毛麗旦·熱合木吐拉 阿地拉·艾斯卡爾 汪建平

華中科技大學(xué)同濟(jì)藥學(xué)院，湖北 武漢 430030

病原性真菌時常出現(xiàn)在大眾的視線里，它們以潮濕的地方為生存環(huán)境，在適宜條件下大量繁殖，嚴(yán)重威脅著人類的健康。據(jù)全球真菌感染行動基金會(GAFFI)統(tǒng)計，每年約有3億人感染真菌，其中約135萬人死亡[1]。環(huán)境病原真菌對人類健康威脅巨大，由于致死率高、治療藥物有限、自然界分布廣泛且流行病學(xué)特點(diǎn)不清等原因，對其防控十分困難[2]。因此，切斷其傳播途徑在感染控制方面意義重大。目前,醫(yī)院和其他公共場所如高校、社區(qū)等,常采用紫外線進(jìn)行空氣消毒,存在消毒時間維持不長且不適合在有人環(huán)境下作業(yè)等問題,且化學(xué)消毒制劑具有腐蝕性、刺激性等缺陷,噴灑后易對人體和醫(yī)療設(shè)備造成損害[3]。反觀天然藥物，其來源豐富、成本低廉，在殺菌過程中不會造成二次污染，且氣味芳香、高效安全，適合作為空氣和環(huán)境消毒產(chǎn)品研發(fā)。

青蒿為菊科植物黃花蒿ArtemisiaannuaL.的干燥地上部分，秋季花盛開時采割，除去老莖，陰干[4-6]。其味苦、辛，性寒，歸肝、膽經(jīng)，具有“ 清虛熱，除骨蒸，解暑熱，截瘧，退黃”的功效，用于溫邪傷陰、夜熱早涼、陰虛發(fā)熱、骨蒸勞熱、暑邪發(fā)熱、瘧疾寒熱、濕熱黃疸[6]。

青蒿化學(xué)成分多樣，包括倍半萜、二萜、黃酮、苯丙酸、香豆素和揮發(fā)油等類成分[7-8]。其中倍半萜類既是青蒿的主要成分也是重要的有效部位，藥理作用豐富，如解熱、抗炎、抗病原微生物、抗哮喘、抗氧化、抗腫瘤等[8]。

本實(shí)驗以中藥青蒿為原料，通過抑制煙曲霉(Aspergillusfumigatus)和黃曲霉(Aspergillusflavus)的實(shí)驗研究，為其抑制真菌的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與試劑

青蒿(ArtemisiaannuaL.)，購自安徽毫州(批號： 20200916)，由本實(shí)驗室汪建平教授鑒定；受試真菌煙曲霉(Aspergillusfumigatus)和黃曲霉(Aspergillusflavus)由本室從環(huán)境中分離。

2 方法

2.1 真菌的鑒定 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)真菌;取新鮮真菌,利用微波法提取真菌DNA;利用ITS1和ITS4引物PCR擴(kuò)增真菌核糖體間區(qū)DNA片段;PCR片段回收后序列測定;利用NCBI的Blast對所得的序列進(jìn)行比對。

2.2 提取物與供試液的制備 取青蒿50 g，于體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液1000 mL浸沒后，回流提取，用時1.5 h。提取液過濾、待旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮發(fā)掉大部分溶劑后，得深褐色濃稠液50 mL，貯藏于陰涼處。

以青蒿提取物濃度(V青蒿/V乙醇)為5%、10%、15%和20%，乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%、20%和30% 配置12組供試液。

2.3 體外抑菌活性研究

2.3.1 接種 將供試菌用接種環(huán)挑取，分別接種于20個普通瓊脂培養(yǎng)基上，置于霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并記錄菌落生長情況。

2.3.2 抑菌效力測定 在無菌條件下將圓形濾紙用配置好的供試液潤濕，以乙醇體積分?jǐn)?shù)為單一變量將已經(jīng)被供試液潤濕的濾紙片平放在平板上，使其形成透明的抑菌圈，濾紙片周圍有抑菌圈者為陽性，無抑菌圈者則為陰性。根據(jù)抑菌圈的大小可判斷相應(yīng)濃度提取液抑菌作用的強(qiáng)弱，同時進(jìn)行兩組平行實(shí)驗，以確定結(jié)果的一致性。在同一霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)48 h，每12 h觀察結(jié)果并記錄。

