榮 華，楊石坤，杜有家，豆騰飛，黃 英，武祥偉，史慶超，王曉雯

(1 云南農業(yè)大學 a 動物科學技術學院，b 云南省高校高原漁業(yè)資源保護與可持續(xù)利用重點試驗室，云南 昆明 650201；2 內江師范學院 長江上游魚類資源保護與利用四川省重點試驗室，四川 內江641112)

魚膠(魚鰾的干制品)富含膠原蛋白，營養(yǎng)價值極高，與燕窩、魚翅齊名，系“海洋八珍”之一，有“海洋人參”之美譽[1]。近年來，隨著人們對魚膠營養(yǎng)和保健價值的認識，市場上對高品質魚膠的需求日益旺盛，據不完全統(tǒng)計，2019 年全國魚膠產量7 423 t，產值近200 億元。淺色黃姑魚(Nibeacoibor)俗稱白奈，是我國東南沿海地區(qū)用于生產名貴魚膠——白花膠的重要海水養(yǎng)殖品種[2]，開展淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白代謝相關研究，對提高魚膠產量和品質具有重要意義。有學者發(fā)現，在飼料中添加蠶豆[3]、杜仲[4]、脯氨酸[5-7]和羥脯氨酸(Hyp)[8]可以促進魚類膠原蛋白沉積。筆者前期研究也發(fā)現，Hyp可以促進淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白的沉積[9-10]，但對其分子機理缺乏深入探討。

轉化生長因子β(TGF-β)是一種調節(jié)細胞生長、分化和增殖的多功能細胞因子，對間充質細胞的主要作用是刺激細胞外基質的沉積。此外，TGF-β還可誘導肌成纖維細胞分化，上調Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅹ型膠原蛋白基因的表達，促進細胞外基質膠原蛋白沉積[11]。轉化生長因子細胞信號通路(TGF-β/Smads)作為調控膠原蛋白代謝的經典途徑，主要參與細胞外基質膠原蛋白的沉積[11-13]。然而，TGF-β/Smads信號通路在魚類膠原蛋白代謝中的作用鮮有研究報道。有研究表明，積雪草皂苷[14]、β-拉帕醌[15]和氧化苦參堿[16-18]等干擾劑可以作用于TGF-β/Smads通路中特定配體，導致整個信號通路效應發(fā)生變化，致使機體合成膠原蛋白的能力發(fā)生變化。Wu等[19]發(fā)現，氧化苦參堿可通過抑制TGF-β1、細胞信號轉導分子3(Smad3)等的表達，對CC4誘導的大鼠肝纖維化具有明顯的拮抗作用。4-(1-(2-(2-芐基吡咯烷-1-基)-5-氯煙酰胺)環(huán)丙基)苯甲酸甲酯(SIS3)是一種新型的TGF-β/Smads信號通路抑制劑，主要特異抑制Smad3，在醫(yī)學上應用廣泛[20]。Matsubara等[21]發(fā)現，SIS3處理的肝細胞對TGF-β、腫瘤壞死因子(TNF-α)的響應降低，從而減弱肝細胞的纖維化。SIS3可以抑制心肌成纖維細胞的分化和膠原蛋白的生成[22-23]。筆者前期研究發(fā)現，TGF-β/Smads是參與脯氨酸促進黃姑魚魚鰾膠原蛋白沉積調控的重要途徑[7]，但其是否也參與調控Hyp促進黃姑魚魚鰾膠原蛋白沉積尚未可知。為此，本試驗用Hyp促進淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白沉積，然后利用氧化苦參堿和SIS3對TGF-β/Smads通路進行抑制，比較抑制與否對淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白含量的影響，探討TGF-β/Smads通路在Hyp促膠原蛋白沉積過程中的作用，為膠原蛋白代謝的營養(yǎng)調控提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材 料

