梁世周 許建平 蔡文品 孔萬(wàn)仲 奚經(jīng)巧 金曉立 曾云祥

血流感染的治療是全世界醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)的臨床重點(diǎn)，有報(bào)道其致死率為18.2%～21.4%[1]。有研究結(jié)果顯示，對(duì)于膿毒性休克患者，如果每延遲1 h給予有效治療，死亡風(fēng)險(xiǎn)增加35%[2]。因此，早期適當(dāng)使用抗生素治療對(duì)改善血流感染的預(yù)后至關(guān)重要[3]。目前，腸桿菌目菌株是引起血流感染的主要病原體，其分離率高達(dá)30%[4]。同時(shí)，近年來(lái)耐碳青霉烯腸桿菌目對(duì)全球公共衛(wèi)生構(gòu)成的威脅呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，成為最常見(jiàn)的一個(gè)全球衛(wèi)生問(wèn)題[5]。中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)（CHINET）顯示，2005—2019年36所三級(jí)醫(yī)院肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南的耐藥率從3.0%上升至25.3%，且呈逐年遞增趨勢(shì)[6]。此外，耐碳青霉烯類(lèi)藥物的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，已成為近年來(lái)死亡率上升最快的病原菌[7]。在腸桿菌目中，碳青霉烯類(lèi)耐藥性通常是由于諸如外排泵、孔蛋白損失和產(chǎn)生大量耐藥酶等過(guò)程導(dǎo)致的，其中產(chǎn)碳青霉烯酶是最常見(jiàn)的耐藥機(jī)制。因此，耐藥酶的快速檢測(cè)成為近年來(lái)的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域。

目前，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是碳青霉烯酶活性檢測(cè)的最新進(jìn)展，被成功地用于從革蘭陰性菌落中直接檢測(cè)碳青霉烯酶的活性[8-10]。筆者嘗試?yán)肕ALDI-TOF MS直接從陽(yáng)性血液培養(yǎng)瓶中對(duì)腸桿菌目細(xì)菌生產(chǎn)的碳青霉烯酶活性進(jìn)行快速檢測(cè)，并與耐藥基因PCR分子檢測(cè)結(jié)果比較，評(píng)估該方法的可靠性。

1 材料和方法

1.1 菌株來(lái)源 收集2012年1月至2018年12月溫州市中醫(yī)院各臨床科室分離的腸桿菌目細(xì)菌46株，不含重復(fù)菌株。其中產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌目細(xì)菌（carbapenemase-producing Enterobacteriaceae，CPE）25株，包括攜帶 blaKPC-27株，blaNDM（包括NDM-1、4、5型）8株，blaIMP-42株，同時(shí)攜帶blaKPC-2和blaCTX-M4株，同時(shí)攜帶blaKPC-2和blaNDM-42株，同時(shí)攜帶blaNDM-1和blaIMP-42株；非產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌目細(xì)菌（non-carbapenemase-producing Enterobacteriaceae，NCPE）21株 ，其 中 攜 帶blaCTX-M5株，未檢測(cè)到上述基因型且碳青霉烯類(lèi)敏感的腸桿菌目細(xì)菌16株。篩查2022年3月至4月本院各病房送檢已簽發(fā)報(bào)告的陽(yáng)性血培養(yǎng)標(biāo)本，收集致病菌為耐碳青霉烯類(lèi)腸桿菌目細(xì)菌（carbapenemase-resistant Enterobacteriaceae,CRE）9例，非耐碳青霉烯類(lèi)腸桿菌目細(xì)菌（non-carbapenemase-resistant Enterobacteriaceae,NCRE）17例，對(duì)上述26例血培養(yǎng)樣本打亂順序，作為方法驗(yàn)證的臨床樣本。質(zhì)控菌株選用大腸埃希菌ATCC?25922和肺炎克雷伯ATCC?BAA1706作為陰性對(duì)照，肺炎克雷伯ATCC?BAA1705作為陽(yáng)性對(duì)照，均購(gòu)自浙江省臨床檢驗(yàn)中心。

