiàn)突出。姜黃，味辛、苦，溫，歸脾、肝經(jīng)，具有破血行氣，通經(jīng)止痛功效；《本草綱目》曰其主治“風(fēng)痹臂痛”。姜黃素是從中藥姜黃根莖中提取的多酚類(lèi)化合物，具有多酚植物化學(xué)特性。各項(xiàng)研究表明，姜黃素及其衍生物具有廣泛的生物活性，有神經(jīng)保護(hù)、抗癌、抗炎等多種功效，且在治療口腔癌[2]、直腸癌[3]、胃癌[4]等惡性腫瘤中療效較好。基于此，本研究選取人口腔上皮癌Ca9-22細(xì)胞為研究對(duì)象，探究不同濃度姜黃素對(duì)Ca9-22細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：人口腔上皮癌Ca9-22細(xì)胞購(gòu)自上海鈺博生物科技有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與儀器：姜黃素(批號(hào)LD-1109680，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；胎牛血清(批號(hào)1658396，美國(guó)Hyclone公司)；MEM培養(yǎng)基(批號(hào)1760237，美國(guó)Hyclone公司)；DMSO培養(yǎng)液(批號(hào)BCBR6170V，美國(guó)Sigma公司)；胰酶(批號(hào)2750018，美國(guó)Gibco公司)；MTT溶液(批號(hào)A1720090，美國(guó)Aladdin公司)；碘化丙啶(批號(hào)B07T00102，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司)；0.05%胰酶-EDTA(批號(hào)25300-054，美國(guó)Life Technologies公司)；磷酸鹽緩沖液(批號(hào)20140918，北京索萊寶科技有限公司)；Bcl-2(批號(hào)sc-7382，美國(guó)Cell Signaling公司)；Bax(批號(hào)sc-4239，美國(guó)Cell Signaling公司)；β-catenin(批號(hào)8480，美國(guó)Cell Signaling公司)；兔抗Wnt1多克隆抗體(批號(hào)251822，成都正能生物有限公司)；C-myc多克隆抗體(批號(hào)EPR17924，英國(guó)Abcam公司)；Caspase-3、Caspase-9活性檢測(cè)試劑盒(批號(hào)AC030、AC062，Beyotime公司)；細(xì)胞裂解液(批號(hào)031020200604，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；硝酸纖維素膜(批號(hào)FFN03，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；β-巰基乙醇(批號(hào)20160322，白鯊生物公司)；青霉素(批號(hào)25465787，上海國(guó)藥集團(tuán))；鏈霉素(批號(hào)5465687，上海國(guó)藥集團(tuán))；Bradford蛋白定量試劑盒(批號(hào)053117171218，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；實(shí)時(shí)熒光定時(shí)PCR系統(tǒng)(型號(hào)Light Cycler480，瑞士Roche公司)；酶標(biāo)儀(型號(hào)VICTOR X5，美國(guó)Perkinelmer公司)；BX53MRF-S顯微鏡(日本Olympus公司)；垂直電泳儀(型號(hào)DYY-6C，北京六一生物科技有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(型號(hào)MIR-162-PC/MIR-262-PC，日本松下公司)；流式細(xì)胞儀(型號(hào)FACSCantoⅡ，BD Biosciences公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組：取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的Ca9-22細(xì)胞在MEM培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并添加10%胎牛血清、新鮮完全培養(yǎng)液100 μl，培養(yǎng)液中含100 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素。所有細(xì)胞均置于飽和濕度、37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱中。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率：將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的Ca9-22細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，以3×105細(xì)胞密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞完全貼壁，加入姜黃素使最終濃度分別為5、10、20、40 μmol/L，設(shè)為姜黃素處理組，0 μmol/L為對(duì)照組，每組3個(gè)復(fù)孔。干預(yù)24、48、72 h后，培養(yǎng)基中加入0.5 mg/ml的MTT溶液，37 ℃避光孵育3 h。洗滌細(xì)胞，然后向培養(yǎng)孔中加入1 ml的0.04 mol/L鹽酸異丙醇溶液，繼續(xù)孵育15 min。最后，將200 μl反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到96孔平底板的孔中，在450 nm處測(cè)量吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組D450nm/對(duì)照組D450nm)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：將Ca9-22細(xì)胞接種到T25燒瓶中，分別用5、10、20、40 μmol/L的姜黃素處理，37 ℃暴露48 h。暴露后，使用0.05%胰蛋白酶和0.01%EDTA從燒瓶中分離細(xì)胞，離心，用磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)洗滌，將沉淀懸浮在300 μl的PBS中，并與0.5 μl膜聯(lián)蛋白V-FITC和10 μl碘化丙啶室溫避光15 min。使用來(lái)自BD Biosciences的FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 Caspase-3、Caspase-9活性檢測(cè)：PBS漂洗對(duì)照組及5、10、20、40 μmol/L姜黃素處理48 h后的人口腔上皮癌Ca9-22細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液后振蕩、離心5 min，吸取上清，按照Caspase-3、Caspase-9活性檢測(cè)試劑盒操作步驟測(cè)蛋白濃度。然后在405 nm波長(zhǎng)處測(cè)光密度值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法計(jì)算Caspase-3、Caspase-9活性。

