徐 偉，望小杰，吳 磊

上海市寶山區(qū)羅店醫(yī)院普外科，上海 201908

隨著人們生活水平的提高和飲食結構的改變，結直腸癌發(fā)病率日益升高，已在我國居民消化道惡性腫瘤中位列第三，其發(fā)生、發(fā)展是一個多因素和多步驟的復雜過程，而且伴有淋巴結轉移的患者預后較差，遠期生存率并不理想[1-2]。因此，了解結直腸癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉移的規(guī)律，并對此類患者復發(fā)及死亡風險進行準確鑒別及分層，對尋找特異性分子靶點及靶向藥物，優(yōu)化臨床結局十分重要[3]。近年來研究表明，轉錄因子NF-E2相關因子2(Nrf2)及其信號通路參與了腫瘤的形成與發(fā)展，同時其結合核酸序列上含有一段抗氧化反應元件(ARE)信序列，可激活基因或其他轉錄因子的表達，對于癌細胞的增殖、侵襲及轉移均具有重要作用，是當下研究熱點之一[4-5]。但是，現(xiàn)階段對Nrf2、血紅素加氧酶-1(HO-1)在結直腸癌預后預測中的價值尚不明確，這兩種因子是否也有類似的特性尚缺乏可靠的依據(jù)?；诖?，本研究以本院接受腹腔鏡根治術治療的84例結直腸癌患者為觀察對象，并利用免疫組織化學染色檢測組織中Nrf2、HO-1的表達情況，并收集其與臨床特征及預后相關的數(shù)據(jù)，旨在探討其可能存在的潛在臨床意義，為臨床實踐提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年3月至2020年1月于上海市寶山區(qū)羅店醫(yī)院接受結直腸癌根治術治療的結直腸癌患者86例為研究對象，所有患者年齡在49～76歲，平均(67.13±6.95)歲，術后進行規(guī)范的輔助化療。納入標準：(1)術前1個月無手術、放療、化療等治療史；(2)均接受由同一組醫(yī)護人員實施的規(guī)范性結直腸癌根治術[6]，且術后經(jīng)病理學檢測確診為結直腸癌；(3)進行長期規(guī)律的門診復診和電話隨訪；(4)保留有完整癌組織及距癌組織邊緣>5 cm的正常組織蠟塊標本；(5)入組前3個月未服用過非甾體類抗炎藥、皮質(zhì)激素藥物。排除標準：(1)孕產(chǎn)婦或有肺、胃等其他腫瘤的特殊人群；(2)5年內(nèi)有其他惡性腫瘤既往史者；(3)手術前后缺失血常規(guī)、術后病理缺失TNM分期等關鍵數(shù)據(jù)者；(4)免疫組織化學染色效果不理想者；(5)術前已轉移、接受姑息性切除的患者；(6)危重癥患者(Kamofsky生存質(zhì)量評分小于60分)。

1.2方法

1.2.1組織切片制作和免疫組織化學染色 所有患者均選取3個典型的癌組織和2個相鄰癌旁正常組織(距癌組織邊緣>5 cm)，經(jīng)10%甲醛固定后制成4 μm厚石蠟切片，參照免疫組織化學染色按試劑盒說明書進行操作。切片脫蠟與水化之后，于室溫下進行孵育、漂洗、甩干等操作，二氨基聯(lián)苯胺法顯色，并采用蘇木素復染細胞核，時間約2 min，鹽酸酒精分化，流水沖洗返藍，用梯度濃度的乙醇依次沖洗5 min，入流水2 min，二甲苯透明，中性樹膠封片。采用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，將已得出結果的結直腸癌組織中Nrf2、HO-1高表達組織切片作為陽性對照。嚴格依據(jù)免疫組織化學染色試劑盒(購自英國Abcam公司)說明書標準檢測。

1.2.2免疫組織化學染色結果判定 由兩位有經(jīng)驗的病理醫(yī)師分別雙盲閱片，于400倍顯微鏡(奧林巴斯CX23)下觀察，NIS-Elements Br3.0分析軟件計算吸光度值，并根據(jù)文獻[7]中的相關標準進行結果判定。Nrf2、HO-1主要定位于細胞質(zhì)內(nèi)，陽性結果為細胞出現(xiàn)棕黃色至深褐色，根據(jù)染色強度和染色面積百分比量化蛋白相對表達水平。(1)染色面積百分比評分：陽性細胞百分比<6%、6%～<26%、26%～<51%、51%～<76%、≥76%分別判定為0、1、2、3、4分。(2)顯色評分：染色強度以無著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別判定為0、1、2、3分。兩項評分的乘積為最終的評分，總分范圍0～12分，其中6～12分為強陽性(+++)，3～5分為中等陽性(++)，1～2分為弱陽性(+)，0分為陰性(-)，同時將中等陽性及以下記為“低表達組”，強陽性為“高表達組”。