SIS3，分子式為C28H28ClN3O3，購于MedChemExpress(MCE)公司(中國，上海)。氧化苦參堿，分子式為C15H24N2O2，購于MedChemExpress(MCE)公司。Hyp含量測定試劑盒(Art.No.A030-2；南京建成生物工程研究所)。TransScript?One-Step gDNA Removal和cDNA Synthesis Super-Mix Kit(Trans Gen生物技術，北京)。SYBR Premix ExTaqⅡ試劑盒(Takara，大連)。丁香酚溶液(阿拉丁試劑有限公司，中國)。主要儀器有Infinite?Pro 200酶標儀(Tecan、瑞士)、Nanodrop?ND-2000分光光度計(Thermo Scientific NanoDrop,USA)、Roche Light Cycler?480 System實時熒光定量PCR(RT-qPCR)儀(Roche，瑞士)。

1.2 飼料配制

根據文獻[9]配制Hyp空白組和Hyp添加組飼料(表1)。

表1 試驗飼料配方及養(yǎng)分含量(風干基礎)Table 1 Formulation and nutrient contents of the experimental diets(air-dry basis) g/kg

Hyp空白組不額外添加Hyp，Hyp添加組添加9.70 g/kgL-羥脯氨酸，用丙氨酸來平衡飼料中的氮，參考美國國家科學研究委員會(NRC，2011)中大黃魚的營養(yǎng)需求設計其他營養(yǎng)成分的含量[24]。飼料中氨基酸組成見表2。飼料原料過0.42 mm篩，經充分混合，用2.5 mm直徑的膨化機制粒，在自然通風環(huán)境中風干。干顆粒飼料被密封在塑料袋里于-20 ℃存儲備用。

表2 試驗飼料的氨基酸組成(以干物質計) Table 2 Amino acid composition of experimental diets μmol/g

1.3 試驗設計

養(yǎng)殖試驗在廣東省汕頭市南澳縣汕頭大學海洋生物臨海試驗站進行。淺色黃姑魚購自當地某苗種孵化場。幼魚購回后，在一個大的浮動網箱(長×寬×深=3 m×3 m×2 m，)暫養(yǎng)2周，期間投喂揭陽通威股份有限公司生產的商業(yè)飼料(粗蛋白40.0%，粗脂肪10.0%)。試驗前，試驗魚先禁食24 h，用40 mg/L丁香酚溶液麻醉后稱體質量并分組。300尾試驗魚(體質量(11.621±0.154) g/尾)被隨機分為4組(Hyp空白組、Hyp添加組、SIS3干擾組、氧化苦參堿干擾組)，每組3個重復，每重復25尾魚(在長×寬×深 = 1 m×1 m×1.5 m的網箱中養(yǎng)殖)。

在為期8周的養(yǎng)殖試驗中，Hyp空白組試驗魚飼喂不添加Hyp的日糧，其他3組試驗魚均飼喂添加Hyp的日糧，SIS3、氧化苦參堿干擾組試驗魚在4周后腹腔注射SIS3和氧化苦參堿注射液進行干擾試驗，每周注射1次，直至試驗結束。為了消除注射應激及SIS3、氧化苦參堿注射液中溶劑dimethysulfoxide(DMSO)對魚體基礎代謝的影響，減少試驗系統(tǒng)誤差，Hyp空白組和Hyp添加組試驗魚注射等量的DMSO注射液。試驗期間，每天人工飽食投餌2次(07:00和16:30)，記錄好飼料投喂量。觀察記錄魚的健康狀況及環(huán)境變化等，在試驗過程中，溫度23～30 ℃，pH值7.8～8.1，氨氮質量濃度低于0.05 mg/L，鹽度31～33 g/L，溶解氧5.2～6.0 mg/L。

因溶劑內含有DMSO，一定濃度的DMSO對魚體有毒副作用，所以參考SIS3[20]和氧化苦參堿的給藥量[19,25-27]并結合預試驗結果(試驗魚腹腔注射液體100 μL/尾無死亡)，確定SIS3和氧化苦參堿的稀釋質量濃度及注射方案如下：(1)SIS3注射液。將SIS3用DMSO配成20 mg/mL的儲存液，-20 ℃儲存1個月，使用前利用生理鹽水稀釋成1 mg/mL注射液進行腹腔注射。按照100 μL/尾給藥，當時魚體質量約50 g，給藥量為2 mg/kg。(2)氧化苦參堿注射液。在超聲輔助下，將氧化苦參堿用DMSO配制成100 mg/mL儲存液，并按照上述方案稀釋成5 mg/mL注射液。按照100 μL/尾給藥，當時魚體質量約50 g，給藥量10 mg/kg。(3)DMSO注射液。將DMSO溶液用生理鹽水按1∶20體積比稀釋成注射液，參照SIS3和氧化苦參堿的給藥量確定注射量(100 μL/尾)。