3 結(jié)果與結(jié)論

3.1 受試菌的鑒定

煙曲霉(Aspergillusfumigatus)檢測序列：

利用NCBI的Blast進(jìn)行序列比對，相似度為98%，鑒定為煙曲霉(Aspergillusfumigatus)。

黃曲霉(Aspergillusflavus)檢測序列：

利用NCBI的Blast進(jìn)行序列比對，相似度為99%，鑒定為黃曲霉(Aspergillusflavus)。

3.2 抑菌效果觀察 乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%的一組沒有出現(xiàn)菌絲的繁殖現(xiàn)象。由此確定體積分?jǐn)?shù)為10%的乙醇作溶劑效果較好。比較不同濃度提取液抑菌情況，進(jìn)一步觀察到提取液濃度為15%和20%的濾紙片周邊無菌絲，推斷該濃度下的提取液滲透效果較好。

具體的侵染情況見表1、表2。

表1 煙曲霉(Aspergillus fumigatus)實(shí)驗組中各溶液的侵染情況

表2 黃曲霉(Aspergillus flavus)實(shí)驗組中各溶液的侵染情況

3.3 驗證 以提取液濃度為15%、20%、25%和30%，乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%配置4組供試液。同法進(jìn)行三組平行實(shí)驗以確定最佳提取物濃度。觀察到提取液濃度為15%和20%的濾紙片周邊無菌絲。

3.4 確定處方 由實(shí)驗結(jié)果知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%，提取液濃度為15%和20%時，抑制真菌繁殖的能力明顯優(yōu)于其他組?？紤]到提取成本，確定處方為乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%，青蒿提取液濃度為15%。

圖1 青蒿提取液對煙曲霉(左)和黃曲霉(右)的抑制

3.5 灌裝 將配置好的藥液等量裝入一定規(guī)格的噴瓶。噴出的液滴大小均勻、在空氣中分散效果較好，因此，不必加入表面活性劑或助推劑，即可制備成抑制真菌的青蒿噴霧劑。

3.6 青蒿提取液的化學(xué)成分預(yù)實(shí)驗 取青蒿提取液，分別進(jìn)行化學(xué)成分的初步檢識。

3.6.1 鹽酸鎂粉反應(yīng) 取青蒿提取液，加入少許鎂粉振搖,再滴加幾滴濃鹽酸,1～2 min，顯紫紅色。

3.6.2 異羥肟酸鐵反應(yīng) 取樣品液1 mL，加新鮮的1 moL/L鹽酸羥胺甲醇液0.5 mL、6 mL/L氫氧化鉀甲醇液0.2 mL，加熱至沸，冷后加5%鹽酸酸化，最后加1%三氯化鐵溶液1～2滴，顯紫紅色。樣品液在365 nm紫外燈下顯熒光。

3.6.3 醋酐-濃硫酸顯色反應(yīng) 取樣品少量于試管內(nèi)，用醋酐溶解，進(jìn)行醋酐-濃硫酸顯色反應(yīng)，溶液最終呈紅色。

綜上，可初步判斷青蒿提取液中含萜類、黃酮類、香豆素類化學(xué)成分。

4 討論

本實(shí)驗采用的煙曲霉(A.fumigatus)和黃曲霉(A.flavus), 屬腐生真菌[9]，為人類常見病原性真菌。全球因血液系統(tǒng)疾病、遺傳免疫缺陷或?qū)嶓w器官移植等相關(guān)免疫抑制所致的侵襲性曲霉菌病(invasive aspergillosis, IA)已超過200 000例/年[9-10]。霉菌的繁殖能力強(qiáng)，且方式多樣，無性或有性孢子作為其繁殖體具有小、輕、干、多、休眠期長和抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，這些特點(diǎn)有助于煙曲霉(A.fumigatus)和黃曲霉(A.flavus)在自然界中隨處散播和繁殖，因此切斷其傳播至關(guān)重要[11-12]。

在提取方面，考慮到乙醚的毒性和易燃性，選擇了乙醇作溶劑。本實(shí)驗中，乙醇既作為提取溶劑，也作為噴霧分散劑；乙醇本身有抑菌效果，但本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，10%的乙醇，效果更好，說明青蒿提取物能起到真菌抑制作用。

據(jù)文獻(xiàn)報道，青蒿主要含有黃酮類化合物(如蘆丁rutin、雪梨苷cynaroside、異鼠李苷isorhamnetin等)[13]、香豆素類化合物(如東莨菪苷scopolin、東莨菪素scopoletin等)和倍半萜類化合物(如青蒿素artemisinin、雙氫青蒿酸dihydroartemisinic acid、青蒿酸artemisinic acid等)[14]。本實(shí)驗提取的青蒿提取液化學(xué)成分初步檢識試驗表明，提取液也含萜類、黃酮類、香豆素等。

本實(shí)驗以青蒿為原料，以乙醇提取的有效部位，具有顯著的抑制真菌煙曲霉(A.fumigatus)和黃曲霉(A.flavus)繁殖的作用。本實(shí)驗結(jié)果可為青蒿抑制真菌的臨床應(yīng)用提供參考。