1.2 主要試劑和儀器 全自動(dòng)快速生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)（Bruker autoflexTMMALDI-TOF MS）及相關(guān)配套試劑（德國(guó)布魯克科技有限公司），血培養(yǎng)瓶、Vitek2 Compact細(xì)菌鑒定與藥物敏感儀及相關(guān)配套試劑（法國(guó)梅里埃生物科技有限公司），血瓊脂平板（鄭州安圖生物股份有限公司），1.5 ml EP管若干，亞胺培南標(biāo)準(zhǔn)品（湖北惠擇普醫(yī)藥科技有限公司,CAS號(hào)：64221-86-9），十二烷基硫酸鈉（天津北辰方正化工），真空采血管（美國(guó)BD公司），高速離心機(jī)（美國(guó)賽默飛世科技公司），萬(wàn)分之一天平（日本島津公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn) 采用Vitek2 Compact做細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)，結(jié)果解釋參照CLSI M100 S31標(biāo)準(zhǔn)[12]。

1.3.2 耐藥基因檢測(cè) 采用煮沸法提取細(xì)菌DNA模板。PCR體系50 μl，2×PCR Master Mix 25 μl，上、下游引物 10 μmol/L 各 1 μl，模板 DNA 2 μl，滅菌水 21 μl。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火溫度30 s，72℃45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。再取PCR擴(kuò)增物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察并拍攝。詳細(xì)步驟及引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[11]。

1.3.3 模擬陽(yáng)性血培養(yǎng) 復(fù)融上述菌株于血平板中，過(guò)夜培養(yǎng)18 h。挑取少許菌落溶于無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液中，配制成0.5麥?zhǔn)蠞舛染鷳乙海ㄏ喈?dāng)于1.5×108CFU/ml），稀釋至1×103CFU/ml。在輸血科收集報(bào)廢O型懸浮紅細(xì)胞和O型血漿，混合制成紅細(xì)胞壓積（Hct）約為0.4的模擬人血液。取1 ml上述菌懸液混于9 ml人模擬血液，注入血培養(yǎng)瓶中，放置血培養(yǎng)儀等待報(bào)陽(yáng)后取出備用。

1.4 血培養(yǎng)液前處理

1.4.1 制備菌懸液 用注射器抽取報(bào)陽(yáng)后的血培養(yǎng)液5 ml，置于真空采血管內(nèi)，1 170 r/min，離心5 min，將紅細(xì)胞沉置分離膠下部，棄上清液。加入0.5%十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液1 ml洗滌，用旋渦振蕩器混勻后，再次1 170 r/min，離心5 min。該洗滌步驟重復(fù)進(jìn)行2次，棄上清液，加入0.9%氯化鈉溶液1 ml復(fù)混，獲得單一的菌懸液備用。

1.4.2 菌株鑒定 于EP管中分別加入150 μl上述菌懸液和450 μl無(wú)水乙醇，混勻后16 000 r/min，離心2 min，棄上清液后加入20 μl 70%甲酸溶液和20 μl乙腈，混勻，再次 16 000 r/min，離心 2 min。取上清液 1 μl，點(diǎn)靶；干燥后滴加1 μl基質(zhì)液（α-HCCA），晾干后上機(jī)。

1.4.3 亞胺培南分解試驗(yàn) 利用萬(wàn)分之一天平稱取10 mg亞胺培南和20 mg SDS溶于10 ml 0.9%氯化鈉注射液中，配制成0.2%SDS、1.0 mg/ml亞胺培南混合液，備用。吸取30 μl上述混合液于EP管中，再加入30 μl菌懸液，混勻后放置37℃水浴箱2 h。隨后，將EP管16 000 r/min，離心2 min，取上清液 1 μl，點(diǎn)靶；干燥后滴加1 μl基質(zhì)液，晾干，上機(jī)。

