李望豪，周瑞鵬，許鈺瀅，趙琪琪，劉 娟，王榮波，葉文雨

（1.福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/植物與微生物相互作用福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；3.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；4.福建省作物有害生物監(jiān)測與治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350013）

【研究意義】菌草可作為靈芝等食、藥用菌培養(yǎng)基的成分。海南菌草“綠洲一號(hào)”是由國家菌草工程技術(shù)研究中心選育出的菌草品種之一。該品種在水土保持，治理鹽堿地，抑制病原菌及作為食、藥用菌新型培養(yǎng)基原料等方面都有廣闊的發(fā)展前景［1-5］?！熬G洲一號(hào)”是菌草中較為重要的品種，明確“綠洲一號(hào)”內(nèi)生細(xì)菌的生物學(xué)特性及其更深層次的機(jī)理，可以為菌草資源利用及其可持續(xù)發(fā)展提供理論支持，也為植物病原真菌的生物防治及植物促生機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物內(nèi)生細(xì)菌是指可以長期在植物體內(nèi)生存，且會(huì)對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生一定益生作用的一類細(xì)菌［6-9］。目前，從植物組織分離的內(nèi)生細(xì)菌是當(dāng)今微生物領(lǐng)域研究的一大熱點(diǎn)，其主要研究方向?yàn)閮?nèi)生細(xì)菌的促生能力和拮抗能力。Khanna等［10］從鷹嘴豆（Cicer arietinumL.）中分離出對其枯萎病具有拮抗作用且可促進(jìn)鷹嘴豆植株生長的菌株；曹鵬飛等［11］從楊梅等植物的組織中分離出對楊梅枯萎病病菌拮抗效果良好的內(nèi)生細(xì)菌；白潔等［12］從歐李根部分離得到7株內(nèi)生細(xì)菌，均具有一定的溶磷和產(chǎn)IAA 能力，從而對植物產(chǎn)生促生作用；錢鑫等［13］從健康的黃瓜植株中分離出對菊苣假單胞菌（Pseudonwnas cichorii）有抑菌作用的內(nèi)生細(xì)菌，該菌具有很好的固氮、溶磷等促生作用，在抵抗病原真菌的同時(shí)還可以為黃瓜提供生長所需的微量元素，從而促進(jìn)黃瓜生長?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前人對經(jīng)濟(jì)作物和糧食作物內(nèi)生細(xì)菌的研究較為深入，近年來也逐漸重視對菌草等植物內(nèi)生細(xì)菌的研究。鑒于“綠洲一號(hào)”菌草用途廣泛，其內(nèi)生細(xì)菌功能多樣，故對其內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行相關(guān)研究。蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）可作為微生物殺蟲劑，其在植物病蟲害防治中起到積極作用，并且近年來得到更深入的研究與應(yīng)用［14-15］。目前蘇云金芽孢桿菌大多是從土壤和部分植物組織中分離得到，而從菌草分離得到蘇云金芽孢桿菌的研究鮮有報(bào)道?！緮M解決的問題】本研究從海南菌草“綠洲一號(hào)”分離得到1 株內(nèi)生細(xì)菌，并對其生理生化特性、拮抗病原真菌以及其促生性能等方面展開研究，為植物病原真菌的生物防治及植物促生機(jī)理研究提供基礎(chǔ)理論。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物為海南菌草基地的“綠洲一號(hào)”（Juncao“Oasis No.1”），2020 年10 月采其葉片作為內(nèi)生細(xì)菌的分離材料。

供試病原真菌為稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae，Guy11）、香蕉枯萎病菌4 號(hào)（Foctropical race4，F(xiàn)oc4），病原真菌均保存在植物與微生物相互作用福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

