劉佳旭，韓倩，郭思桃，尤欣，凌雪，楊華杰，齊振雄，王永強(qiáng)*

（1.清遠(yuǎn)海貝生物技術(shù)有限公司，廣東 清遠(yuǎn) 511800；2.廣東海大集團(tuán)股份有限公司農(nóng)業(yè)農(nóng)村部微生態(tài)資源養(yǎng)殖利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 511400）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）是近年來逐步引起人們重視的一種霉菌毒素，其分布廣、危害普遍，特別是伴隨著谷物的生長(zhǎng)過程而產(chǎn)生，不易預(yù)防，多分布于大麥、小麥、玉米等谷物籽實(shí)中[1]。近期，一項(xiàng)有關(guān)食品中DON含量的調(diào)查結(jié)果表明，在大多數(shù)受檢樣品中，DON的含量超標(biāo)[2]。DON屬于單端孢霉烯族化合物，主要由某些鐮刀菌產(chǎn)生，因其能引起動(dòng)物嘔吐，故又稱嘔吐毒素（Vomitoxin）。DON是全球最常見的單端孢霉烯類霉菌毒素，盡管其不能對(duì)畜禽造成急性毒性發(fā)作，但卻能導(dǎo)致動(dòng)物生產(chǎn)性能下降，進(jìn)而造成經(jīng)濟(jì)損失。DON可導(dǎo)致動(dòng)物生產(chǎn)性能降低，采食量下降[3]，在所有家畜中，豬對(duì)DON最為敏感，當(dāng)飼料中的DON含量超過0.9 mg·kg-1時(shí)，可導(dǎo)致豬產(chǎn)生厭食、營(yíng)養(yǎng)吸收不良、體重下降及免疫系統(tǒng)變化等現(xiàn)象[4]。DON的靶器官為腸道內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞，DON釋放自由基，導(dǎo)致體內(nèi)氧化還原反應(yīng)失衡、脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞完整性或功能的損傷[5]。此外，DON還具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性和胚胎毒性，已被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）確定為最危險(xiǎn)的自然發(fā)生食品污染物之一[6]。目前，霉菌毒素的降解方法主要有三種，即物理吸附、生物降解和酶降解[7]。研究表明，DON的C12、C13位的環(huán)氧結(jié)構(gòu)和C3—OH基團(tuán)是DON的主要致毒基團(tuán)[8]。酶降解法主要是通過酶的作用破壞C12、C13位的環(huán)氧結(jié)構(gòu)及對(duì)C3位的乙?；⑻腔脱趸痆9]。本試驗(yàn)以小鼠嘔吐毒素暴露動(dòng)物模型為基礎(chǔ)，從免疫學(xué)、藥物代謝酶及機(jī)體氧化防御系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)的變化來驗(yàn)證嘔吐毒素氧化酶的應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

嘔吐毒素氧化酶（Vomitoxin oxidase，VO，由清遠(yuǎn)某公司提供；禾谷鐮刀菌，由廣東海大集團(tuán)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部微生態(tài)資源養(yǎng)殖利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自行分離和保存，用于生產(chǎn)嘔吐毒素；環(huán)磷酰胺，購自阿拉丁公司；4%多聚甲醛，購自Biosharp公司；RNA提取試劑盒購自Promega公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自TaKaRa公司；SYBR Green染料法Mix，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）試劑盒，購自南京建成生物工程研究所有限公司；D-乳酸檢測(cè)試劑盒，購自索萊寶生物科技有限公司；嘔吐毒素ELISA檢測(cè)試劑盒，購自北京華安麥科生物技術(shù)有限公司。

PDA平板：稱取4.01 g PDA培養(yǎng)基粉末，加入100 mL去離子水，121℃、20 min高壓滅菌后冷卻至60℃左右倒入培養(yǎng)皿中，制成PDA平板。

CMC產(chǎn)孢培養(yǎng)基：羧甲基纖維素15 g，磷酸二氫鉀1 g，七水硫酸鎂0.5 g，硝酸銨1 g（或硫酸銨0.5 g代替），酵母提取物1 g。加去離子水定容到1 L，高壓滅菌，室溫保存。