1.5 MALDI-TOF MS分析及結(jié)果判定 質(zhì)譜儀采用反射正離子模式，手動(dòng)采集光譜，采集區(qū)間為100～600Da；參數(shù)設(shè)置：離子源1∶10.00 kV；離子源2∶9.08 kV；鏡頭：3.00 kV；脈沖離子提取時(shí)間：10 ns；激光頻率：60.0 Hz。應(yīng)用flexControl 3.3軟件(Bruker Daltonics)分析所得光譜。

菌種鑒定收集2 000～20 000 Da的光譜，用BTS進(jìn)行儀器校準(zhǔn)，通過(guò)軟件IVD MALDI Biotyper 3.1版識(shí)別菌名，并且以軟件給出的Biotyper log值評(píng)價(jià)鑒定效果：分值≥2.0視為鑒定到種水平，1.70～1.99視為鑒定到屬水平，分值＜1.70視為不可信結(jié)果。

通過(guò)觀察亞胺培南（Imipenem:C11H17N3O4S,相對(duì)分子質(zhì)量：299.35 g/mol）產(chǎn)生的質(zhì)譜峰[Imipenem+H+]:300 m/z、亞胺培南和基質(zhì)液混合物[Imipenem+α-HCCA+H+]：489 m/z質(zhì)譜峰，兩處峰完全消失，判定為試驗(yàn)菌產(chǎn)生可以分解亞胺培南的碳青霉烯酶。

1.6 方法驗(yàn)證 對(duì)上述26株臨床陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本按照1.3～1.4步驟操作。

1.7 質(zhì)量控制

1.7.1 質(zhì)譜峰校準(zhǔn) 利用基質(zhì)液中α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-HCCA：C10H7NO3,相對(duì)分子質(zhì)量189.17 g/mol）電離產(chǎn)生的質(zhì)譜峰對(duì)波峰采集區(qū)間0～600 Da進(jìn)行校準(zhǔn)，校準(zhǔn)峰分別為 HCCA_[M+H+]：190.050 m/z、HCCA_[M+Na+]：212.032 m/z和 HCCA_[2M+H+]：379.092 m/z，3個(gè)校準(zhǔn)峰值同時(shí)出現(xiàn)，并且每個(gè)峰的最大偏差（Err/ppm）都不超過(guò)±100 ppm，即視為校準(zhǔn)通過(guò)[14]。同時(shí)，把α-HCCA的質(zhì)譜峰作為空白實(shí)驗(yàn)對(duì)照。

1.7.2 藥物對(duì)照 取0.5 g/ml亞胺培南混合0.1%SDS溶液1 μl點(diǎn)靶干燥后滴加基質(zhì)液，上機(jī)后收集的質(zhì)譜峰作為此次實(shí)驗(yàn)的藥物對(duì)照。

1.7.3 陰陽(yáng)性對(duì)照 以大腸埃希菌ATCC?25922和肺炎克雷伯菌ATCC?BAA1706作為不產(chǎn)碳青霉烯酶的陰性對(duì)照株，肺炎克雷伯菌ATCC?BAA1705作為產(chǎn)KPC的陽(yáng)性對(duì)照株，按照上述實(shí)驗(yàn)流程檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示；使用Kappa對(duì)質(zhì)譜法結(jié)果和原先檢出的基因檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行一致性檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜峰校準(zhǔn)分析 經(jīng)校準(zhǔn)，質(zhì)譜儀內(nèi)部校準(zhǔn)通過(guò)，見(jiàn)圖1a。圖1b中300 Da處為亞胺培南分子電離產(chǎn)生的質(zhì)譜峰，和約為489 Da處由亞胺培南與HCCA混合物形成的質(zhì)譜峰，以及SDS（C12H25SO4Na，相對(duì)分子質(zhì)量：288.38）分子_[SDS+Na+]:311 Da處的質(zhì)譜峰。

