楊元鳳 楊仁惠 韓云霞 徐 冉 陳啟乾 周訓(xùn)蓉*

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550003；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)院制劑研發(fā)中心，貴州 貴陽 550003；3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)院中藥制劑研究中心，貴州 貴陽 550003；4.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550004

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一。發(fā)病初期，病情隱匿，患者不易于察覺，隨著病情的發(fā)展，可致肌肉萎縮、四肢潰瘍、壞疽，嚴(yán)重者甚至有截肢風(fēng)險(xiǎn)[1]。目前，臨床上對(duì)DPN的治療主要為西醫(yī)對(duì)癥處理，即胰島素注射、營養(yǎng)神經(jīng)、止痛、抗氧化等，全面控制血糖，改善肢體微循環(huán)，但臨床效果有限，且藥物長期服用毒副作用增多，患者難以堅(jiān)持，影響療效[2-4]。水蛭膠囊為我院醫(yī)院制劑，前期臨床研究表明，該制劑不僅能緩解消除DPN患者手足麻木、肢體疼痛、感覺障礙等臨床不適癥狀，還能改善患者的感覺、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度[5]。為了保障患者臨床用藥安全有效，研究采用TLC法定性鑒別水蛭，采用凝血酶滴定法測(cè)定水蛭抗凝血酶活性[6-8]，為水蛭膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 AB204S電子分析天平(上海菁海儀器有限公司)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司)；YHG-600-S-Ⅱ型紅外快速干燥箱(賀德試器有限公司)；SX2式箱形電阻爐(長沙市遠(yuǎn)東電爐廠)；FA2204N型電子天平(上海菁海儀器有限公司)；舒美KQ-500DA型臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器(上海坤權(quán)生物科技有限公司)；微量移液器(Nichiryo Japan) ；H2-16K醫(yī)用離心機(jī)(湖南可成儀器設(shè)備有限公司)；硅膠G板(德國Merck)。

1.2 試藥 水蛭藥材(批號(hào):20180601，貴陽濟(jì)仁堂中藥飲片廠) 經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院韓云霞主任鑒定為水蛭科螞蟥 (WhitmaniapigraWhitman)；水蛭(螞蟥)對(duì)照藥材(批號(hào)：121061-201806，中國食品藥品檢定研究院)；凝血酶(批號(hào)：T832140-1KU，2000U/支)、牛纖維蛋白原(批號(hào)：F823833)、三羥甲基氨基甲烷(批號(hào)：T819511)均購自上海麥克林生化科技有限公司；水蛭膠囊(批號(hào)：181101、181102、181103，按制劑處方量稱取藥材400 g，70～80 ℃常壓干燥4 h，粉碎過80目篩，填充0#膠囊，分裝，0.4 g/粒，即得)。乙醇、石油醚(60～90 ℃)、丙酮、碘等為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別 參照(《中國藥典》[7]2015年版一部水蛭薄層色譜鑒別項(xiàng)下試驗(yàn)：取本品內(nèi)容物1 g，加乙醇5 mL，超聲處理15 min，濾過，取濾液作為供試品溶液。另取水蛭對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2015年版四部通則0502)試驗(yàn)[9]，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-丙酮(3∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，碘顯色，日光下檢視。結(jié)果水蛭的供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。如圖1所示。

1.水蛭對(duì)照藥材；2-4：水蛭膠囊

2.2 抗凝血酶活性測(cè)定[6-8]

2.2.1 試藥的配制

2.2.1.1 三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液 取 0.2 mol/L 三羥甲基氨基甲烷溶液25 mL與 0.1 moL/L 鹽酸溶液約40 mL，加水至100 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.4。

2.2.1.2 凝血酶溶液 取凝血酶(含2000 U) 試劑適量，加生理鹽水溶解并配制成每1 mL含凝血酶40個(gè)單位的溶液。

2.2.1.3 供試品溶液 取水蛭膠囊內(nèi)容物1 g，精密稱定，加入生理鹽水5 mL，充分?jǐn)嚢?，浸?30 min，浸提過程中時(shí)時(shí)搖晃，3000轉(zhuǎn)/min離心5 min，取上清液，即得。

2.2.2 抗凝血酶活性的測(cè)定 精密量取供試品溶液100 μL置試管中，加入含0.5%牛纖維蛋白原的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液(臨用現(xiàn)配)200 μL，搖勻，置水浴中(37±1)℃溫提5 min，在此過程中每1 min滴加 5 μL 凝血酶溶液(40 U/mL)，邊滴加邊輕輕搖晃直至可挑出白色絮狀物，記錄滴加凝血酶溶液的體積，按公式計(jì)算：U =C1V1/C2V2；式中U表示每1 g水蛭含凝血酶活性單位，U/g；C1表示凝血酶溶液的濃度，μ/mL；C2表示供試品溶液的濃度，g/mL；V1表示消耗凝血酶溶液的體積，μL；V2表示供試品溶液的加入量，μL。結(jié)果見表1。

