竇永海，高曉麗

（1.天津市永久醫(yī)院，天津 300450；2.天津市第五中心醫(yī)院，天津 300450）

panobinostat（panobinostat，PBST）是一種強效口服泛組蛋白去乙?；福℉DAC）抑制劑，該抑制劑于2015年被FDA批準用于治療復發(fā)或難治性多發(fā)性骨髓瘤患者［1］。大量臨床試驗研究正在評價panobinostat對多種實體瘤中的抗癌效果，然而不可避免的耐藥是其進一步臨床開發(fā)和應用的巨大障礙。ABCB1與腫瘤細胞耐藥高度相關［2］，表達于腫瘤細胞膜的ABCB1可將抗腫瘤藥物泵出胞外，降低胞漿內(nèi)抗腫瘤藥物有效濃度，介導治療抵抗［3］。然而，尚無研究充分揭示ABCB1在panobinostat耐藥中的作用和分子機制。因此，本研究擬通過細胞水平、體外酶活性水平以及計算機輔助設計評價ABCB1介導panobinostat耐藥的作用及分子機理，進一步明確和充實PBST發(fā)生耐藥的機制。

1 資料與方法

1.1 細胞及試劑KB-3-1、KB-C2、SW620/Ad300、SW620、HEK293/pcDNA3.1以及HEK293/ABCB1均由美國St.John′s University的Zhe-Sheng Chen教授贈與。帕比司他（panobinostat，PBST，批號S1030）、依魯替尼（ibrutinib，批號S2680）、尼羅替尼（nilotinib，批號S5205）、拉帕替尼（lapatinib，批號S2111）、厄洛替尼（elortinib，批號S1023）、紫杉醇（批號S1150）、阿霉素（批號S1208）以及順鉑（批號S1166）購置于Selleck公司。牛血清白蛋白（BSA，批號37525）、特級胎牛血清（FBS，批號10099）、二甲基亞砜（批號D5879）、DMEM基礎培養(yǎng)基（批號2323405）、青/鏈霉素（批號30-001-CI）以及胰蛋白酶（批號25-051-CI）購置于美國Corning公司。PVDF膜（批號ISEQ00010）以及綠色熒光標記的Goat-anti-mouse IgG抗體（批號A-11029）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。ABCB1單克隆抗體（批號SAB2108866）、DAPI（批號D9542）、MTT（批號M2128）、BCA蛋白定量試劑盒（批號71285-M）以及verapamil（批號1711202）購置于美國Sigma公司。氚標紫杉醇（批號33152970）購置于美國Moravek公司。

1.2 儀器HERAA cell 150i細胞恒溫CO2培養(yǎng)箱以及C1112B超凈工作臺購置于美國Sigma公司。I Mark全自動酶標儀以及Powerpac hc SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳-轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購買于美國Bio-Rad公司。5418R低溫冷凍離心機購置于美國Eppendorf公司。DMI 3000B倒置熒光顯微鏡購置于瑞士Leica公司。Tri Carb 2100TR液體閃爍分析儀購置于美國Packard公司。

1.3 細胞培養(yǎng) 本研究利用的全部細胞均在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，并于含有5%濃度的CO2培養(yǎng)箱以37℃的潮濕溫度培養(yǎng)。KB-C2、SW620/Ad300為藥物誘導的耐藥細胞，在使用前需要加入相應的抗腫瘤藥物維持其耐藥性。具體方法為，在KB-C2細胞中以2 μg/ml的colchicine培養(yǎng)72 h，在SW620/Ad300細胞中以300 ng/ml的doxorubicin培養(yǎng)72 h，并更換無藥物的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)并正常傳代兩周后使用。HEK293/ABCB1為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染全長ABCB1編碼區(qū)的帶有G418抗性細胞，使用前采用2 mg/ml的G418篩選穩(wěn)定細胞72 h后，更換無藥物的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)并正常傳代兩周后使用。