1.2.5 免疫印跡法檢測(cè)Wnt/β-catenin通路相關(guān)基因及蛋白表達(dá)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Ca9-22細(xì)胞，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2 ml，于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至90%融合，隨機(jī)分為對(duì)照組和不同濃度的姜黃素處理組(5、10、20、40 μmol/L)，置于培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。24、48、72 h后常規(guī)消化收集于離心管，2500 r/min離心5 min，棄上清，加入100 ml預(yù)冷的蛋白裂解液冰上裂解30 min，4 ℃，12 000 r/min離心30 min，提取細(xì)胞總蛋白。蛋白質(zhì)濃度由Bradford法測(cè)定。將20～60 μg的混合物添加到含有10%β-巰基乙醇的等量上樣緩沖液中，并通過(guò)7%～15%丙烯酰胺凝膠遷移。電泳分離后，將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，在24 ℃的5%脫脂牛奶溶液中封閉1 h，然后在適當(dāng)濃度抗體的培養(yǎng)箱中放置過(guò)夜，最后通過(guò)ECL成像系統(tǒng)進(jìn)行條帶檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素對(duì)人口腔上皮癌Ca9-22細(xì)胞增殖的影響 使用5、10、20、40 μmol/L姜黃素處理人口腔上皮癌Ca9-22細(xì)胞24、48、72 h后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率隨姜黃素濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，且呈濃度及時(shí)間依賴(lài)性，見(jiàn)圖1。

圖1 姜黃素對(duì)人口腔上皮癌Ca9-22細(xì)胞存活率的影響

2.2 姜黃素對(duì)人口腔上皮癌Ca9-22細(xì)胞凋亡的影響 對(duì)照組、5 μmol/L姜黃素處理組、10 μmol/L姜黃素處理組、20 μmol/L姜黃素處理組及40 μmol/L姜黃素處理組48 h細(xì)胞凋亡率逐漸上升，且不同濃度姜黃素處理組的細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 姜黃素對(duì)人口腔上皮癌Ca9-22細(xì)胞凋亡率的影響(%)

2.3 姜黃素對(duì)人口腔上皮癌Ca9-22細(xì)胞Bax mRNA、Bcl-2 mRNA表達(dá)及Caspase-3、Caspase-9活性的影響 見(jiàn)表2。與對(duì)照組比較，不同濃度姜黃素處理組Bax mRNA表達(dá)及Caspase-3、Caspase-9活性均升高，Bcl-2 mRNA表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且其作用效果與姜黃素濃度呈劑量依賴(lài)性。

表2 姜黃素對(duì)人口腔上皮癌Ca9-22細(xì)胞Bax mRNA、Bcl-2 mRNA表達(dá)及Caspase-3、Caspase-9活性的影響

2.4 姜黃素對(duì)人口腔上皮癌Ca9-22細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響 與對(duì)照組比較，不同濃度姜黃素處理組β-catenin、C-myc、Wnt1蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

A：對(duì)照組；B：5 μmol/L姜黃素處理組；C：10 μmol/L姜黃素處理組；D：20 μmol/L姜黃素處理組；E：40 μmol/L姜黃素處理組圖2 姜黃素對(duì)人口腔上皮癌Ca9-22細(xì)胞β-catenin、C-myc、Wnt1蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