供試培養(yǎng)基包括細(xì)菌生長培養(yǎng)基：LB 固（液）體培養(yǎng)基［16］；真菌菌絲生長培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基［17］；生理生化培養(yǎng)基：淀粉水解培養(yǎng)基［18］、明膠培養(yǎng)基［19］、脫脂奶粉培養(yǎng)基、檸檬酸鹽利用培養(yǎng)基、酯酶檢測培養(yǎng)基、纖維素水解培養(yǎng)基；促生性能培養(yǎng)基：有機(jī)磷培養(yǎng)基［20］、無機(jī)磷培養(yǎng)基［21］、CAS 檢測培養(yǎng)基［22］、硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基［23］、King 培養(yǎng)基［24］。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離與純化 將新鮮葉片用自來水沖洗，洗凈后用75%酒精浸泡5 min，然后用無菌水沖洗3 次以上，將最后一次無菌水涂布于LB 培養(yǎng)基中，以確定表面是否消毒徹底。將葉片剪碎后放入研缽，加入無菌水充分研磨，吸取上清液并將上清液稀釋至10-1、10-2、10-3倍，然后分別涂布于LB 培養(yǎng)基上。培養(yǎng)1 d 后挑取合適的菌落，純化3 次后加甘油，以菌液︰甘油為3︰1 的比例對分離純化得到的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行保藏。

1.2.2 內(nèi)生細(xì)菌拮抗病原真菌的篩選 采取平板對峙法，將提前活化的稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌4 號(hào)切成直徑5 mm 的菌餅，菌絲向下接種在培養(yǎng)基中心。再將提前活化16 h 的內(nèi)生細(xì)菌分別添加在距離中心菌餅3.5 cm 處，待對照組病原真菌基本長滿平板時(shí)記錄對照組和試驗(yàn)組病原真菌菌落半徑，計(jì)算抑菌率：

1.2.3 內(nèi)生細(xì)菌的分子鑒定 活化內(nèi)生細(xì)菌16 h 后，利用菌液作為模板，采用引物27F 和1492R［25］，PCR 條件及反應(yīng)體系參考劉彥超等［25］的方法，PCR 產(chǎn)物送至生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行BLAST 比對，利用 MEGA7.0 軟件采用近鄰相接法構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 內(nèi)生細(xì)菌的生理生化特性分析 將內(nèi)生細(xì)菌活化16 h 后進(jìn)行生理生化特性鑒定［26-28］，相關(guān)試驗(yàn)包括革蘭氏染色、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、纖維素利用試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、酯酶試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、蛋白酶試驗(yàn)和接觸酶試驗(yàn)。

1.2.5 內(nèi)生細(xì)菌的促生能力分析 將內(nèi)生細(xì)菌活化16 h 后進(jìn)行該菌對植物的促生能力分析［29-32］，相關(guān)試驗(yàn)包括溶磷能力鑒定、合成鐵載體能力鑒定、降解硅酸鹽能力鑒定以及分泌IAA 能力鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 的形態(tài)學(xué)特征

從海南菌草“綠洲一號(hào)”葉片上分離得到1株內(nèi)生細(xì)菌（編號(hào)：HLY3-2）。從圖1A 可見，HLY3-2 菌落呈紅色圓形，邊緣規(guī)則、表面光滑、濕潤、粘稠狀，菌落直徑為1～2 mm。經(jīng)革蘭氏染色為陽性，菌體呈桿狀（圖1B），初步鑒定該內(nèi)生細(xì)菌為芽孢桿菌（Bacillussp.）。

圖1 內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 的形態(tài)學(xué)特征Fig.1 Morphological characteristics of endophytic bacterium HLY3-2

2.2 內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 拮抗病原真菌的篩選

內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 拮抗病原真菌篩選試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌對稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌4 號(hào)兩種病原真菌均具有一定的抑菌作用（圖2）。通過測量對照組病原真菌菌落直徑與試驗(yàn)組病原真菌菌落直徑，得出內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 的抑菌率分別為 18.45%和30.65%（圖3）。

圖2 內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 對病原真菌的拮抗作用Fig.2 Antagonism of endophytic bacterium HLY3-2 against pathogenic fungi

圖3 內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 對病原真菌的抑制率Fig.3 Inhibition rates of endophytic bacterium HLY3-2 against pathogenic fungi