1.4 基于MTT法的細胞增殖檢測及逆轉(zhuǎn)實驗 顯微鏡下觀察處于對數(shù)生長期狀態(tài)良好的細胞，PBS進行清洗，然后加入0.25%胰酶進行消化（37℃培養(yǎng)箱），消化時間根據(jù)細胞特點有些許差別，消化完成后制備單細胞懸液，并利用血球計數(shù)板計數(shù)，規(guī)定細胞密度為3×104個/ml，根據(jù)細胞實際濃度吸取特定體積的細胞懸液，并加入一定體積的培基，吸管吹打混合均勻，吸取200 μl液體加入到96孔板中，并設置空白對照，即不含細胞懸液的培基，并將邊緣孔用PBS填充，細胞鋪板完成后輕輕拍打培養(yǎng)板使細胞懸液均勻分布在孔中，于倒置光學顯微鏡下觀察細胞鋪板密度和細胞狀態(tài)，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜穩(wěn)定培養(yǎng)使細胞貼壁。細胞貼壁后，加入按濃度梯度配置好的PBST，以DMSO處理組為對照組，培養(yǎng)72 h。給藥培養(yǎng)72 h后，給藥組和對照組每個孔加20 μl MTT溶液，培養(yǎng)4 h。經(jīng)過4 h孵育，從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)板，用負壓泵吸去上清液，移液槍吸取100 μl DMSO加入到孔中，并放置于搖床上震蕩混合，使結晶紫甲瓚充分溶解，溶液呈透明色即可于酶標儀490 nm處檢測OD值。采用Graphpad 7.00軟件計算藥物對細胞的半抑制濃度。針對逆轉(zhuǎn)實驗，按照上述體系，將特定濃度的逆轉(zhuǎn)藥物加入96孔板中，于培養(yǎng)箱中孵育2 h，并按照上述步驟進行后續(xù)處理。

1.5 Western blot法評價ABCB1蛋白表達水平 取對數(shù)生長期的KB-C2細胞，消化并計數(shù)，并以2×104個/孔的濃度接種于6孔板，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中過夜穩(wěn)定培養(yǎng)。細胞貼壁后，每孔加入2 μl的panobinostat，使其KB-C2細胞藥物終濃度為100 nmol/L，加藥處理不同時間（24、48以及72 h）。處理完成后，取出細胞培養(yǎng)板，將細胞從培養(yǎng)皿底部刮下來，吸管吸取含有細胞的培養(yǎng)液加入到1.5 ml EP管中，放置于低溫離心機中進行離心，并采用冰PBS洗滌細胞，清洗1~2次。將提前配好的細胞裂解液（RAPA∶CocktailA∶CocktailB=100∶1∶1）加入到細胞沉淀中裂解細胞，收集裂解組分于離心管中，以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液為總蛋白提取液。采用BCA法進行蛋白定量，按一定比例混勻蛋白原液和超純水，使上樣蛋白量為20 μg，并加入5×SDS上樣緩沖液。在95℃水浴中孵育樣品10 min使其變性。根據(jù)比例配制凝膠，待膠凝后向孔中加入制備好的蛋白樣品和預染marker，進行電泳。電泳完成后，進行轉(zhuǎn)膜，設置轉(zhuǎn)膜條件：電流200 mA，電轉(zhuǎn)2.5 h。結束后，將PVDF膜放在提前用1×TBST緩沖溶液配置好的5%的脫脂牛奶中，于室溫置于低速搖床1 h。牛奶封閉結束。按照抗體說明書配置適當濃度的一抗（抗ABCB1，1∶1000；抗GAPDH，1∶1 000）。將膜放入雜交帶中，加入一抗稀釋液，封口機封口。放在4℃搖床上，慢搖孵育過夜。一抗孵育結束后，一抗進行回收，使用TBST緩沖液清洗PVDF膜2~3次，每次5 min。孵育二抗1 h（HRP兔抗，1∶2 000），使用TBST緩沖液清洗PVDF膜2~3次，每次5 min。配置ECL顯影液（A液∶B液=1∶1），將配置好的發(fā)光顯影液（ECL）均勻加到目的蛋白條帶上進行顯影拍照。

