馬靈珍，紀東漢，鞠 康，薛天樂，文 永

1亳州職業(yè)技術學院藥學院；2安徽省中醫(yī)藥科學院亳州中醫(yī)藥研究所；3安徽愛生中藥飲片有限公司，亳州 236800

中藥材為中國傳統(tǒng)中醫(yī)特有藥物，在預防與治療疾病方面發(fā)揮了重要的作用。中藥材種類繁多、來源廣泛，具有作用的整體性、組成成分的多樣性、作用靶點的復雜性以及成分間相互作用的特點，中藥的產(chǎn)品質量直接影響中醫(yī)臨床療效，所以有效控制中藥的質量，是保證中醫(yī)臨床療效的前提。但由于中藥化學成分含量普遍較低，且部分化學成分不穩(wěn)定，使得中藥化學對照品不易制備且價格昂貴，造成多指標的質控模式難以推廣。中藥材質量評價模式多基于傳統(tǒng)經(jīng)驗、多指標成分、指紋圖譜及譜效關系等評價模式來對其質量進行綜合評價。但上述評價方法多存在主觀因素影響、實驗繁瑣復雜及重現(xiàn)性不好等缺點，目前多指標綜合評價模式仍是中藥質量評價的主要研究方向。一測多評(quantitative analysis of multicomponents by single-marker，QAMS)的多指標質量控制方法是利用一種易得廉價的內參比物質對照品，實現(xiàn)對多種成分的同時測定，最終達到控制中藥整體質量的目的?；瘜W計量學(chemometrics)作為一種近代新興的分析實驗方法，其重要特征為將多變量方法引入到化學研究中，計算出研究對象的信息，以及在對大量樣本進行處理時可快速、全面地鑒別歸類。優(yōu)劣解距離法(TOPSIS)是一種多指標的決策分析方法，目前已被廣泛用于多種中藥材的質量評價中。該方法可客觀地對各指標進行權重賦值，有效避免人為主觀因素對中藥材內在質量評價的影響。

車前子為車前科植物車前PlantagoasiaticaL.或平車前PlantagodepressaWilld.的干燥成熟種子，具有清熱利尿通淋、滲濕止瀉、明目、祛痰之功效[1]。車前子應用廣泛，且藥源豐富，具有廣闊的開發(fā)利用前景。鹽車前子為其炮制品，是我國傳統(tǒng)的常用中藥，應用歷史悠久，療效確切。車前子含有多種化學成分，主要包括環(huán)烯醚萜類、苯乙醇苷類、黃酮類、生物堿類、三萜類以及甾醇類等化合物[2,3]。但車前子屬于多基原藥材，其種質資源遺傳多樣性的地理差異較為明顯，野生種與栽培種基因型差異較大，各成分含量差異相應較大，成分不同，療效不同，因此，建立一個科學、便捷、合理的質量評價方法，對鹽車前子的質量進行全面準確地評價并指導車前子資源的合理利用具有重要的現(xiàn)實意義。Li等[4]采用AHP-CRITIC混合加權法和響應面法對鹽車前子炮制工藝進行了優(yōu)化，Gu等[5]采用UPLC-Q-TOF/MS法對車前子生品和鹽炙品中京尼平苷酸、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷進行了定量控制研究，Li等[6]采用藥理學聯(lián)合代謝組學方法，對比考察了生車前子和鹽車前子對鹽水負荷模型大鼠的利尿作用并明其作用機制，目前研究中對鹽車前子定量控制成分較少，也未檢索到對其所含成分進行一測多評法研究，以及采用化學計量學聯(lián)合熵權優(yōu)劣解距離法綜合質量評價的文獻報道，本研究收集江西、河南、安徽、山東和廣西等5個省共18個代表性產(chǎn)地的車前子藥材，按2020年版中國藥典一部車前子項下鹽車前子炮制要求以及四部鹽水炙法對車前子進行同方法炮制，采用HPLC-QAMS法測定鹽車前子中10種成分，通過化學計量學結合熵權TOPSIS法對不同產(chǎn)地來源車前子鹽制品進行綜合質量評價。以期為鹽車前子的整體質量控制提供科學實驗數(shù)據(jù)，為車前子資源合理開發(fā)與利用提供參考。