2.3 內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 的分子鑒定

采用通用引物對菌液進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果（圖4A）顯示，HLY3-2菌株的16SrDNA 基因片段大小約1 600 bp。測序得到16S rDNA 基因序列后，將序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行BLAST 比對，將具有同源性高的序列下載，利用MEGA7.0 軟件進(jìn)行同源比對，采用鄰近相接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果（圖4B）表明，內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 與蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）匯在一支且相似度高達(dá)到99%，故初步判斷該菌為蘇云金芽孢桿菌。

圖4 內(nèi)生細(xì)菌HLIY3-2 的分子鑒定Fig.4 Molecular identification of endophytic bacterium HLY3-2

2.4 內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 的生理生化特性

在檸檬酸鹽利用試驗(yàn)培養(yǎng)基中，菌落周圍沒有產(chǎn)生變化，說明HLY3-2 菌株無法利用檸檬酸鹽（圖5A）；向纖維素利用試驗(yàn)培養(yǎng)基中加入剛果紅后，菌落被沖散且無透明圈產(chǎn)生，表明該菌株不具有利用纖維素的能力，從而導(dǎo)致菌落沒有很好地固定在培養(yǎng)基上（圖5B）；向裝有明膠培養(yǎng)基的EP 管中接種菌液，明膠沒有液化，故該菌株沒有使明膠液化的能力（圖5C）；菌落在酯酶培養(yǎng)基上沒有產(chǎn)生透明暈圈，可見其為不產(chǎn)酯酶菌株（圖5D）；向接種該菌株且恒溫培養(yǎng)3 d 的淀粉培養(yǎng)基中加入碘液，2 min 后菌落周圍沒有產(chǎn)生透明圈，故其為不產(chǎn)淀粉水解酶菌株（圖5E）；在奶粉培養(yǎng)基上，菌落周圍產(chǎn)生了明顯的透明圈，故該菌株可以產(chǎn)生蛋白酶（圖5F）；向涂有該菌落的載玻片上滴入過氧化氫溶液后，迅速產(chǎn)生大量氣泡，有氧氣產(chǎn)生，故該菌株可以產(chǎn)生過氧化氫酶（圖5G）。

圖5 內(nèi)生細(xì)菌HLIY3-2 的生理生化特性分析Fig.5 The physiological and biochemical characteristics of endophytic bacterium HLY3-2

2.5 內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 的促生能力

在含有機(jī)磷和無機(jī)磷的培養(yǎng)基上，菌落周圍都產(chǎn)生了透明圈，因此HLY3-2 菌株具有溶解有機(jī)磷和無機(jī)磷的能力（圖6A 和圖6B）；在CAS培養(yǎng)基上，菌落周圍培養(yǎng)基沒有產(chǎn)生黃色暈圈，故該菌株沒有產(chǎn)生鐵載體的能力（圖6C）；在硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基上，菌落周圍產(chǎn)生了透明圈，故該菌株可以降解硅酸鹽，為植物提供鉀、硅等微量元素（圖6D）；通過標(biāo)準(zhǔn)比色法可知，菌液的發(fā)酵液得到的顏色深于50 μg/mL IAA的標(biāo)準(zhǔn)溶液，因此該菌株具有很強(qiáng)的產(chǎn)IAA 能力（圖6E）。綜上可見，HLY3-2 菌株具有一定的促生能力。

圖6 內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 的促生能力分析Fig.6 Analysis of growth promoting ability of endophytic bacterium HLY3-2

3 討論

在菌草內(nèi)生細(xì)菌研究方面，鄧振山等［33］從巨菌草植株中共分離得到187 株內(nèi)生細(xì)菌，其中86 株具有分泌IAA 的能力，47 株具有溶磷能力。本研究從海南菌草“綠洲一號(hào)”葉片中分離得到的內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 具有類似的生物學(xué)性能，經(jīng)過分子與形態(tài)學(xué)鑒定，該內(nèi)生細(xì)菌為蘇云金芽孢桿菌。該菌株與大多數(shù)植物組織中分離得到的內(nèi)生拮抗促生細(xì)菌同為芽孢桿菌屬，但并非同一種?！熬G洲一號(hào)”植株高大、根系發(fā)達(dá)、抗逆性強(qiáng)、營養(yǎng)豐富，可以為更多內(nèi)生細(xì)菌的生存提供條件，后續(xù)仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