口腔癌屬中醫(yī)“牙巖”“上石疽”“失榮癥”“口菌”等范疇，病因分為內(nèi)因和外因，內(nèi)因?yàn)橹袣鈸p傷，氣血失常，虛火上浮；外因?yàn)樾皻馇址复娇?，?dǎo)致腎虛唇繭，牙齦潰爛作痛，痰濕聚結(jié)[5]。因此，中醫(yī)治療口腔癌以扶養(yǎng)正氣，提高患者免疫功能為主。相關(guān)研究表明，中藥姜黃素不僅具有抗氧化，抑制炎癥，提高機(jī)體免疫功能等功效，還可以抑制口腔癌細(xì)胞增殖。劉璐瑤等[6]研究顯示，姜黃素通過(guò)調(diào)節(jié)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞發(fā)揮抗癌作用。馮儒學(xué)等[7]研究證實(shí)，姜黃素通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的表達(dá)，發(fā)揮抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素對(duì)人口腔上皮癌Ca9-22細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用，且其抑制作用與濃度、時(shí)間有關(guān)。Semlali等[8]通過(guò)體外探索姜黃素類(lèi)似物(PAC)的抗癌增殖作用，證明PAC有抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡、自噬、氧化應(yīng)激的作用，且腫瘤細(xì)胞對(duì)PAC的敏感性高于人牙齦上皮細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，不同濃度姜黃素處理組Bax mRNA表達(dá)及Caspase-3、Caspase-9活性均升高，Bcl-2 mRNA表達(dá)均降低。這可能與下調(diào)Bcl-2表達(dá)，上調(diào)Bax誘導(dǎo)腫瘤Ca9-22細(xì)胞凋亡有關(guān)。線(xiàn)粒體依賴(lài)性細(xì)胞凋亡是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的最重要途徑之一，Bcl-2是內(nèi)在途徑的中心調(diào)節(jié)因子，Bax被激活后形成多聚體靠近線(xiàn)粒體膜，使線(xiàn)粒體膜通透性增加、細(xì)胞色素C的釋放增多并激活線(xiàn)粒體凋亡信號(hào)從而發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡作用，而B(niǎo)cl-2下調(diào)則促進(jìn)線(xiàn)粒體細(xì)胞色素C的釋放，與Bax發(fā)揮協(xié)同抗凋亡作用[9-11]。Caspase-3、Caspase-9是Caspase聯(lián)級(jí)反應(yīng)的關(guān)鍵效應(yīng)分子。Caspase-3不僅能接受與執(zhí)行細(xì)胞凋亡信號(hào)活化后與特定底物結(jié)合刺激癌癥細(xì)胞凋亡蛋白，還可與Caspase-9結(jié)合形成凋亡小體，激活內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑，使聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶片段化、染色質(zhì)凝集，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12-13]。

口腔癌變是復(fù)雜的多因素過(guò)程，涉及遺傳和分子改變，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控、DNA修復(fù)受損和細(xì)胞死亡[14]。在早期階段，口腔黏膜中潛在惡性病變或口腔發(fā)育不良的發(fā)作與原位癌和浸潤(rùn)性癌的惡性進(jìn)展率較高有關(guān)[15]。WNT通路涉及多種信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)通路，如胚胎發(fā)生、細(xì)胞增殖、遷移和極性、細(xì)胞凋亡、器官發(fā)生[16]。在成人階段，WNT通路未激活或沉默，然而在許多機(jī)制和病理過(guò)程中，如炎癥、代謝和神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及癌癥，WNT通路可能會(huì)失調(diào)。多項(xiàng)研究表明，Wnt/β-catenin是關(guān)鍵的誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的信號(hào)通路，其異常激活與口腔癌在內(nèi)的各種癌癥發(fā)生與發(fā)展關(guān)系密切[17-19]。β-catenin蛋白作為細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)分子，可結(jié)合Wnt1信號(hào)通路中的靶位點(diǎn)，激活Wnt1信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游靶蛋白C-myc、Cyclin D1表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度姜黃素處理組β-catenin、C-myc、Wnt1表達(dá)均低于對(duì)照組，提示姜黃素可抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的表達(dá)。姜黃素通過(guò)抑制Wnt/β-catenin通路的激活，阻止髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞的G2/M階段細(xì)胞周期，直接刺激GSK-3β活性，導(dǎo)致核β-catenin水平下降，從而導(dǎo)致C-myc表達(dá)下調(diào)。呂君等[20]研究也表明，黃芪多糖通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活，下調(diào)β-catenin、C-myc和Cyclin D1蛋白及Bcl-2基因表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。