TBI產(chǎn)毒培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀1 g，七水硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，L-精氨酸0.871 g，七水硫酸亞鐵0.01 g，微量元素混合液1 mL，蔗糖30 g。加去離子水至1 L，0.22 μm濾器過濾滅菌，室溫保存。

微量元素混合液：檸檬酸5 g，六水硫酸鋅5 g，二水鉬酸鈉50 mg，硫酸錳50 mg，五水硫酸銅250 mg，六水硫酸亞鐵銨1 g，硼酸50 mg。加去離子水至100 mL，0.22 μm濾器過濾滅菌，4°C保存。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

50只3周齡雄性昆明小鼠及鼠糧，均購自廣州南方醫(yī)大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技發(fā)展有限公司。試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為5組，腹腔注射環(huán)磷酰胺進(jìn)行免疫抑制，將嘔吐毒素與粉碎的飼料混合均勻，隨后定型、烘干，制作成含嘔吐毒素的飼料。將液態(tài)嘔吐毒素氧化酶與嘔吐毒素飼料按照1∶1 000混合，自然風(fēng)干后進(jìn)行動(dòng)物飼喂。第1組是嘔吐毒素暴露組；第2組是嘔吐毒素暴露后用嘔吐毒素氧化酶干預(yù)，即試驗(yàn)組；第3組是環(huán)磷酰胺暴露組；第4組是環(huán)磷酰胺對(duì)照組；第5組是空白對(duì)照組。分組信息見表1。試驗(yàn)周期為30 d，其中前5 d為小鼠環(huán)境適應(yīng)期，后25 d為試驗(yàn)期。室溫控制在26℃，晝夜明暗交替12 h/12 h，小鼠自由采食、飲水。

表1 嘔吐毒素暴露試驗(yàn)小鼠分組情況

1.3 DON的生產(chǎn)

（1）取出凍存的禾谷鐮刀菌菌絲體，用接種環(huán)劃線在PDA平板中央，28℃靜置培養(yǎng)3~5 d，白色菌絲從中央向四周蔓延生長(zhǎng)，平板逐漸變?yōu)榧t色，待菌絲長(zhǎng)滿后重新劃線傳代培養(yǎng)；（2）挑取PDA平板最外面一圈白色菌絲，接入CMC產(chǎn)孢培養(yǎng)基中，28℃、180 r·min-1培養(yǎng)4~7 d即可產(chǎn)生大量孢子；（3）將培養(yǎng)好的CMC產(chǎn)孢培養(yǎng)基按2%~5%比例接入產(chǎn)毒素TBI培養(yǎng)基中，28℃、180 r·min-1培養(yǎng)10~21 d，發(fā)酵液10 000 r·min-1室溫離心15 min取上清液，利用嘔吐毒素競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒測(cè)定DON含量。

1.4 動(dòng)物霉菌毒素暴露后相關(guān)指標(biāo)的收集

1.4.1 體重

試驗(yàn)期間每天上午記錄小鼠體重，并觀察其精神狀態(tài)。

1.4.2 炎癥相關(guān)細(xì)胞因子及肝臟、腸道代謝酶基因的檢測(cè)

收集所有試驗(yàn)動(dòng)物的肝臟和小腸，液氮凍存后按照試劑盒的說明書提取RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，利用熒光定量PCR方法檢測(cè)白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）和白介素-13（IL-13）、白介素-2（IL-2）、細(xì)胞色素P4503A11（CYP3A11）、細(xì)胞色素P4501A2（CYP1A2）、醛脫氫酶1家族成員A3（ALDH1A3）、含1的己糖激酶結(jié)構(gòu)域（HKDC1）、谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶4（GSTA4）及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的表達(dá)水平，引物見表2，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)體系為：Mix 5 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，水3 μL；反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)，利用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表2 qRT-PCR引物序列

1.4.3氧化酶防御系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

表2列出了學(xué)生對(duì)學(xué)習(xí)效果、工作量和組內(nèi)表現(xiàn)等各項(xiàng)的綜合回答情況。t檢驗(yàn)表明,探究式實(shí)驗(yàn)相對(duì)于傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)提高了學(xué)習(xí)效果。此外,探究式實(shí)驗(yàn)的占分比例可合理地反映工作量,小組能很好地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)表1中問題Q3的回答表明,學(xué)生建議今后開展探究式實(shí)驗(yàn)的平均次數(shù)為1.2(95%置信區(qū)間1.1～1.3),這意味著在其后的每個(gè)年級(jí)應(yīng)開設(shè)至少一次探究式實(shí)驗(yàn)。