在促生機(jī)理研究方面，張萍等［34］對蘭科植物內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌可以通過溶解磷元素、鉀元素和產(chǎn)生IAA 來促進(jìn)植物生長。而本研究分離得到的內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 具有溶解無機(jī)磷、有機(jī)磷及降解硅酸鹽的能力，并且可以產(chǎn)生IAA。因此該內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 可為植株提供充足微量元素和生長素，進(jìn)而促進(jìn)植物生長，故該菌株具有開發(fā)成為促生菌劑的潛力。

在內(nèi)生細(xì)菌拮抗病原真菌方面，周維等［35］從香蕉中分離出可以對Foc4病原真菌產(chǎn)生拮抗的內(nèi)生細(xì)菌；郭垂寶等［36］從龍牙百合磷莖中分離出對灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）產(chǎn)生強(qiáng)拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌；孫宇晨等［37］從百合的莖分離得到具有促生效應(yīng)的菌株。以上試驗(yàn)可以證實(shí)植物內(nèi)生細(xì)菌不僅對宿主有促生作用，還可以增強(qiáng)宿主對病害的抵御能力。本研究分離得到1 株拮抗內(nèi)生細(xì)菌屬于蘇云金芽孢桿菌，該菌種的促生、拮抗作用未見報(bào)道，因此其可為內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行生物防治提供新思路和新方法。

在蘇云金芽孢桿菌抗病研究方面，李輝等［38］從疏花水柏枝葉片中篩選出對魔芋軟腐病病菌拮抗效果較好的蘇云金芽孢桿菌，但是對Foc4和Guy11病原真菌的拮抗作用尚未涉及。而本研究分離得到的蘇云金芽孢桿菌對Foc4和Guy11均具有一定的抑菌作用，這可能是由于不同宿主對內(nèi)生細(xì)菌的影響不同，從而產(chǎn)生不同抑菌效果。

在拮抗病原真菌機(jī)理方面，劉洋等［39］從核桃根部篩選出拮抗細(xì)菌，并對其拮抗病原真菌機(jī)理進(jìn)行了深入研究，表明內(nèi)生細(xì)菌可以通過分泌多種酶（如蛋白酶、纖維素酶）降解病原真菌或抑制病原真菌的生長與繁殖。但是本研究分離得到的內(nèi)生細(xì)菌在生理生化鑒定時(shí)表現(xiàn)出可以產(chǎn)生蛋白酶但無法產(chǎn)生纖維素酶的特性，因此其拮抗病原真菌的機(jī)理可能與上述研究不同。這可能是由于不同種屬的內(nèi)生細(xì)菌生境不同，拮抗病原真菌的機(jī)理也不相同。內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 有望在生物防治、生物農(nóng)藥開發(fā)、菌草產(chǎn)業(yè)發(fā)展，以及促進(jìn)國家農(nóng)業(yè)健康發(fā)展等方面發(fā)揮一定作用。

4 結(jié)論

本研究從海南菌草“綠洲一號(hào)”中分離得到內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2，經(jīng)鑒定，該菌株為蘇云金芽孢桿菌，具有溶解無機(jī)磷、有機(jī)磷和降解硅酸鹽的能力，而且可以產(chǎn)生IAA，兼具促進(jìn)植物生長的能力。此外，該菌株可以產(chǎn)生蛋白酶、過氧化氫酶，可以在一定程度上清除植物體內(nèi)的活性氧，利于植物健康生長。內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 對病原真菌Foc4和Guy11具有一定拮抗作用。因此本研究分離得到的蘇云金芽孢桿菌可以促進(jìn)植物生長和抑制病原真菌，為多功能生物菌肥［40］及生防菌的應(yīng)用提供理論依據(jù)。