1.6 免疫熒光法評價ABCB1質(zhì)膜定位 取處于對數(shù)生長周期的細胞，消化并計數(shù)，并以2×104個/孔的濃度接種于6孔板，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中過夜穩(wěn)定培養(yǎng)。細胞貼壁后，每孔加入2 μl的panobinostat，使細胞藥物終濃度為100 nmol/L，加藥處理不同時間（24、48以及72 h）。實驗同時設置陰性對照組（親本細胞）和模型組（經(jīng)DMSO處理的耐藥細胞）。作用完成后，采用4%多聚甲醛作為固定液，吸取一定體積加入到孔中，固定時間為30 min。固定結束之后，棄去多聚甲醛溶液，用冰PBS洗滌兩次。然后采用0.25%的Triton X-100溶液進行透化，透化時間為5 min，再用PBS清洗液清洗2次。加入5%BSA，在37℃孵箱中進行封閉，時間為1 h。封閉結束之后，加入一定體積按照抗體說明書使用5%BSA配置的一抗稀釋液（抗P-gp，1∶500），于37℃培養(yǎng)箱中孵育1 h并用PBS進行清洗。然后孵育二抗（綠色熒光標記的Goat-anti-mouse IgG，1∶500）。利用抗熒光猝滅封片劑覆蓋板中細胞，并置于倒置熒光顯微鏡下觀察成像。

1.7 以氚標紫杉醇為探針評價藥物蓄積水平 取處于對數(shù)生長周期的細胞，消化，計數(shù)，并接種于6孔板中（2×104個/孔），轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中過夜穩(wěn)定培養(yǎng)。細胞貼壁后，每孔加入2 μl的panobinostat，使細胞藥物終濃度分別為3 μmol/L和6 μmol/L，加藥處理不同時間（24、48以及72 h）。實驗同時設置加ABCB1特異性逆轉(zhuǎn)劑（verapamil）陽性對照組，加藥處理2 h。2 h后，向孔中加入氚標紫杉醇，使其終濃度為10 μmol/L，繼續(xù)處理2 h，然后使用PBS清洗氚標抗腫瘤藥物。同時進行細胞消化操作，收集細胞轉(zhuǎn)移到液體閃爍計數(shù)瓶中，根據(jù)液體閃爍計數(shù)儀的數(shù)值確定藥物的蓄積能力。

1.8 釩敏感的ATPase活性實驗ATP酶檢測緩沖系統(tǒng)中分別加入經(jīng)過預制的ABCB1膜囊泡［4］（總量為10 μg），其中PC組加入0.3 mmol/L的釩酸酯，調(diào)整反應溫度為37℃，作用時間為4 min。加入Mg-ATP（5 mmol/L）促使反應的開始，調(diào)整panobinostat的濃度，范圍在0~40 μmol/L。調(diào)整反應溫度為37℃，作用時間為25 min，加入5% SDS終止反應液使反應停止。于酶標儀600 nm處測量最大吸收OD值繪制相關酶活曲線，ATP酶反應活性為游離的磷酸。

1.9 計算機輔助分子對接評價PBST與ABCB1的潛在結合位點 利用ChemBioDraw Ultra 14.0和AutodockTools軟件評價PBST與P-gp底物結合空腔的結合。首先導入PBST的分子結構，使用Chem－Bio3D Ultra 14.0模塊轉(zhuǎn)換結構，使其最終為三維結構，并利用MMFF94將力場優(yōu)化。P-gp的三維結構（PDB ID：6ETI）從RCSB Protein Data Bank（www.rcsb.org）下載得到。P-gp和PBST均使用Autodock－Tools 1.5.6轉(zhuǎn)化為PDBQT格式。分子對接部分，采用Autodock vina 1.1.2軟件進行。根據(jù)P-gp原配體的位置，確定P-gp活性位點的坐標為：X-148.155，Y-150.903，Z-150.147。調(diào)整參數(shù)exhaustiveness的值為20。對接結束后，根據(jù)評分結果選取打分值最高的構象，并利用Free Meastro 11.9對結果進行分析。

1.10 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料結果以平均值±標準差（mean±SD）表示，采用單因素方差分析進行多組間比較，采用LSD-t法進行多重比較，采用用χ2檢驗進行組間比較。P＜0.05代表具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Panobinostat對腫瘤MDR細胞的增殖抑制活性顯著下調(diào) 本研究首先利用MTT法評價panobinostat對過表達ABCB1的腫瘤MDR細胞增殖活性的影響。如圖1A-1C所示，在過表達ABCB1的腫瘤MDR細胞KB-C2、SW620/Ad300、HEK293/ABCB1細胞中，panobinostat的IC50值 分 別 為0.604、0.293 7以 及0.280 6 μmol/L，高于其在親本細胞KB-3-1、SW620/Ad300以及HEK293/pcDNA3.1細胞中的IC50值。