表1 水蛭膠囊抗凝血酶活性測(cè)定結(jié)果

3 討論

水蛭是我國傳統(tǒng)蟲類活血化瘀藥，具有破血逐瘀、通經(jīng)活絡(luò)之功效[10]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[11-13]表明，水蛭主要有抗凝血、抗血栓、降脂、抗細(xì)胞凋亡、抗腫瘤等藥理作用，主要用于治療心腦血管疾病、腫瘤、泌尿系統(tǒng)疾病、周圍神經(jīng)損傷等多個(gè)病種[14]。水蛭一般用其干燥全體研磨成粉末入藥，但由于水蛭味咸、苦，直接打粉沖服，患者依從性差。我院中藥制劑研究中心將其干燥粉碎后直接填充膠囊制成膠囊劑，制成的膠囊劑可以掩蓋咸、苦味，提高患者依從性。通過臨床驗(yàn)證，水蛭膠囊可明顯改善 DPN 患者的疼痛、異樣感等臨床癥狀，并且有助于改善患者的神經(jīng)傳導(dǎo)速度[5]。為了保證制劑質(zhì)量的可靠性和可控性，本研究對(duì)其薄層鑒別和抗凝血酶活性進(jìn)行測(cè)定。

3.1 薄層鑒別 研究對(duì)展開系統(tǒng)、展開劑的比例及檢視方法進(jìn)行考察。預(yù)實(shí)驗(yàn)參照《中國藥典》2015 年版一部水蛭薄層色譜鑒別項(xiàng)下的展開條件及顯色檢視方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果色譜斑點(diǎn)不清晰、拖尾嚴(yán)重，不易于鑒別。分別考察正己烷-乙酸乙酯(4∶1)、石油醚(60～90 ℃)-丙酮(6∶1)、石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(2∶1)三種展開系統(tǒng)展開，取出，晾干，經(jīng)日光、10%硫酸乙醇-105 ℃加熱、365 nm紫外燈及碘蒸氣熏四種檢視方式檢視，綜合比較分離度、斑點(diǎn)數(shù)目和拖尾情況，可確定石油醚(60～90 ℃)-丙酮(6∶1)為比較理想的展開系統(tǒng)以及碘顯色為比較理想的顯色檢視方法。經(jīng)進(jìn)一步對(duì)石油醚(60～90 ℃)-丙酮展開系統(tǒng)的比例，結(jié)果表明以石油醚(60～90 ℃)-丙酮(3∶1)展開后，水蛭藥材薄層色譜斑點(diǎn)的比移值合適且能很好分離。因此確定水蛭薄層鑒別的展開系統(tǒng)為石油醚(60～90 ℃)-丙酮(3∶1)，顯色檢視方法為碘顯色。

3.2 抗凝血酶活性測(cè)定 水蛭的活性成分為水蛭素，是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凝血酶特異性抑制劑[15]。目前水蛭素含量測(cè)定方法有：凝血酶滴定法、纖維蛋白原平板法、生色底物的比色法、凝血酶原時(shí)間試劑盒法及光散射法等[16]。其中，凝血酶滴定法是一種簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)，應(yīng)用廣泛的水蛭素活力測(cè)定方法。考慮到實(shí)驗(yàn)條件及經(jīng)濟(jì)成本，本實(shí)驗(yàn)選擇凝血酶滴定法測(cè)定水蛭膠囊中水蛭素的抗凝血酶活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水蛭膠囊的抗凝血酶活性均值為142.0 U/g，高于《中國藥典》2015年版一部水蛭含量測(cè)定項(xiàng)下水蛭中藥材含抗凝血酶活性應(yīng)不低于16.0 U/g的要求[7]。實(shí)驗(yàn)中所用生化試劑(三羥甲基氨基甲烷、凝血酶、牛纖維蛋白原)應(yīng)冷藏在冰箱中，臨用時(shí)現(xiàn)配制，否則測(cè)定得到的抗凝血酶活性結(jié)果不準(zhǔn)確。滴加凝血酶的次數(shù)一般不要超過5次，如果次數(shù)太多，則溶液中纖維蛋白原的濃度會(huì)越來越稀，反應(yīng)現(xiàn)象不明顯。如果5次還沒有出現(xiàn)白色絮狀物則考慮稀釋樣品濃度。為了提高滴定的準(zhǔn)確度，可梯度配備不同濃度的凝血酶溶液(即可由高濃度到低濃度逐步滴加)。同時(shí)在臨近凝固點(diǎn)時(shí)，滴加凝血酶的量可以逐步減少，以此減少測(cè)定誤差。