1 材料

1.1 試藥

對照品桃葉珊瑚苷(批號111761-202102，含量98.4%)、京尼平苷酸(批號111828-201805，含量98.1%)、大車前苷(批號11914-202105，含量96.0%)、毛蕊花糖苷(批號111530-201914，含量95.2%)、槲皮素(批號100081-201610，含量99.8%)、山柰酚(批號110861-202013，含量93.2%)、木犀草素(批號111520-202107，含量96.3%)和芹菜素(批號111901-202004，含量99.4%)源于中國食品藥品檢定研究院；對照品10-羥基大車前草苷(批號327-97-9，含量97.0%)源于上海純優(yōu)生物科技有限公司；異毛蕊花糖苷(批號PRF9010243，含量97.0%)源于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；乙腈和磷酸為色譜純級別，其余試劑為分析純；車前子藥材來源于車前PlantagoasiaticaL.的干燥種子，信息見表1。

表1 車前子藥材信息

1.2 儀器

高效液相色譜儀(Shimadzu LC-20A型，日本島津公司)；高效液相色譜儀(Waters e2695型，Waters公司)；色譜柱Discovery C18、Waters XBridge C18和Durashell C18，規(guī)格均為5 μm，250 mm×4.6 mm；電子分析天平(XSE205DU型，Mettler Toledo)。

2 方法與結果

2.1 混合對照品溶液的制備

取桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、10-羥基大車前草苷、大車前苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素對照品適量，用70%甲醇制成質量濃度分別為0.374、3.950、0.092、0.974、2.710、0.632、0.216、0.438、0.076和3.190 mg/mL的混合對照品貯備液，再將貯備液用70%甲醇稀釋20倍得混合對照品溶液(上述10種對照品質量濃度分別為0.018 7、0.197 5、0.004 6、0.048 7、0.135 5、0.031 6、0.010 8、0.021 9、0.003 8和0.159 5 mg/mL)。

2.2 供試品溶液的制備

取凈車前子按中國藥典2020年版一部車前子項下方法進行炮制，得鹽車前子；取鹽車前子粉末約0.6 g，精密稱定，精密加70%甲醇25 mL，稱重，加熱回流60 min，放冷，70%甲醇補重，搖勻，過濾，即得。

2.3 色譜條件及專屬性試驗

Discovery C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)色譜柱，柱溫30 ℃；檢測波長分別為210 nm(0～22 min檢測桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸和10-羥基大車前草苷)[7-9]、330 nm(22～35 min檢測大車前苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷)[10-15]和360 nm(35～65 min檢測槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素)[16,17]；流動相選用0.1%磷酸(A)-乙腈(B)，流速維持1.0 mL/min進行梯度洗脫(0～12 min，21.0%B；12～22 min，21.0%→35.0%B；22～35 min，35.0%→47.0%B；35～54 min，47.0%→75.0%B；54～65 min，75.0%→21.0%B)，進樣量10 μL。在上述色譜條件下進樣混合對照品溶液及供試品溶液，記錄色譜圖(見圖1)。圖譜顯示鹽車前子供試品溶液中10種成分與相鄰色譜峰分離良好(分離度均≥1.5)。

圖1 混合對照品(A)和供試品(B)的HPLC色譜圖

2.4 多指標成分定量檢測

2.4.1 線性關系考察

取“2.1”項下混合對照品貯備液，精密吸取0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分別用70%甲醇稀釋200、100、40、20、10和4倍，搖勻制得系列線性工作溶液，按“2.3”項色譜條件進樣檢測，記錄色譜圖，以桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、10-羥基大車前草苷、大車前苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素對照品質量濃度為橫坐標(X，μg/mL)，峰面積(Y)為縱坐標進行線性回歸，結果見表2。

