楊嫻，遲愛秋，范思佳，張偉龍，張琪玟，唐天珍，王佳慧，張青，武藝笑，饒建，林社裕***

(1 南通大學生命科學學院，南通 226019；2 復旦大學上海醫(yī)學院；3 廣西大學生命科學與技術學院；4 南通大學附屬醫(yī)院神經(jīng)外科)

膠質瘤是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)膠質細胞引起的原發(fā)性腫瘤，神經(jīng)膠質細胞分為3 種類型：星形膠質細胞、少突膠質細胞和小膠質細胞，其中由星形膠質細胞引發(fā)的膠質瘤稱為星形細胞瘤。膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)是所有膠質瘤中最具侵襲性的一種類型[1]。惡性GBM 具有高度的增殖性和侵襲性，盡管手術、放療和化療在不斷地改進，但預后依然較差，5 年生存率＜5%[2]。與其他腫瘤相比，膠質瘤可分泌多種分子，促進腫瘤的生長和增殖，這種對細胞凋亡和增殖的固有抵抗可能是膠質瘤患者預后差的主要原因[3-5]。因此，膠質瘤患者迫切需要新的治療方案。

TOB1 是抗增殖蛋白家族的成員，在轉錄和mRNA衰減中起重要作用[6]。TOB1 的亞細胞定位表明，其分布在細胞質并通過細胞核與細胞質的穿梭作用抑制細胞增殖[7]。在乳腺癌中，TOB1 可抑制腫瘤發(fā)生，并可作為淋巴結陰性乳腺癌預后不良的標志物[8]。此外，TOB1 可通過激活Smad4 和抑制β-catenin 信號通路誘導胃癌細胞凋亡，抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲[9]。然而，在膠質瘤中，TOB1 基因是否仍具有抑瘤作用，是否促進細胞凋亡，抑制細胞增殖尚不清楚。

微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一種短的、非編碼的基因表達調控RNA，通過與特定靶mRNA 序列的3'-非翻譯區(qū)(3'-untranslated region,3'-UTR)結合，在轉錄后水平調控基因表達[10]。MiRNAs 已被報道參與了腫瘤的生長、增殖或凋亡[11]。

促凋亡還是抗凋亡由BCL-2 家族蛋白之間的平衡決定，該家族的抗凋亡成員包括BCL-2(BCL2 apoptosis regulator)、BCL-xl(BCL2 like 1)、BCL-W(BCL2 like 2)、MCL-1(MCL1 apoptosis regulator)和BFL-1(BCL2 related protein A1)，這些蛋白通過與促凋亡蛋白相互作用來抑制凋亡[12-13]。

本研究探討TOB1 對膠質瘤細胞活力、細胞周期和凋亡的影響，旨為膠質瘤的診斷和治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑和樣本 收集南通大學附屬醫(yī)院神經(jīng)膠質瘤樣本15 例及成人顱腦損傷需部分切除腦組織以降低顱內壓的患者組織標本10 例。所有人體樣本均按照南通大學附屬醫(yī)院機構評審委員會制定的政策使用。細胞培養(yǎng)相關試劑購自Thermo Scientific 公司(上海,中國)。U251 細胞株購自中國科學院細胞庫。細胞周期分析、細胞活力檢測和蛋白提取的試劑盒購自中國海門碧云天生物技術研究所。兔抗人TOB1 多克隆抗體購自LifeSpan BioSciences 公司(西雅圖,美國)、兔抗磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)多克隆抗體購自武漢博士德生物科技有限公司(武漢,中國)。辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG 二抗購自KPL 公司(切斯特,美國)。

1.2 免疫組織化學 腦組織用預冷甲醇固定，然后乙醇梯度脫水、石蠟包埋、切片。緩沖液阻斷?？谷薚OB1 兔多克隆抗體、兔抗人BCL-2 或BCL-xl 單克隆抗體孵育。磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌后，與生物素化的二抗反應(博士德,武漢,中國)，并用SABC 試劑盒檢測，蘇木精復染，樹脂封片。