圖1 Panobinostat在腫瘤MDR細胞和親本細胞中的增殖抑制活性曲線

2.2 ABCB1逆轉(zhuǎn)藥物上調(diào)panobinostat對腫瘤MDR細胞的增殖抑制活性 在MDR細胞KB-C2以及SW620/Ad300細胞中，以panobinostat聯(lián)合應用已報道的耐藥逆轉(zhuǎn)小分子verapamil（10 μmol/L）、ibrutinib（5 μmol/L）、nilotinib（5 μmol/L）、lapatinib（5 μmol/L）以及erlotinib（5 μmol/L）后，panobinostat對KB-C2以及SW620/Ad300細胞的IC50值較對照組（DMSO組）均顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（KB-C2：n=3，F(xiàn)=148.8，P<0.05；SW620/Ad300：n=3，F(xiàn)=221.8，P<0.05）。然而，在親本細胞KB-3-1和SW620細胞中，上述耐藥逆轉(zhuǎn)小分子并不顯著影響panobinostat的IC50值（KB-3-1：n=3，F(xiàn)=1.70，P=0.209；SW620：n=3，F(xiàn)=0.949，P=0.484）（圖2A-2B）。

圖2 ABCB1逆轉(zhuǎn)劑逆轉(zhuǎn)panobinostat耐藥

2.3 Panobinostat上調(diào)ABCB1蛋白表達水平，不改變ABCB1質(zhì)膜定位 如圖3所示，在腫瘤MDR細胞KB-C2中給予低濃度panobinostat處理，ABCB1的蛋白表達水平以時間依賴性上調(diào)。但是圖4的免疫熒光結果提示，panobinostat并不顯著改變ABCB1在腫瘤MDR細胞中的質(zhì)膜定位水平。

圖3 PBST對腫瘤MDR細胞中ABCB1蛋白表達水平的影響

圖4 PBST對腫瘤MDR細胞中ABCB1質(zhì)膜定位的影響

2.4 Panobinostat上調(diào)化療藥物在腫瘤MDR細胞中的蓄積 在腫瘤MDR細胞KB-C2中，預處理2 h的panobinostat可劑量依賴性地顯著上調(diào)氚標紫杉醇的藥物蓄積水平，并且與陽性藥物verapamil作用效果相當（n=3，F(xiàn)=21.51，P<0.05）；但在親本細胞KB-3-1中，圖示濃度的panobinostat并不顯著改變氚標紫杉醇的藥物蓄積水平，且陽性對照組verapamil也未能改變氚標紫杉醇的蓄積水平（n=3，F(xiàn)=0.465，P=0.714）（圖5A-5B）。

圖5 PBST對腫瘤MDR和親本細胞中氚標紫杉醇蓄積水平的影響

2.5 Panobinostat上調(diào)ABCB1的ATP酶活性，并與ABCB1底物結合口袋的氨基酸殘基發(fā)生相互作用在釩敏感的ATP酶活性實驗中，panobinostat可顯著上調(diào)ABCB1的ATP酶活性，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性特征（圖6A-6B）；分子對接結果顯示，panobinostat與ABCB1的親和力為-9.1 kcal/mol，并且與TYR306形成一個氫鍵相互作用、與PHE982、PHE302形成Pi-Pi相互作用、與PHE335形成Pi-cation相互作用（圖7）。