1.2.3臨床資料收集及隨訪 采用聯(lián)合自制問卷調(diào)查表和臨床病歷，對納入的86例行腹腔鏡下根治手術患者的一般資料進行詳細記錄。同時均要求經(jīng)規(guī)范治療后，采用電話或門診復診等方式進行隨訪，術后2年內(nèi)每3個月隨訪1次，2年以上每半年隨訪1次，隨訪開始于手術當日，隨訪截止時間為2021年7月31日，100%的患者有完整的隨訪信息。無病生存期(DFS)和總生存期(OS)為主要的研究終點，其中DFS指從隨機化開始到第一次腫瘤復發(fā)或任何原因所致死亡的時間，DFS率為DFS內(nèi)存活個體所占的百分比[8]；OS是指從隨機化開始至任何原因所致死亡的時間，OS率為OS內(nèi)存活個體所占的百分比[9]。

2 結 果

2.1不同病理組織中Nrf2、HO-1免疫組織化學染色評分比較 免疫組織化學染色評分結果顯示，結直腸癌組織中Nrf2、HO-1的評分比癌旁組織低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同病理組織中Nrf2、HO-1免疫組織化學染色評分比較[M(P25,P75)，分]

2.2結直腸癌組織中Nrf2、HO-1表達與臨床病理特征的關系 根據(jù)免疫組織化學染色結果判定標準，結直腸癌組織中Nrf2、HO-1的低表達率分別為63.95%(55/86)、66.28%(57/86)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，結直腸癌組織中Nrf2、HO-1的表達與患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤最大徑、分化程度及淋巴結轉移等臨床病理參數(shù)無關(P>0.05)；而Nrf2、HO-1低表達患者腫瘤浸潤深度T3～T4、脈管浸潤及TNM分期Ⅲ期例數(shù)均高于高表達患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 結直腸癌組織中Nrf2、HO-1表達與臨床病理特征的關系(n)

2.3結直腸癌組織中Nrf2、HO-1表達與患者預后的關系 86例結直腸癌患者中，組織中Nrf2、HO-1呈現(xiàn)異常低表達的患者分別有55、57例，DFS率分別為49.09%(27/55)、50.88%(29/57)，OS率分別為38.18%(21/55)、38.60%(22/57)；Nrf2、HO-1高表達患者分別有31、29例，DFS率分別為74.19%(23/31)、75.86%(22/29)，OS率分別為67.74%(21/31)、68.97%(20/29)。Kaplan-Meier生存分析顯示，結直腸癌組織中Nrf2、HO-1低表達組患者的DFS率、OS率均低于高表達組(DFS率：Log-rankχ2=5.139、4.970，P=0.022、0.030；OS率：Log-rankχ2=6.936、7.098，P=0.009、0.006)，見圖1～4。將結直腸癌患者臨床資料及生化指標納入Cox單因素分析，結果顯示，結直腸癌患者TNM分期Ⅲ期、淋巴結轉移分級N2～N3、有脈管浸潤、浸潤深度T3～T4及組織中Nrf2低表達、HO-1低表達是DFS和OS的危險因素(P<0.05)，見表3；對單因素分析結果中差異有統(tǒng)計學意義的變量進行多因素分析，結果顯示，TNM分期Ⅲ期及組織中Nrf2低表達、HO-1低表達均為結直腸癌患者DFS和OS的獨立危險因素(P<0.05)，見表4。