1.3 靶向TOB1 基因的miRNA 測定 利用在線軟件TarBase V7.0、miRTarbase 及TargetScan 預測靶向TOB1 的可能miRNA，這3 個軟件預測的原理是依據(jù)實驗或種子區(qū)保守位點進行搜索。將U251 細胞以1×105細胞/mL 的密度接種到6 cm 培養(yǎng)皿中。當細胞融合度達到80%時，分別轉染miR-25-3p、miR-32-5p 和miR-92a-5p，48 h 后，用RIPA 裂解緩沖液提取總蛋白，Western Blot 檢測蛋白表達。

1.4 熒光素酶報告基因系統(tǒng)確認TOB1 為miR-92a-3p 的靶基因 基因TOB1 3'-UTR 中miR-92a-3p 的互補序列被擴增，并在BamHⅠ及SalⅠ酶切位點處克隆到pGL3-Promoter 載體中。然后，將U251細胞以3×105細胞/mL 的密度將接種于6 孔板。24 h后，分別轉染TOB1 3'-UTR 質粒，TOB1 3'-UTR 突變質粒及pGL3-Promoter 質粒(陰性對照)。同時，這些細胞共轉染miR-92a-3p mimic。48 h 后，收集細胞，用熒光素酶檢測試劑盒檢測，酶標儀檢測熒光強度。

1.5 細胞培養(yǎng)與感染 人膠質瘤細胞株U251 用杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle medium,DMEM)培養(yǎng)。當細胞生長到聚合度達70%～90%時，換為無血清培養(yǎng)基，并進行感染實驗，感染病毒分別為TOB1 過表達慢病毒、TOB1 干擾慢病毒及對照慢病毒。

1.6 Western Blot 采用RIPA 裂解緩沖液提取蛋白，BCA 檢測試劑盒對蛋白進行定量，然后電泳，并轉移到Whatman 硝酸纖維素膜上。與一抗反應過夜，二抗反應4 h，最后用ECL 化學發(fā)光試劑進行顯影檢測。

1.7 U251 細胞活力的測定 采用噻唑藍比色法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)檢測TOB1 對膠質瘤細胞U251 活力的影響。將U251 孵育24 h 后，加入MTT(5 mg/mL)，再孵育4 h。加入二甲亞砜150 μL/孔以溶解晶體。用酶標儀在570 nm 波長處檢測光密度(optical density,OD)值。

1.8 U251 細胞周期測定 采用流式細胞術分析TOB1 對膠質瘤細胞U251 細胞周期的影響。首先用胰蛋白酶消化細胞，PBS 洗滌碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色，流式細胞儀檢測細胞周期。

1.9 U251 細胞凋亡測定 采用流式細胞儀分析U251 細胞凋亡情況。收集U251 細胞，分別加入5 μL PE Annexin V 和5 mL 7-AAD。然后每管加入400 μL 1×結合緩沖液，混勻，立即進行流式細胞儀分析。

1.10 實時聚合酶鏈式反應(real time polymerase chain reaction,Real-time PCR)分析 采用Trizol 試劑提取總RNA，逆轉錄得到cDNA，并利用ABI PRISM 7500 系統(tǒng)進行Real-time PCR 擴增凋亡相關因子BCL-2、BCL-xl 等。

1.11 統(tǒng)計學方法 利用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析，雙熒光素酶報告基因檢測、細胞活力、增殖指數(shù)、凋亡檢測及凋亡因子Real-time PCR 的分析采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，免疫組化實驗灰度值統(tǒng)計分析采用Student t 檢驗。數(shù)值用表示，雙尾P 值，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TOB1 在膠質瘤組織中的表達受到抑制 免疫組化分析結果顯示，與正常腦組織相比，腦膠質瘤組織中TOB1 基因的表達受到抑制(P＜0.05)(圖1)。