1.4 樣品采集

養(yǎng)殖試驗結束后，停食24 h，采用100 mg/L丁香酚麻醉，稱體質量，計算魚的生長和飼料利用率。每個重復隨機選取6尾試驗魚，測量個體體質量、體長，計算肥滿度等；取魚鰾用于膠原蛋白含量的測定。每個重復隨機選取6尾試驗魚，采集其肝臟(右側)，分成小塊(1 cm×1 cm)固定于Bouin’s液中，用于組織切片觀察。

此外，每個重復隨機選取4尾試驗魚，采集魚鰾組織樣本，快速收集好后立即浸入液氮，隨后儲存在-80 ℃，用于總RNA的提取。

1.5 生長性能測定

根據飼養(yǎng)試驗中測定的魚體質量、體長、飼料消耗等指標，計算特定生長率(SGR)、飼料系數(FC)、鰾體比(SBSI) 、存活率(SR)、肥滿度(CF) ：

SGR(%/d)=[(ln FBW-ln IBW)/t]×100，

FC=FI/(FBW-IBW)，

SBSI=SBW/BW×100%，

SR=FFN/IFN×100%，

CF(g/cm3)=BW/BL3。

式中：FBW和IBW分別代表試驗魚的終末體質量和初始體質量(g)，t為試驗時間(d)，FI代表采食量(g)，SBW代表魚鰾重(g)，BW代表魚體質量(g)，FFN代表終末魚數，IFN代表初始魚數，BL代表體長(cm)。

1.6 魚鰾膠原蛋白含量測定

用Hyp含量測定試劑盒測定魚鰾中的膠原蛋白含量，具體操作方法參考試劑盒說明書進行，使用Infinite?Pro 200酶標儀在550 nm波長下測定試驗樣品和標準品(試劑盒自帶)的吸光度(OD550)，利用標準品的OD550與給定濃度繪制標準曲線，試算試驗樣品中Hyp含量。膠原蛋白的含量由Hyp的含量乘以8估算得到[10]。

1.7 肝臟組織形態(tài)學檢測

肝臟組織形態(tài)學檢測在武漢賽維爾生物科技有限公司協(xié)助下完成，試驗步驟簡介如下：1)將新鮮的組織樣品固定于體積分數4%多聚甲醛24 h以上；2)用體積分數75%酒精-無水乙醇按梯度脫水6 h；3)使用二甲苯取代酒精透明2次，每次10 min；4)在溫箱中，將已透明的組織塊放入加熱融解的石蠟中，浸蠟3次，每次1 h；5)將浸好蠟的組織于包埋機內進行包埋后，使用輪轉式石蠟切片機對包埋好的組織進行切片，切片厚度控制在5～6 μm；6)將切片烤干，HE染色后，脫水封片，最后進行顯微鏡鏡檢，采集圖像分析。

1.8 膠原蛋白代謝相關基因及TGF-β/Smads通路關鍵基因的表達分析

魚鰾組織總RNA根據Trizol (InvitrogenTM)試劑說明書，使用氯仿-異丙醇法提取，通過1.2%瓊脂糖凝膠分析確定其完整性和質量，利用Nanodrop?ND-2000分光光度計于260和280 nm處測定吸光度(OD260、OD280)，計算OD260/OD280，確定RNA的最終濃度。使用TransScript?One-Step gDNA Removal和cDNA Synthesis Super-Mix Kit試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

對膠原蛋白代謝相關基因Ⅰ型膠原蛋白α1(COL1A1)、COL1A2、Ⅰ型脯氨酸羥化酶(P4Hα(Ⅰ))、P4Hα(Ⅱ)、P4Hα(Ⅲ)及TGF-β/Smads通路關鍵基因TGF-β、轉化生長因子受體(TGF-βRT)Smad2、Smad3、Smad4和Smad7進行實時熒光定量PCR(RT-qPCR)表達分析，以β-actin為管家基因。根據大黃魚(Larimichthyscrocea)、鱸魚(Micropterussalmoides)和鱖魚(Sinipercachuatsi)等的膠原蛋白代謝相關基因的核心序列保守區(qū)，利用Primer Premier 5.0軟件(USA)設計其特異性引物(表3)，交由華大基因(深圳)合成。