圖6 PBST上調(diào)ABCB1的ATP酶活性

圖7 分子對接模擬panobinostat與ABCB1的潛在結合位點

3 討論

腫瘤多藥耐藥是耐藥腫瘤細胞對多種其他未暴露的具有不同結構和靶點的抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性的現(xiàn)象。惡性腫瘤的多藥耐藥是臨床中多種抗腫瘤藥物治療失敗的的主要原因之一。已發(fā)現(xiàn)ATP結合盒家族的成員參與了這一過程。根據(jù)基因組序列和TMD（跨膜結構域）結構，ABC轉(zhuǎn)運蛋白超家族可分為七大類型，由于其可以導致化療藥物外排增加引起了廣泛關注。近年來，人們做出了許多努力來調(diào)節(jié)這些ABC轉(zhuǎn)運體，從而增加細胞內(nèi)藥物濃度并逆轉(zhuǎn)多藥耐藥［5-6］。ABC轉(zhuǎn)運蛋白在正常組織和腫瘤細胞中都表達，其在腫瘤細胞內(nèi)原發(fā)性表達導致原發(fā)性耐藥［7］；另外，ABC被特定結構抗腫瘤藥物誘導表達后可以導致獲得性耐藥［8］。ABCB1是第一個被鑒定的人類ABC轉(zhuǎn)運體，是一種負責調(diào)節(jié)藥物通透性的蛋白。ABCB1蛋白的過度表達預示著對抗腫瘤藥物治療的反應性降低，造成治療結果預期較差，甚至影響患者生存［9］。ABCB1可以外排化療藥物，如阿霉素、紫杉醇等，并降低細胞內(nèi)藥物水平，這是化療耐藥的主要原因之一［10］。隨著越來越多的癌癥治療靶點被研究，靶向治療在癌癥治療中廣泛興起并應用于臨床，使患者受益。部分靶向藥物仍由于ABC轉(zhuǎn)運蛋白的作用而出現(xiàn)耐藥，最終導致治療失?。?1］。因此，致力于研究調(diào)控ABC轉(zhuǎn)運蛋白克服腫瘤多藥耐藥，為抗癌靶向藥物的臨床藥效學評價和聯(lián)合用藥策略提供有力支撐。

Panobinostat是一種口服組蛋白去乙?；福℉DAC）泛抑制劑，并且是HDAC抑制劑中最強小的小分子。該藥物于2015年被FDA批準用于治療復發(fā)或難治性多發(fā)性骨髓瘤患者［12］。同時，panobinostat也進入了多種血液和實體腫瘤的臨床評價，其中部分進入了Ⅰ期或Ⅱ期臨床試驗，如與西羅莫司聯(lián)合治療前列腺癌、三陰性乳腺癌、霍奇金淋巴瘤和皮膚T細胞淋巴瘤、骨髓增生異常綜合征［13］。相關研究報道了panobinostat的耐藥發(fā)生的原因。研究表明，panobinostat應用于治療急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）出現(xiàn)耐藥可能是由于HO-1的水平受低表達GFI-1基因的影響［14］。同時，CXCR-4介導的panobinostat的耐藥可通過mTOR抑制劑everolimus抑制P21被逆轉(zhuǎn)，間接提示mTOR信號轉(zhuǎn)導途徑的激活和CXCR4在panobinostat耐藥中的關鍵作用［15］。然而對于ABC轉(zhuǎn)運蛋白與panobinostat耐藥的關系，仍沒有相關的研究闡明機制。本研究針對上述科學問題，以經(jīng)典的腫瘤多藥耐藥細胞為模型，深入探究ABCB1介導的panobinostat耐藥的機制。

將Panobinostat同時作用于親本細胞和過表達ABCB1的人類口腔上皮細胞癌KB-C2細胞中發(fā)現(xiàn)，對親本細胞作用明顯強于過表達ABCB1的人類口腔上皮細胞癌KB-C2細胞。另外，研究panobinostat對人類結腸癌細胞SW620/Ad300耐藥細胞的增殖抑制作用，實驗發(fā)現(xiàn)，panobinostat抑制細胞增殖的能力被顯著削弱。因此，推斷panobinostat耐藥性的發(fā)生可能是由于ABCB1轉(zhuǎn)運蛋白的過表達。進一步研究panobinostat在轉(zhuǎn)染ABCB1全長基因的人類胚胎腎細胞HEK293（HEK293/ABCB1）和親本細胞中的增殖抑制活性有明顯差異，發(fā)現(xiàn)panobinostat在親本細胞中抑制增殖的能力更強，這一實驗結果驗證了筆者的假設：即panobinostat的耐藥是ABCB1的過表達介導的。

近十年來，越來越多的小分子抑制劑被研究證明具有逆轉(zhuǎn)ABCB1轉(zhuǎn)運蛋白介導的腫瘤MDR的活性，如verapamil［16］以及部分靶向藥物，如ibrutinib、nilotinib、lapatinib和erlotinib［17-19］。在本研究中，上述小分子聯(lián)合panobinostat均可顯著增加panobinostat在腫瘤MDR細胞中的增殖抑制活性，證明ABCB1介導panobinostat耐藥。