表2 鹽車前子中各成分的線性關系

2.4.2 精密度、穩(wěn)定性及重復性試驗

取鹽車前子(編號：S1)一份供試品溶液，在上述色譜條件下，重復進樣6次，記錄桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、10-羥基大車前草苷、大車前苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素色譜峰峰面積，得峰面積的RSD值依次為1.03%、0.56%、1.18%、0.95%、0.71%、1.02%、1.15%、1.07%、1.34%和0.60%，表明精密度良好。取一份鹽車前子(編號：S1)供試品溶液，于制備后0、2、4、6、10、16和24 h進樣，記錄桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、10-羥基大車前草苷、大車前苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素色譜峰峰面積，得峰面積的RSD值依次為1.04%、0.53%、1.16%、1.01%、0.74%、0.99%、1.17%、1.05%、1.31%和0.62%，表明鹽車前子供試品溶液24 h內穩(wěn)定。取鹽車前子(編號：S1)適量，按“2.2”項下方法制備鹽車前子供試品溶液6份，在上述色譜條件下檢測分析，記錄色譜峰峰面積，用外標法計算桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、10-羥基大車前草苷、大車前苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素的含量，得含量的RSD值依次為1.27%、0.93%、1.74%、1.58%、1.09%、1.21%、1.69%、1.42%、1.89%和1.08%，表明重復性良好。

2.4.3 加樣回收率試驗

取鹽車前子(編號：S1)細粉9份，每份精密稱定0.3 g，分別加入混合對照品溶液(桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、10-羥基大車前草苷、大車前苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素對照品質量濃度分別為0.259、2.748、0.067、0.651、1.865、0.428、0.171、0.332、0.057和2.109 mg/mL)0.8、1.0、1.2 mL(各平行3份)，再按“2.2”項方法制得加樣供試品溶液，在上述色譜條件下檢測，得10種成分的平均加樣回收率為98.61%、100.10%、96.89%、99.23%、100.04%、98.89%、97.69%、97.88%、96.96%和99.87%；RSD分別為1.31%、0.59%、1.27%、0.98%、0.74%、1.39%、1.46%、1.11%、1.53%和0.69%。

2.5 HPLC-QAMS質量評價模式的建立

2.5.1 相對校正因子(f)的計算

以毛蕊花糖苷為內參比物質，進樣“2.4.1”項6個混合對照品溶液，按照公式fi/s=fi/fs=(ρi/Ai)/(ρs/As)=(ρi×As)/(ρs×Ai)計算f。式中f、ρ、A、i、s依次代表相對校正因子、質量濃度、峰面積、內參比物質和其他待測成分，結果見表3。

表3 鹽車前子中各成分的f

2.5.2 相對校正因子(f)耐用性考察

分別考察了儀器及色譜柱、流速和柱溫的改變對f的影響，選用液相色譜儀(Shimadzu LC-20A型和Waters e2695型)和色譜柱(Discovery C18柱、Waters XBridge C18柱和Durashell C18柱)，流速：1.0±0.2 mL/min，柱溫：30±5 ℃等條件，取混合對照品溶液依法進樣檢測，結果儀器與色譜柱對所建立的f無影響(見表4)、流速對所建立的f無影響(見表5)、柱溫對所建立的f無影響(見表6)。

表4 不同儀器及色譜柱對f的影響

表5 不同流速對f的影響

表6 不同柱溫對f的影響

2.5.3 色譜峰定位

在上述色譜條件下，取“2.1”項下混合對照品溶液，依法進樣檢測，記錄色譜峰保留時間，采用相對保留時間值法對待測成分色譜峰進行定位，考察液相色譜儀(Shimadzu LC-20A型和Waters e2695型)和色譜柱(Discovery C18柱、Waters XBridge C18柱和Durashell C18柱)對相對保留時間值(t)的影響，結果采用相對保留時間值法可以對目標化合物色譜峰進行準確定位(見表7)。

表7 儀器及色譜柱對t的影響

2.6 含量測定

取18批鹽車前子(S1～S18)，依法制備鹽車前子供試品溶液，在上述色譜條件下進樣分析，分別運用ESM和HPLC-QAMS法計算鹽車前子中10種成分的含量(見表8)。結果兩種方法無顯著性差異(P>0.05)，表明HPLC-QAMS法可用于鹽車前子中10種成分的含量測定。