表3 膠原蛋白代謝相關基因的RT-PCR引物序列Table 3 Sequences of real-time PCR primers for genes of collagen metabolism

表3(續(xù)) ContinuedTable 3

使用SYBR Premix ExTaqⅡ試劑盒配制RT-qPCR反應體系(20 μL)，在Roche Light Cycler?480 System RT-qPCR儀上進行反應。使用2-ΔΔCt法[28]計算基因相對表達量。使用倍數變化(fold change)法將基因相對表達量換算成倍數變化進行繪圖。

1.9 數據統(tǒng)計與分析

所有數據均采用SPSS 20.0程序(SPSS,Inc.，Chicago， IL，USA)進行單因素方差分析(ANOVA)，并采用Tukey進行組間顯著性檢驗。數據以“平均值±標準誤”(n=3)呈現，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 Hyp及干擾劑對淺色黃姑魚生長的影響

由表4可知， Hyp添加組試驗魚的特定生長率(SGR)顯著高于Hyp空白組(P<0.05)，其余組間差異不顯著；其他指標在4個組間均無顯著差異(P>0.05)。結果表明，飼料中添加Hyp能顯著促進淺色黃姑魚的生長；注射干擾劑SIS3和氧化苦參堿對試驗魚生長無顯著影響(P>0.05)。

2.2 Hyp及干擾劑對淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白沉積的影響

Hyp和TGF-β/Smads通路抑制劑對淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白含量的影響見圖1。

圖柱上標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05)圖1 Hyp和TGF-β/Smads通路抑制劑對淺色黃姑魚 魚鰾膠原蛋白含量的影響Fig.1 Effect of Hyp and TGF-β/Smads pathway inhibitors on collagen content in swim bladder of Nibea coibor

由圖1可知， Hyp添加組試驗魚魚鰾膠原蛋白含量顯著高于Hyp空白組(P<0.05)，表明飼料中添加Hyp對魚鰾膠原蛋白沉積具有顯著的促進作用；SIS3干擾組魚鰾膠原蛋白含量顯著低于Hyp添加組(P<0.05)；氧化苦參堿干擾組膠原蛋白含量低于Hyp添加組，但二者差異不顯著(P>0.05)。結果表明，抑制TGF-β/Smads通路可降低淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白的沉積；與SIS3相比，氧化苦參堿的抑制效果稍差。

2.3 DMSO對淺色黃姑魚肝臟組織結構的影響

試驗結果(圖2)顯示，各試驗組肝臟組織結構完整，細胞排列緊密，胞質界限分明且細胞數量較多，無病理性現象，表明在本試驗條件下DMSO對淺色黃姑魚健康無不良影響。

2.4 Hyp及干擾劑對淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白代謝相關基因表達的影響

Hyp及干擾劑對淺色黃姑魚魚鰾中膠原蛋白代謝相關基因表達水平的影響見圖3。

A～D分別為Hyp空白組、addition Hyp添加組、SIS3干擾組和氧化苦參堿干擾組 A-D indicate Hyp blank group,Hyp addition group,SIS3 interference group and oxymatrine interference group,respectively圖2 DMSO對淺色黃姑魚肝臟組織結構的影響Fig.2 Effect of DMSO on liver tissue structure of Nibea coibor

以Hyp空白組(對照組)為基線(橫軸)，Y軸上的數據大于0表示與對照組相比表達上調，具體數據代表上調的倍數； 數據小于0表示表達與對照組相比下調，具體數據的絕對值代表下調的倍數。圖柱上標注*表示與Hyp空白組差異顯著(P<0.05) Taking the Hyp blank group (control group) as the baseline (horizontal axis),a value greater than 0 on the Y-axis indicates that the expression is up-regulated and the specific value represents the fold of the up-regulation.On the contrary,less than 0 means down-regulation,and the absolute value represents the fold of down-regulation.* indicates significant differences compared with the Hyp blank group (P<0.05)圖3 Hyp及干擾劑對淺色黃姑魚魚鰾中膠原蛋白代謝相關基因表達水平的影響Fig.3 Effects of Hyp and inhibitors on expression levels of collagen-metabolism-related genes in swim bladder of Nibea coibor