圖1 腦膠質瘤中TOB1 表達受到抑制

2.2 靶向TOB1 的miRNA 檢測 對在線軟件預測的miRNA 進行Real-time PCR 檢測，初步篩選結果發(fā)現(xiàn)靶向TOB1 的可能miRNA 包括miR-25-3p、miR-32-5p 和miR-92a-3p。這些miRNA 由Genepharma Inc.合成，并轉染到U251 細胞株中。通過Western Blot 檢測TOB1 的表達情況，結果表明，miR-25-3p、miR-32-5p 和miR-92a-3p 均能調控TOB1 基因的表達，其中miR-92a-3p 的作用最強(圖2A)。

構建含有TOB1 的3'-UTR 的熒光素酶報告分析載體(TOB1-3'-UTR)和相應的含有TOB1 的3'-UTR 突變的載體(TOB1-3'-UTR 突變)(圖2B)。這些質粒包括pGL-3-promoter 質粒(陰性對照)分別與miR-92a-3p mimics 共轉染U251 細胞。分析結果顯示，與陰性對照及TOB1-3'-UTR 突變組相比，TOB1-3'-UTR 組的熒光素酶相對活性顯著降低(P＜0.01)(圖2C)。這些結果表明，miR-92a-3p 可以通過直接結合TOB1 基因的3'-UTR 調控TOB1 的表達。

圖2 靶向TOB1 的miRNA 表達分析，并確認miR-92a-3p與TOB1 3'-UTR 的相互作用

2.3 基因TOB1 與細胞行為學的關系分析 將U251 細胞分別感染對照慢病毒(對照組)、TOB1 過表達慢病毒(過表達組)和TOB1 siRNA 慢病毒(干擾組)。感染后72 h，Western Blot 結果顯示，過表達組的TOB1 蛋白水平顯著高于對照組(P＜0.05)；干擾組的TOB1 蛋白水平顯著低于對照組(P＜0.05)(圖3A)。然后對3 個穩(wěn)轉細胞系進行MTT 檢測，結果表明：過表達組的U251 細胞活力明顯低于對照組(P＜0.05)；干擾組U251 細胞活力顯著高于對照組(P＜0.05)(圖3B)。細胞周期分析顯示，過表達組PI 顯著低于干擾組(P＜0.05)(圖3C)。流式細胞術結果顯示，過表達組的凋亡細胞比例顯著高于對照組；干擾組的凋亡細胞比例顯著低于對照組(P＜0.05)(圖3D)。這些結果提示基因TOB1 可以通過降低U251 細胞活力，減少U251 細胞分裂，促進U251 細胞的凋亡，進而抑制U251 細胞的生長。

圖3 TOB1 對U251 細胞行為的影響

2.4 TOB1 對凋亡相關因子表達的影響 采用Realtime PCR 法檢測3 組細胞中凋亡相關因子的表達情況，結果顯示，過表達組BCL-2 表達水平顯著低于對照組，干擾組BCL-2 表達水平顯著高于對照組(均P＜0.05)；BCL-xl 的表達趨勢與BCL-2 相同(P＜0.05)，而其他凋亡相關因子表達情況說明其不受基因TOB1 的調控(圖4)。

圖4 Real-time PCR 分析TOB1 對凋亡相關因子表達的影響(*P＜0.05)

2.5 在膠質瘤組織中驗證TOB1 調控BCL-xl 和BCL-2 Western Blot 結果顯示，BCL-xl 和BCL-2的蛋白表達與mRNA 水平的變化趨勢相同(圖5A)。免疫組化分析結果顯示，正常腦組織中BCL-2 和BCL-xl 水平顯著低于膠質瘤組織(圖5B～C)。提示BCL-2 和BCL-xl 參與TOB1 抑制細胞增殖和促進細胞凋亡的過程。