盡管上述結果提示ABCB1是介導panobinostat耐藥的關鍵蛋白，但其導致耐藥的機制仍不清楚，有待于進一步研究。因此，本研究進一步評價panobinostat對ABCB1轉(zhuǎn)運蛋白表達水平的影響。Western blot結果提示，panobinostat可顯著增加KBC2細胞中ABCB1的表達水平，且這種作用呈現(xiàn)時間依賴性。這說明，ABCB1介導panobinostat的治療抵抗很大可能是通過上調(diào)ABC轉(zhuǎn)運蛋白的表達水平。但是，panobinostat介導ABC轉(zhuǎn)運蛋白表達水平的上調(diào)的具體機制是未知的，這可能涉及一些關鍵信號通路蛋白的參與。研究表明，部分抗腫瘤藥物可通過激活ABCB1的啟動子和增強子元件介導其過度表達［20］，panobinostat是否也通過這一機制調(diào)控ABCB1的表達上調(diào)？進一步的研究會解決這些問題。此外，ABCB1在轉(zhuǎn)錄后通過翻譯后修飾定位于細胞膜，從而發(fā)揮其耐藥泵的作用。因此，上調(diào)ABCB1在腫瘤細胞膜的豐度是panobinostat耐藥的另一潛在因素。但是通過免疫熒光實驗，并未發(fā)現(xiàn)panobinostat可顯著改變ABCB1在腫瘤MDR細胞中的定位。

ABCB1介導的腫瘤MDR有多種特征，其中最顯著的特征之一是導致抗腫瘤藥物蓄積水平發(fā)生改變［5］。ABC轉(zhuǎn)運蛋白可以將抗腫瘤藥物外排，導致其在腫瘤細胞中蓄積水平降低，進而導致藥物無法發(fā)揮特定的療效而導致化療失敗。

紫杉醇是ABCB1的作用底物，可通過ABCB1的外排作用泵出細胞。因此，本部分研究以氚標紫杉醇為探針，探究panobinostat作用于ABCB1過表達腫瘤MDR細胞中對蓄積水平的影響，進而間接評價ABCB1對panobinostat的蓄積水平的影響。結果顯示，不同濃度的panobinostat可顯著上調(diào)氚標紫杉醇在腫瘤MDR細胞KB-C2中的蓄積水平，表明panobinostat可在底物結合空腔內(nèi)特異性結合ABCB1底物，導致紫杉醇的結合位點被占據(jù)，從而增加氚標記紫杉醇在細胞內(nèi)的積累水平。這部分結果揭示了ABCB1介導panobinostat耐藥的具體機制及過程。

上述結果表明，panobinostat很有可能是ABCB1的特異性底物。由于ABC轉(zhuǎn)運體的核苷結合域具有ATP酶活性，可以通過水解ATP高能磷酸鍵獲得能量，達到轉(zhuǎn)運底物的目的。因此筆者推測Panobinostat可能對ABCB1的ATP酶活性有一定的影響。在本文釩敏感的ATP酶活性探究中，panobinostat可顯著激活體外ABCB1的ATP酶活性，這與研究報道的大部分ABC轉(zhuǎn)運蛋白底物的特征一致。計算機輔助分子對接結果表明，panobinostat可與ABCB1底物結合口袋的部分氨基酸殘基以共價結合方式發(fā)生相互作用。綜上，提示panobinostat是ABCB1的特異性底物。

Panobinostat作為FDA批準的最強效HDAC抑制劑，在多發(fā)性骨髓瘤中應用較為成熟，但臨床研究表明，其在其他腫瘤中的應用的敏感性和有效性卻受到了限制，耐藥性是阻礙panobinostat進一步臨床開發(fā)的重要障礙。在本研究中，筆者首次發(fā)現(xiàn)并闡明ABCB1介導panobinostat在腫瘤細胞中耐藥的作用及分子機制，這將為panobinostat在臨床的進一步應用提供有力的線索。誠然，由于腫瘤異質(zhì)性等多方面因素的影響，造成了腫瘤耐藥發(fā)生的機制十分復雜。ABCB1的過表達是否會影響應用panobinostat患者的預后，亟待通過進一步的臨床試驗驗證。此外，本研究中發(fā)現(xiàn)panobinostat可上調(diào)ABCB1的表達水平，其潛在機制仍需進一步的分子生物學途徑探究。