圖1 質(zhì)譜校準(zhǔn)峰、亞胺培南和SDS質(zhì)譜峰示意圖

2.2 藥敏及質(zhì)譜結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)共收集CPE 25株和NCPE 21株，包含5種腸桿菌目細(xì)菌，攜帶碳青霉烯酶基因blaKPC-2、blaIMP-4和blaNDM及β內(nèi)酰胺酶blaCTX-M，見(jiàn)表1。藥敏結(jié)果顯示，25株CPE對(duì)亞胺培南和厄他培南的最小抑菌濃度（MIC）分別為4～≥16不等，另外21株NCPE的MIC為≤0.5～2。陽(yáng)性血培養(yǎng)液提純菌液的直接細(xì)菌鑒定結(jié)果同之前純菌落鑒定結(jié)果完全一致，軟件給出的Biotyper log值為2.188±0.102，種水平鑒定率為96.0%，屬水平鑒定率為100.0%。在亞胺培南水解試驗(yàn)中，結(jié)果顯示：25株CPE生成的質(zhì)譜圖均未出現(xiàn)300 m/z和489 m/z處的質(zhì)譜峰，提示亞胺培南已被完全水解。而21株NCPE則全部檢測(cè)到300 m/z和489 m/z的質(zhì)譜峰，見(jiàn)圖2。應(yīng)用一致性檢驗(yàn)結(jié)果Kappa=1，提示兩種方法高度一致。

表1 49株腸桿菌目PCR、藥敏及血培養(yǎng)液直接檢測(cè)的質(zhì)譜結(jié)果

圖2 10例300 m/z和489 m/z處的質(zhì)譜峰消存情況（a：空白對(duì)照；b：藥物對(duì)照；c:肺炎克雷伯菌ATCC?BAA1705；d：肺炎克雷伯菌ATCC?BAA1706；e：產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌；f：產(chǎn)IMP-4植生拉烏爾菌；g：產(chǎn)NDM-1陰溝腸桿菌；h：產(chǎn)KPC-2和NDM-4肺炎克雷伯菌；i:產(chǎn)CTX-M肺炎克雷伯菌；j：無(wú)攜帶耐藥基因的大腸埃希菌）

2.3 質(zhì)譜圖結(jié)果 所有質(zhì)譜圖結(jié)果均表現(xiàn)為300 m/z和489 m/z同時(shí)存在或同時(shí)消失，未出現(xiàn)兩處峰結(jié)果不一致的結(jié)果。同時(shí)311 m/z處由SDS生成的質(zhì)譜峰均高于300 m/z處質(zhì)譜峰，且十分穩(wěn)定。

2.4 方法驗(yàn)證結(jié)果 驗(yàn)證結(jié)果顯示，其中有17例出現(xiàn)300 m/z和489 m/z處質(zhì)譜峰，且均對(duì)應(yīng)17株碳青霉烯類(lèi)藥物敏感的菌株。剩下9例未出現(xiàn)這兩處質(zhì)譜峰，對(duì)應(yīng)9株耐碳青霉烯類(lèi)藥物的腸桿菌目病原菌。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示其靈敏度和特異度均為1.00。

3 討論

目前，根據(jù)CLSI和EUCAST指南，臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)報(bào)告碳青霉烯類(lèi)藥物的敏感性，而在確認(rèn)碳青霉烯酶的產(chǎn)生未做必要性要求。因此，自動(dòng)化系統(tǒng)習(xí)慣性地忽視碳青霉烯酶的檢測(cè)。近年來(lái)，針對(duì)CPE可以有效且快速分解亞胺培南的特性，通過(guò)飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)捕捉亞胺培南所顯示的特征譜峰，檢測(cè)其水解情況，從而判斷碳青霉烯酶活性的方法逐漸被開(kāi)發(fā)。而本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該方法同樣適用于在陽(yáng)性血培養(yǎng)液中對(duì)CPE的檢出。