由圖3可知，Hyp添加組魚COL1A1和COL1A2相對表達量均顯著高于Hyp空白組(P<0.05)，說明飼料中添加Hyp可上調COL1A1和COL1A2基因的表達；SIS3和氧化苦參堿干擾組COL1A1和COL1A2基因表達量顯著低于Hyp添加組(P<0.05)，說明抑制TGF-β/Smads通路可顯著下調淺色黃姑魚魚鰾中COL1A1和COL1A2基因的表達。Hyp添加組、SIS3干擾組和氧化苦參堿干擾組中P4Ha(Ⅲ)基因表達量均顯著低于Hyp空白組(P<0.05)，說明飼料中添加Hyp可顯著下調P4Hα(Ⅲ)基因的表達，而抑制TGF-β/Smads通路對其作用不明顯。淺色黃姑魚魚鰾中P4Hα(Ⅰ)、P4Hα(Ⅱ)、TGF-β、TGF-βRT、Smad3、Smad4和Smad7基因的表達相對穩(wěn)定，均不受Hyp的影響。

3 討 論

氨基酸在促進動物生長、維持機體正常生理及營養(yǎng)代謝中起著至關重要的作用[29]。飼料中Hyp含量較少，特別是植物源飼料中幾乎不存在Hyp[30]。越來越多的證據表明[31-34]，提供充足的Hyp有利于魚類的健康生長。本研究也發(fā)現，Hyp顯著提高了淺色黃姑魚的特定生長率，作者前期研究也發(fā)現，添加Hyp對淺色黃姑魚[9]和雙棘黃姑魚[31]的生長具有顯著促進作用。Wei等[32]曾報道，飼料中添加Hyp可以促進大黃魚的生長性能，在Hyp添加水平為0.33%時，大黃魚可獲得最佳的特定生長率。Liu等[33]研究表明,以植物蛋白為基礎的飼料中添加Hyp可以顯著促進大菱鲆的生長。在高比例植物源飼料中添加0.28%的Hyp可以增加三文魚的體質量[34]。然而Albrektsen等[35]研究發(fā)現，三文魚的生長性能不受Hyp水平的顯著影響；Zhang等[8]在大菱鲆中也未發(fā)現Hyp對生長具有促進作用。上述研究中，魚的種類、大小、試驗飼料和水產養(yǎng)殖條件存在較大差異，這可能是致試驗結果差異的主要原因。如在Liu等[33]與Zhang等[8]的研究中魚種雖均為大菱鲆幼魚，但飼料配方中植物蛋白的比例卻相差甚遠；飼料中添加Hyp對246～264 g三文魚[34]和2.4 kg三文魚[35]的試驗結果截然相反，這有可能是因為仔魚期的特定生長率要遠大于育成期，所以生長對營養(yǎng)素的響應度在仔魚期較成魚期會更敏感。分析肝臟組織形態(tài)是了解機體健康情況的一個重要手段。本研究干擾劑注射液中含一定濃度的DMSO，過量的DMSO對動物有一定毒副作用，因此有必要就DMSO對試驗結果的影響程度加以評估，結果發(fā)現，本試驗條件下干擾劑DMSO對淺色黃姑魚的毒副作用較小，不足以影響營養(yǎng)代謝實驗結果。