圖5 TOB1 對凋亡相關因子BCL-2、BCL-xl 表達的影響

3 討論

為探索基因TOB1 在膠質瘤中的作用，本研究檢測了TOB1 在膠質瘤和正常腦組織中的表達情況，結果顯示TOB1 在膠質瘤組織中的表達下調。那么，TOB1 的下調是否與膠質瘤的生長和增殖有關呢？為此，選擇U251 細胞株作為膠質瘤的細胞模型，通過構建TOB1 的過表達或干擾組，檢測不同模型組的細胞活力、細胞周期和凋亡情況，進而確定基因TOB1與膠質瘤的增殖相關性。結果表明，基因TOB1 可降低細胞活力，增加細胞凋亡率。因此，TOB1 在腦膠質瘤中具有抑瘤作用，該發(fā)現(xiàn)與之前發(fā)現(xiàn)的TOB1 在其他癌癥[14-15]中的作用相一致。

為了探索基因TOB1 下調的原因，本研究分析了多個可能的miRNA，結果表明miR-92a-3p 是最有可能的miRNA。MiR-92a-3p 可以刺激腫瘤相關的巨噬細胞分泌白細胞介素6，并進而導致脂肪肉瘤細胞增殖、侵襲和轉移[16]。在膠質瘤中，miR-92a-3p 表達上調，抑制基因Bim 的表達，被認為是癌基因[17]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-92-3p 通過結合TOB1 基因的3'UTR 區(qū)域，降低了基因TOB1 的表達。還證實了基因TOB1 可以通過促進U251 細胞的凋亡來抑制增殖，但是詳細的促進細胞凋亡的機制仍不清楚。為此，通過Western Blot 和Real-time PCR 檢測了不同處理組U251 細胞中9 種凋亡相關因子。結果表明，抗凋亡因子BCL-2 和BCL-xl 的變化與基因TOB1的變化密切相關。當TOB1 基因上調時，BCL-2 和BCL-xl 的表達顯著降低，反之亦然。說明TOB1 通過下調抗凋亡因子來促進膠質瘤細胞的凋亡，此外，膠質瘤組織中的免疫組化也提示BCL-2 和BCL-xl 參與了TOB1 基因誘導的細胞凋亡。

BCL-2，抗凋亡因子，通過增加突變細胞的生存，促進了癌癥的形成和發(fā)展。事實上，BCL-2 還可以通過其具有的線粒體促凋亡BCL-2 家族成員的BCL-2 同源(BH)結構域3(BH3)對細胞周期發(fā)揮抑制作用。在內質網(wǎng)，BCL-2 可以調節(jié)Ca2+信號變化，促進細胞增殖，同時增加對凋亡的抵抗作用[18]。根據(jù)本研究結果，推測TOB1 誘導的BCL-2 基因的表達調控主要位于線粒體，抗凋亡蛋白BCL-2 表達于線粒體外壁，通過控制線粒體的通透性來調節(jié)細胞的凋亡。通常，BCL-2 與促凋亡蛋白，如Bax，形成異二聚體，抑制細胞色素C 釋放，調節(jié)線粒體跨膜電位，發(fā)揮其抗凋亡作用[19]。

BCL-xl 作為一種抗凋亡蛋白，可以阻止細胞色素C 釋放到細胞質中，從而抑制細胞凋亡，促進細胞增殖[20]。抗凋亡因子家族BCL-2 的成員BCL-xl 在結構上與Bax 相似，然而，它可以降低膜的滲透性，通過干擾復合物的形成，降低跨膜通道的形成。本研究發(fā)現(xiàn)，TOB1 表達上調時，BCL-xl 的表達顯著下調，從而引發(fā)一系列凋亡相關事件，實現(xiàn)了TOB1 誘導的細胞凋亡。

綜上所述，在膠質瘤中，TOB1 是一個腫瘤抑制基因，其表達可能受到miR-92a-3p 的調控而下調，TOB1 可以促進膠質瘤細胞的凋亡，進而抑制其增殖。當然，TOB1 在膠質瘤中的更詳細的作用機制仍需要進一步的研究。