本實(shí)驗(yàn)篩選46株經(jīng)確定常見(jiàn)碳青霉烯酶基因型的細(xì)菌，模擬血培養(yǎng)報(bào)陽(yáng)后，再經(jīng)MALDI-TOF MS直接對(duì)血培養(yǎng)液做細(xì)菌鑒定和亞胺培南水解實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，質(zhì)譜檢測(cè)21株CPE的結(jié)果均未檢測(cè)到300 m/z和489 m/z處的質(zhì)譜峰，而25株NCPE則均可檢測(cè)到，對(duì)比基因表型高度一致。此外，對(duì)血培養(yǎng)液直接鑒定的細(xì)菌種水平鑒定率為96.0%。該數(shù)據(jù)與國(guó)外相關(guān)報(bào)道接近[13-14]。

在質(zhì)譜圖方面，本實(shí)驗(yàn)選擇300 m/z和489 m/z兩處質(zhì)譜峰作為結(jié)果的判斷，旨在避免因?yàn)榧?xì)菌自身蛋白或其他雜質(zhì)造成300 m/z或489 m/z任一處出現(xiàn)假性藥物峰的錯(cuò)誤判讀[15]。因?yàn)橐坏┏霈F(xiàn)這兩處峰的結(jié)果不一致，實(shí)驗(yàn)人員可以對(duì)結(jié)果質(zhì)疑并重新評(píng)估。然而，本實(shí)驗(yàn)均未出現(xiàn)該情況。此外，311 m/z處由SDS產(chǎn)生的質(zhì)譜峰極其穩(wěn)定，且表現(xiàn)出相較其他譜峰更高的分辨率。SDS在實(shí)驗(yàn)中作為去污劑和表面活性劑，分別在血培養(yǎng)液的洗滌和上清液點(diǎn)靶后的快速干燥上起相應(yīng)作用。通過(guò)涂片在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，未加入SDS洗滌的血培養(yǎng)液攜帶豐富的雜質(zhì)，而這些雜質(zhì)將會(huì)使下一步細(xì)菌鑒定的Biotyper log值下降0.5分以上（數(shù)據(jù)未顯示）。并且，SDS的陰離子表面活性劑功能可以改變液體表面張力，從而克服上清液在靶板上干燥慢的缺陷。有研究表明，補(bǔ)充SDS在任何情況下都不會(huì)改變抗生素峰譜[15]，本實(shí)驗(yàn)中也得以證實(shí)。

本研究選擇亞胺培南作為水解底物，其相較于美羅培南和厄他培南，具備水解時(shí)間快[8]，獲得的質(zhì)譜峰通常更清晰，使結(jié)果更易判讀[16]等好處。但是，在本實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)亞胺培南降解產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的峰，即使是重復(fù)的孵化和測(cè)量也沒(méi)有獲得更好可解釋的結(jié)果。這一點(diǎn)與相關(guān)報(bào)道一致[13,16]。這可能與其水解產(chǎn)物的不穩(wěn)定性有關(guān)[15]，但目前尚未被證實(shí)。在本團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，部分梅里埃生產(chǎn)的血培養(yǎng)瓶中含有碳粒成分，這對(duì)微生物蛋白的提取及純化影響較大，不宜進(jìn)行直接鑒定。然而，由于菌株收集有限，本研究只局限對(duì)腸桿菌目細(xì)菌的檢測(cè)，未納入非發(fā)酵菌，這點(diǎn)將在后續(xù)的研究中改進(jìn)。

綜上所述，MALDI-TOF MS可以直接從血培養(yǎng)液中鑒定病原菌及檢測(cè)碳青霉烯酶活性，且表現(xiàn)出極好的靈敏度和特異度，這或?qū)?duì)臨床及早調(diào)整抗菌藥物治療和實(shí)施感染控制措施提供值得期待的應(yīng)用前景。