Hyp作為膠原蛋白的重要組成部分，能夠在一定程度上促進膠原蛋白的沉積，而關于Hyp促進膠原蛋白沉積的作用機制鮮有報道[36]。TGF-β/Smads信號通路在調控膠原蛋白代謝過程中具有重要作用，有研究表明，脯氨酸[7]和蠶豆[37]可通過TGF-β/Smads信號通路促進魚類膠原蛋白沉積，而有關TGF-β/Smads信號通路是否也參與調控Hyp對淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白沉積的促進作用目前尚未見報道。本研究通過抑制劑干擾TGF-β/Smads通路，比較抑制與否，Hyp對淺色黃姑魚膠原蛋白沉積及相關基因表達的影響，結果發(fā)現，添加Hyp顯著促進了淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白沉積，一些學者在大菱鲆上也發(fā)現了類似結果[8,33]，說明飼料中添加適量的Hyp能夠促進膠原蛋白的合成。為了探討Hyp促進膠原蛋白沉積的作用機制，本研究分析了膠原蛋白代謝相關基因及TGF-β/Smads信號通路中關鍵基因的表達情況，結果發(fā)現，Hyp顯著上調COL1A1和COL1A2的表達，這也與之前在雙棘黃姑魚中的研究結果相吻合[7]，說明可能通過上調膠原蛋白基因的轉錄來促進膠原蛋白合成。本研究中，SIS3和氧化苦參堿干擾對Hyp介導的淺色黃姑魚魚鰾中COL1A1和COL1A2基因表達有明顯的下調作用，這可能是抑制劑導致膠原蛋白沉積下降的原因。這也與早期研究報道的氧化苦參堿和SIS3能夠降低機體組織的纖維化(膠原蛋白的沉積過程)[16-19]相一致。TGF-β/Smads信號通路中包含多個信號傳導因子，如TGF-β和TGF-βRT可刺激Smad2、Smad3與Smad4締合形成易位復合物進入細胞核，通過其他轉錄因子與靶基因(如COL1A2)啟動子區(qū)結合，調控基因表達[38-39]。近年來，人們逐步證實在組織纖維化的過程中，經典的TGF-β/Smads通路并不是唯一的信號傳遞途徑，且TGF-β的胞內信號傳遞在不同細胞中有不同的信號通路，TGF-β下游的信號傳導分子除了經典的Smad2、Smad3之外，還存在其他一些非Smads通路，如MAPK通路、AKT/PIK3通路等[12]。本試驗中，SIS3和氧化苦參堿干擾對TGF-β/Smads信號通路中關鍵基因表達并無顯著影響，說明Hyp促進魚鰾中膠原蛋白沉積可能與TGF-β/Smads信號通路無關。本研究還發(fā)現，P4Hα(Ⅲ)基因的表達水平在Hyp添加組顯著下調，但并不受抑制劑的影響。Hyp不能作為合成膠原蛋白的底物，自然狀態(tài)下也不存在游離的Hyp，Hyp是在膠原蛋白肽鏈形成后，由脯氨酰殘基羥基化形成的[40]。脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylase，P4H)是催化脯氨酰殘基羥基化的主要酶，主要有3個α亞基，由脯氨酸羥化酶基因(P4Hα(Ⅰ)、P4Hα(Ⅱ)和P4Hα(Ⅲ))編碼[41]。添加Hyp可能導致P4H活性降低，減弱了Pro羥基化形成Hyp這一過程，直接抑制了膠原蛋白的降解，從而間接地促進了膠原蛋白的沉積。正常生理狀態(tài)下，膠原蛋白的合成和分解過程時刻都處在動態(tài)的平衡中，本試驗中添加Hyp導致魚鰾中膠原蛋白沉積增加，可能是膠原蛋白合成增加與降解減少共同的作用結果，而TGF-β/Smad信號通路在其中發(fā)揮的作用有限。

綜上所述，Hyp對淺色黃姑魚的生長和魚鰾膠原蛋白沉積有一定的促進作用，而SIS3干擾抑制后，魚鰾膠原蛋白含量顯著降低，對TGF-β/Smads通路中相關基因表達的影響，僅影響了Smad2的轉錄；氧化苦參堿干擾對TGF-β/Smads通路中相關基因的影響不顯著，且干擾前后魚鰾中膠原沉積無顯著性差異。結果表明，SIS3對膠原蛋白代謝的抑制作用要強于氧化苦參堿，且TGF-β/Smads通路不是調控Hyp促進膠原蛋白沉積的主要路徑。Hyp促進膠原蛋白沉積的作用機理可能與抑制膠原蛋白的降解有關。

志謝：感謝汕頭大學理學院海洋生物研究所為本試驗提供試驗場所，感謝溫小波教授和林帆博士對文稿所提的寶貴意見。