表8 鹽車前子中10種成分含量測定結果(n=3)

2.7 聚類分析(CA)

聚類分析(cluster analysis，CA)指將物理或抽象對象的集合分組為由類似的對象組成的多個類的分析過程，是通過數(shù)據(jù)建模簡化數(shù)據(jù)的一種方法。將表8中18批鹽車前子的10種成分QAMS法測定結果導入SPSS 26.0統(tǒng)計軟件，采用平均聯(lián)接(組間)法，利用Euclidean距離為樣品的測度進行聚類分析，得聚類樹狀圖(見圖2)。結果顯示，當間距為15時，18批鹽車前子樣品聚為3類，S16、S18、S17、S14、S15和S13共6批樣品聚為一類，S11、S12、S9、S10共4批樣品聚為一類，S7、S8、S1、S2、S3、S4、S5和S6共8批樣品聚為一類。

圖2 18批樣品聚類樹狀圖

2.8 主成分分析(PCA)

主成分分析(principal component analysis，PCA)是將多個變量通過線性變換以選出較少個數(shù)重要變量的一種多元統(tǒng)計分析方法。是從原始變量中導出少數(shù)幾個主成分，使它們盡可能多地保留原始變量的信息，且彼此間互不相關。將表8中QAMS法測定結果導入SPSS 26.0統(tǒng)計軟件采用降維的方式對主成分進行提取，得各主成分特征值和方差貢獻率(見表9)及成分矩陣表(見表10)。由表9可知前2個主成分特征值大于1，即6.778和1.737，對方差的貢獻率分別為67.780%和17.369%，累計方差貢獻率為85.149%，大于85%，表明選取前2個主成分即可代表鹽車前子85.149%的信息量。表10主成分矩陣可以看出第一主成分的信息來自京尼平苷酸、10-羥基大車前草苷、毛蕊花糖苷、槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素等成分的綜合，第二主成分的信息來自桃葉珊瑚苷、大車前苷和異毛蕊花糖苷的信息。同時應用統(tǒng)計軟件SIMCA 14.1建立PCA模型，18批鹽車前子樣品PCA得分圖見圖3，共提取出2個主成分R2X為0.851，大于0.5，所建立的模型穩(wěn)定性較高。從圖3可以看出，S1～S8、S9～S12以及S13～S18分別呈現(xiàn)一定關聯(lián)性。

圖3 PCA得分圖

表9 鹽車前子中主成分方差分析

表10 鹽車前子中10種成分的成分矩陣表

2.9 正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)

正交偏最小二乘法-判別分析通過對數(shù)據(jù)的分析，能夠查找出引起產(chǎn)品質量差異的特征成分，將表8中QAMS法含量數(shù)據(jù)導入SIMCA 14.1統(tǒng)計軟件，運行OPLS-DA程序得圖4，結果累積解釋能力參數(shù)(R2X、R2Y)分別為0.972和0.886，預測能力參數(shù)Q2為0.741，兩者高于0.5(50%)時所建立的模型穩(wěn)定可靠、預測能力強。由圖4可以看出18批鹽車前子的含量數(shù)據(jù)點均落在95%置信區(qū)間內，根據(jù)分布可分為3類，與聚類分析和主成分分析結果一致。

圖4 18批鹽車前子樣品的OPLS-DA模型得分圖

對所建立的OPLS-DA模型中2個主成分進行200次置換檢驗(見圖5)，結果顯示R2擬合直線Y軸截距為0.275，小于0.3，表明所建立的OPLS-DA模型結果可靠；Q2擬合直線Y軸截距為-0.694(為負數(shù))，表明所構建的OPLS-DA模型不存在過度擬合，預測能力好，可有效判別分析18批鹽車前子的質量差異。根據(jù)變量重要性投影(variable importance in projection，VIP)值篩選影響鹽車前子化學成分差異的標志性成分(見圖6)，結果VIP>1的有4個成分，即成分5(毛蕊花糖苷，VIP=1.502)、成分2(京尼平苷酸，VIP=1.441)、成分10(芹菜素，VIP=1.329)、成分4(大車前苷，VIP=1.229)對鹽車前子樣品質量的影響較大，是影響鹽車前子產(chǎn)品質量的主要潛在標志物。