使用南京建成生物工程研究所的SOD、GSH和MDA試劑盒，按照說明書進(jìn)行小鼠肝臟和血清中相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.4.4 腸道通透性的檢測(cè)

處死小鼠后，心臟采血2 mL，放入含有抗凝劑的采血管中，4℃保存，根據(jù)索萊寶D-乳酸檢測(cè)試劑盒的說明書進(jìn)行血清中D-乳酸含量的檢測(cè)，用以評(píng)價(jià)小鼠腸道通透性情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)與分析

將所得數(shù)據(jù)用軟件SPSS 21進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。首先利用Shapiro-Wilk對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，隨后進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體重

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組小鼠精神狀態(tài)良好，體重測(cè)定結(jié)果見圖1。與第1組相比，第2組（試驗(yàn)組）小鼠飼喂嘔吐毒素氧化酶后體重明顯增加（P＜0.05），恢復(fù)到對(duì)照組水平（P＞0.05）。

圖1 試驗(yàn)小鼠體重

2.2 炎癥相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平

飼喂嘔吐毒素氧化酶后，肝臟中多種促炎和抑炎細(xì)胞因子表達(dá)水平下降，包括TNF-α、IL-6、IL-18、IL-10和IL-13（P＜0.05），見圖2。

圖2 炎癥相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平

2.3 肝臟和腸道代謝酶基因的表達(dá)情況

圖3 GSTA4、CYP3A11、CYP1A2在肝臟和腸道中的表達(dá)情況

飼喂嘔吐毒素氧化酶后，腸道中ALDH1A3表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05），并明顯低于正常生長(zhǎng)對(duì)照組（P＜0.05）；腸道中HKDC1的表達(dá)水平也表現(xiàn)出明顯下降（P＜0.05），恢復(fù)到正常生長(zhǎng)對(duì)照組的水平，見圖4。

圖4 ALDH1A3和HKDC1在肝臟和腸道的表達(dá)情況

2.4 氧化防御系統(tǒng)及腸道通透性相關(guān)指標(biāo)變化情況

各組動(dòng)物肝臟中氧化防御相關(guān)指標(biāo)及血液中D-乳酸的含量沒有明顯的差異，見圖5。

圖5 各組動(dòng)物肝臟中氧化防御相關(guān)指標(biāo)及血液中D-乳酸的含量

3 討 論

動(dòng)物模型是人們研究疾病的重要方法之一，本研究初步建立了小鼠嘔吐毒素暴露動(dòng)物模型。在本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，嘔吐毒素暴露的小鼠表現(xiàn)出體重下降及促炎細(xì)胞因子（TNF-α，IL-6，IL-18）的表達(dá)上調(diào)和抑炎細(xì)胞因子（IL-10和IL-18）的表達(dá)上調(diào)，說明了嘔吐毒素的效果得到體現(xiàn)，動(dòng)物表現(xiàn)出炎癥反應(yīng)。在飼喂嘔吐毒素氧化酶后，上述情況（體重下降、促炎細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)和抑炎細(xì)胞因子下調(diào)）得到明顯好轉(zhuǎn)，體重及炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05），說明小鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)得到緩解，并恢復(fù)了體重。

肝臟中代謝酶表達(dá)水平的試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，嘔吐毒素暴露后，小鼠表現(xiàn)出肝臟細(xì)胞色素P4503A11和P4501A2表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.05）。肝臟中細(xì)胞色素P4503A11與P4501A2是重要的外源物質(zhì)代謝酶[5]（Ⅰ相肝藥酶），參與機(jī)體毒素代謝，嘔吐毒素進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體后，降低其表達(dá)水平，進(jìn)而降低肝臟代謝毒素的效率，這可能是嘔吐毒素造成機(jī)體損傷的原因之一。在飼喂嘔吐毒素氧化酶后，與對(duì)照組相比，肝臟細(xì)胞色素P4501A2的表達(dá)水平有所恢復(fù)，細(xì)胞色素P4503A11的表達(dá)水平恢復(fù)到正常水平（P＞0.05），體現(xiàn)出了嘔吐毒素氧化酶提高肝臟對(duì)霉菌毒素代謝的潛力。