圖1 結直腸癌組織中Nrf2表達與患者DFS率的關系

圖2 結直腸癌組織中HO-1表達與患者DFS率的關系

圖3 結直腸癌組織中Nrf2表達與患者OS率的關系

圖4 結直腸癌組織中HO-1表達與患者OS率的關系

表3 影響結直腸癌患者預后的單因素分析

表4 影響結直腸癌患者預后的多因素分析

3 討 論

在消化道惡性腫瘤中，結直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，而該病的發(fā)生需經(jīng)歷一個長期的發(fā)展過程，因此早期發(fā)現(xiàn)并明確結直腸癌復發(fā)、轉移風險是優(yōu)化患者治療結局的最可靠方式，尋找簡單、高效、可重復的檢查手段是目前臨床研究的重點[10-11]。近年來，隨著對抗氧化系統(tǒng)研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)肺癌細胞、乳腺癌細胞、前列腺癌細胞的惡性生物學行為似乎與氧化應激密切相關，考慮可能為氧化應激環(huán)境的作用促進了腫瘤的血管生成及遠處轉移[12]。AQUILANI等[13]通過一項回顧性研究證實，結直腸癌患者處于氧化應激狀態(tài)，而經(jīng)過奧沙利鉑-氟嘧啶聯(lián)合療法治療后，此類患者抗氧化能力得到顯著提高且生存獲益。YAO等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在所有階段的結直腸癌患者中，其氧化損傷標志物水平升高，而抗氧化標志物水平降低，同時該研究提出氧化-抗氧化概況可作為診斷、治療、生存和復發(fā)的標志物。但上述觀點多停留于研究氧化應激在促進結直腸組織癌變的相關領域，而對結直腸癌患者復發(fā)轉移風險及預后判斷的研究卻報道較少，且其具體分子機制仍尚未明確。本研究結果發(fā)現(xiàn)，結直腸癌組織中Nrf2、HO-1的表達比癌旁組織高(P<0.05)，提示Nrf2、HO-1表達異?？蔀檩o助判斷結直腸癌患者發(fā)生、發(fā)展提供一定參考?；诖耍狙芯繑M從氧化應激角度探討組織中氧化應激因子Nrf2、HO-1的異常表達與結直腸癌根治術患者臨床病理特征及預后的可能關系。

Nrf2/ARE是目前發(fā)現(xiàn)的最為重要的內(nèi)源性抗氧化應激通路，其中Nrf2是該通路家族成員中活力最強的轉錄因子，生理狀態(tài)下，Nrf2與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1(Keap1)處于偶合狀態(tài)，并被固定在主要由肌動蛋白構成的細胞骨架上，通過泛素化降解Nrf2而維持細胞質(zhì)中的Nrf2處于基礎水平[15]。一旦受到親電試劑刺激后，Keap1/Nrf2解偶聯(lián)，Nrf2發(fā)生磷酸化，并移位至細胞核，與基因中的Maf蛋白相結合，形成異二聚體[16]。而異二聚體可與ARE啟動子部位結合，啟動下游蛋白酶體、泛素酶及Ⅱ相解毒酶等抗氧化靶基因的表達。HO-1就是其眾多靶基因中重要的一種，可借助還原型輔酶Ⅱ或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸作為其電子供體，對醌類及其衍生物產(chǎn)生催化作用，使其失去2個電子從而被還原為水合醌類，進一步阻止了醌類及其衍生物繼續(xù)參與氧化還原反應，從而保護細胞免受一系列過氧化損傷[17]。由于腫瘤微環(huán)境中的氧化應激在疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用，故探究Nrf2/ARE的第一信號途徑亦有重要價值[18-19]。Nrf2/ARE的第一信號途徑在惡性腫瘤患者中的異常表達已經(jīng)被明確，但是其在結直腸癌根治術患者組織中的表達研究及對不良預后的指向性則涉及不多。在本研究中，通過分析86例結直腸癌組織中Nrf2、HO-1表達及其與患者臨床病理特征和預后的關系，發(fā)現(xiàn)Nrf2、HO-1的表達水平在結直腸癌患者中異常降低。腫瘤浸潤深度、脈管浸潤、TNM分期都反映惡性腫瘤的遷移發(fā)展能力，而本研究結果顯示上述臨床病理特征與結直腸癌根治術患者組織中Nrf2、HO-1的低表達有關。進一步的單因素和多因素Cox分析亦證實，結直腸癌根治術患者Nrf2、HO-1的異常低表達是影響其DFS和OS的獨立危險因素，說明Nrf2、HO-1在此過程中發(fā)揮著關鍵性作用。以上研究結果均證實了Nrf2、HO-1在結直腸癌中扮演著抑癌基因的角色，這與其在胰腺癌[20]、腦膠質(zhì)瘤[21]、非小細胞肺癌[22]中的效應類似。

綜上所述，本研究通過對86例結直腸癌患者的生存資料進行統(tǒng)計學分析，發(fā)現(xiàn)Nrf2、HO-1在結直腸癌組織中呈低表達，證實了Nrf2、HO-1表達與多種不良臨床病理特征及患者的不良預后有關，這將有助于研究特異性的抗腫瘤轉移、耐藥性藥物，亦可能對此類患者術后死亡及復發(fā)轉移風險的預測有指導性作用。然而，本研究僅局限于臨床標本分析，且樣本量相對較小，再加之操作測量誤差等也可能會影響研究結果的準確性；同時，未對Nrf2、HO-1介導結直腸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制進行進一步的探索和驗證；盡管如此，本研究所獲得的數(shù)據(jù)成果也為臨床探索Nrf2、HO-1在結直腸癌中的分子功能及潛在機制奠定了一定基礎。在未來，本課題組將在細胞及動物水平上，探討Nrf2、HO-1抑制結直腸癌的潛在分子機制；同時也將收集更多臨床標本對本研究結果進行進一步驗證。