圖5 OPLS-DA置換檢測結果圖

圖6 18批鹽車前子樣品的VIP圖

2.10 熵權TOPSIS(EW-TOPSIS)法分析

2.10.1 歸一化處理

表11 各指標歸一化處理結果

2.10.2 加權決策矩陣的構建

表12 加權矩陣

2.10.3 最優(yōu)與最劣方案的確定

根據(jù)加權決策矩陣得到最優(yōu)方案 Z+=max(Z1，Z2…...Zm)和最劣方案 Z-=min(Z1，Z2…...Zm)得Z+=max(0.779 0，1.441 0，0.337 0，1.229 0，1.502 0，0.863 0，0.440 0，0.750 0，0.412 0，1.329 0)，Z-=min(0，0，0，0，0，0，0，0，0，0)。

2.10.4 貼近度的計算及評價

表13 鹽車前子藥材質量評價排序

排名前6位分別是江西新干、江西吉水、江西樟樹、江西瑞昌、江西宜春和江西泰和車前子所得鹽制品，結果表明江西產(chǎn)地所得鹽車前子整體質量較好，其次為河南、安徽、山東和廣西產(chǎn)地所得鹽車前子。

3 討論與結論

3.1 供試品溶液制備

本試驗在制備供試品溶液時，首先篩選了提取溶劑：60%甲醇[2-4,7]、70%甲醇[9,14]、70%乙醇[17]，結果發(fā)現(xiàn)70%甲醇提取時，所測10種成分的提取率較高。接著對提取方式及時間進行了考察，采用超聲和加熱回流，時間分別為40、50、60、70 min，結果發(fā)現(xiàn)70%甲醇加熱回流提取60 min時，10種成分的提取率最高，雜質干擾最少。綜合考慮，最終確定以70%甲醇回流提取60 min為鹽車前子供試品最佳提取方式。

3.2 QAMS法與化學計量學結果評價

為客觀評價車前子藥材質量，選取全國5個省不同產(chǎn)地的車前子18批，統(tǒng)一按照現(xiàn)行中國藥典中鹽車前子的方法進行炮制，采用QAMS法和ESM法對18批鹽車前子中的10種成分進行定量分析檢測，同時結合化學計量學對檢測結果進行分析，結果18批不同產(chǎn)地鹽車前子中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、10-羥基大車前草苷、大車前苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素10 種化學成分含量存在一定的波動，但同一產(chǎn)地的車前子質量相對穩(wěn)定。EW-TOPSIS結果顯示，江西產(chǎn)地所得鹽車前子整體質量較好，江西省新干縣所得鹽車前子最優(yōu)解歐氏貼近度均值高于其余幾個產(chǎn)地樣品，提示江西省新干縣產(chǎn)車前子所得鹽制品整體質量較佳。

綜上，本試驗采用HPLC-QAMS法結合化學計量學及熵權TOPSIS法對不同產(chǎn)地所得鹽車前子進行了綜合質量評價，建立了鹽車前子10種指標成分定量質控模式，較已有文獻報道，增加了定量測定成分數(shù)量，同時HPLC-QAMS法有效降低了檢驗成本，有利于多指標成分定量控制模式的普及應用，并建立了化學計量學聯(lián)合熵權優(yōu)劣解距離法綜合質量評價方法，所建立的方法穩(wěn)定、準確、可行，從多方面、多角度控制該藥材質量，為其質量標準建立提供實驗基礎，也為進一步探討不同產(chǎn)地所得鹽車前子化學成分引起的藥效差異及藥材資源的合理利用提供了數(shù)據(jù)支撐。同時中藥材基原對其產(chǎn)品質量也會產(chǎn)生一定的影響，本研究選取同一基原車前子所得鹽車前子進行多指標成分定量控制以及化學計量學綜合評價，后續(xù)將收集不同基原產(chǎn)品開展進一步研究。