腸道中代謝酶表達(dá)水平試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，嘔吐毒素暴露后，小鼠表現(xiàn)出腸道細(xì)胞色素P4501A2、ALDH1A3和HKDC1表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.05）。腸道中細(xì)胞色素P4501A2和ALDH1A3均是Ⅰ相代謝酶，ALDH1A3是醛代謝最重要的酶系統(tǒng)[6]，嘔吐毒素進(jìn)入機(jī)體后主要在小腸吸收，這兩種代謝酶的上調(diào)表達(dá)可能是機(jī)體加速霉菌毒素代謝的應(yīng)答機(jī)制之一（機(jī)體減少嘔吐毒素在腸道逗留時(shí)間、加速其吸收進(jìn)入血液），也可能是嘔吐毒素導(dǎo)致機(jī)體損傷的原因之一。在飼喂嘔吐毒素氧化酶后，與模型組相比，腸細(xì)胞色素P4501A2表達(dá)水平下調(diào)，恢復(fù)到對(duì)照組水平，且ALDH1A3的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），上述兩個(gè)基因表達(dá)水平的下調(diào)降低了腸道對(duì)毒素的吸收能力，緩解了通過肝腸循環(huán)導(dǎo)致的肝臟代謝毒素的壓力。HKDC1是一種新發(fā)現(xiàn)的己糖激酶，具有維持全身葡萄糖代謝穩(wěn)態(tài)的作用[7]，在肝臟中HKDC1的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致肝臟線粒體功能障礙[8]，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，下調(diào)腸道中HKDC1的表達(dá)可以緩解腸道炎癥反應(yīng)[9]，因此，飼喂嘔吐毒素氧化酶后，與對(duì)照組相比，腸道中HKDC1表達(dá)水平下降，有助于腸道炎癥的緩解。因此，認(rèn)為嘔吐毒素氧化酶可以從恢復(fù)肝臟對(duì)嘔吐毒素的代謝、減少嘔吐毒素在腸道的吸收效率、緩解腸道炎癥等幾個(gè)方面減少嘔吐毒素對(duì)機(jī)體的損傷[10-12]。

此外，在小鼠嘔吐毒素暴露動(dòng)物模型建立的過程中，飼喂含有30 mg·kg-1和50 mg·kg-1DON的飼料36 d，各組小鼠均不會(huì)出現(xiàn)體重下降、炎癥相關(guān)細(xì)胞因子上調(diào)等現(xiàn)象，更不會(huì)表現(xiàn)出氧化防御系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)的改變。50 mg·mL-1環(huán)磷酰胺腹腔注射小鼠后，直接飼喂3 mg·kg-1DON即可達(dá)到本試驗(yàn)的結(jié)果，但氧化防御系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)也不會(huì)發(fā)生明顯的變化，這是值得進(jìn)一步關(guān)注的一個(gè)現(xiàn)象，只有在免疫抑制的條件下，嘔吐毒素才會(huì)對(duì)機(jī)體造成較為明顯的影響。在今后的研究中，將會(huì)通過加大嘔吐毒素的飼喂劑量、增加飼喂時(shí)間、進(jìn)一步降低毒素在體內(nèi)的代謝時(shí)間等方法優(yōu)化該模型，為進(jìn)一步篩選嘔吐毒素的降解方法奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

（1）飼料中添加嘔吐毒素會(huì)使動(dòng)物表現(xiàn)出炎癥反應(yīng)，嘔吐毒素氧化酶可以緩解炎癥反應(yīng)、恢復(fù)體重。

（2）嘔吐毒素氧化酶具有提高肝臟對(duì)霉菌毒素代謝的潛力。

（3）嘔吐毒素氧化酶可以通過恢復(fù)肝臟對(duì)嘔吐毒素的代謝、減少嘔吐毒素在腸道的吸收效率、緩解腸道炎癥等幾個(gè)方面來減少嘔吐毒素對(duì)機(jī)體的損傷。