全惠琳，郇 宇，胡學(xué)昱

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院：1骨科，2神經(jīng)外科，陜西 西安 710032)

下腰痛是骨科最常見的疾病之一，該病常常影響患者的生活和工作，治療棘手且花費巨大[1]。椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IDD)作為下腰痛最主要的病因之一[2]，其致病因素尚不明確，缺乏有效的治療措施且目前無法根治。椎間盤作為脊柱單元中重要的承受力結(jié)構(gòu)，由中心的髓核(nucleus pulposus，NP)、外圍的纖維環(huán)(annulus fibrosus，AF)和終板軟骨(cartilage endplate，CEP)共同組成“夾心餅干”樣結(jié)構(gòu)[3]。大量研究表明CEP是椎間盤的營養(yǎng)運輸路徑，是IDD重要的治療靶點。軟骨細胞是CEP的主要細胞類型，包埋在細胞外基質(zhì)中，由胞膜的整合素家族蛋白(尤其是整合素β1)與細胞外基質(zhì)的配體(如纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、Ⅱ型膠原等)介導(dǎo)細胞與細胞外基質(zhì)連接[48]，其中Ⅱ型膠原是CEP細胞外基質(zhì)的主要成分之一[910]，可能是CEP退變中結(jié)合整合素的重要角色。CEP退變與吸煙、異常生物力學(xué)負荷、感染等因素相關(guān)[1]，在IDD過程中外周血管入侵CEP，促進IL-6、IL-8、TNF-α等因子釋放[1112]，已被認為是導(dǎo)致IDD最主要的損傷因素之一。但是，這些細胞因子導(dǎo)致CEP退變的機制尚不可知。因此探索炎性因子誘導(dǎo)CEP退變的發(fā)病機制、尋求潛在治療手段勢在必行。褪黑素具有抑制椎間盤炎癥的功能，可以促進IL-1β和TNF-α誘導(dǎo)的退變NP細胞的細胞外基質(zhì)合成，抑制NP細胞凋亡[1314]，但具體機制仍在探索階段，而且褪黑素對CEP細胞與細胞外基質(zhì)的相互作用影響方面也缺乏相關(guān)研究。本研究擬從細胞與細胞外基質(zhì)相互作用的角度出發(fā)，探討褪黑素對IL-1β/TNF-α誘導(dǎo)CEP退變的治療作用和機制 。

1 材料與方法

1.1 材料

整合素β1(sc-374429，Santa Cruz Biotechnology，美國)；Ⅱ型膠原(ab34712，Abcam，英國)；β-actin(66009-1-Ig，Proteintech，美國)；ki67(ab15580，ab16667，Abcam，英國)；Western blotting 二抗(7076，7074，CST，美國)；熒光二抗(Alexa Fluor 488/594，Invitrogen，美國)；細胞黏附檢測試劑盒(HR8260，北京百奧萊博科技有限公司，中國)；纖維粘連蛋白(F2006，Sigma，美國)；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco，美國)；青鏈霉素混合液(Servicebio，中國)；軟骨細胞生長因子(Sciencell，美國)；2.5 g/L胰蛋白酶(Hyclone，美國)；0.2 g/L Ⅱ型膠原酶(Sigma，美國)；甲苯胺藍染液(北京索萊寶科技有限公司，中國)。4周齡雄性C57小鼠購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，實驗經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)(許可證號：IACUC-20200651)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠原代CEP細胞培養(yǎng) 實驗選用4周齡雄性C57小鼠，提取L1～L6 CEP組織，用軟骨細胞專用完全培養(yǎng)基，按組織塊培養(yǎng)法常規(guī)培養(yǎng)。置于37 ℃，50 mL/L CO2的培養(yǎng)箱中，每周換液1次。當(dāng)細胞融合度達到80%～85%時傳代(P0)，傳代至P3后進行后續(xù)實驗。

1.2.2 小鼠原代CEP細胞鑒定 將小鼠原代CEP細胞進行爬片后，滴加甲苯胺藍染液染色5 min，滴加等量蒸餾水混勻染色15 min，倒掉染液，謹慎吸取多余染液后進行鏡檢。

1.2.3 免疫熒光檢測 將細胞爬片用PBS洗3次，每次3 min；用40 mL/L多聚甲醛固定15 min，PBS清洗3次，每次3 min；5 mL/L Triton X-100室溫孵育20 min，PBS洗3次，每次3 min；吸水紙吸干液體，10 mL/L BSA封閉30 min，吸水紙吸去封閉液，不洗；每張載玻片滴加稀釋好的一抗放入濕盒，4 ℃孵育過夜。用PBST清洗爬片3次，每次3 min；吸水紙吸去多余液體后滴加稀釋好的二抗，20～37 ℃孵育1 h，用PBST洗3次，每次3 min。滴加DAPI避光孵育5 min，PBST洗4次，每次5 min，吸水紙吸去液體，用抗熒光淬滅劑的封片液封片，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.4 實驗分組 實驗分組包括對照組(無處理)、炎癥誘導(dǎo)組(10 μg/L IL-1β+10 μg/L TNF-α)[1517]、褪黑素對照組(2 μmol/L褪黑素)、褪黑素組(10 μg/L IL-1β+10 μg/L TNF-α + 2 μmol/L褪黑素)[1718]。

1.2.5 Western blotting檢測 取各組細胞加入RIPA裂解液裂解30 min，12 000 r/min離心30 min取上清，用BCA法定量檢測蛋白質(zhì)，煮沸上樣，每孔加40 μg，經(jīng)120 mL/L SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉1 h，加入稀釋的一抗過夜，TBST緩沖液洗膜，二抗室溫孵育2 h，TBST緩沖液洗膜后發(fā)光顯影。

1.2.6 細胞黏附檢測 96孔板每孔加入100 μL Fibronectin包被，將培養(yǎng)板置于2～8 ℃條件下過夜。移除包被液，洗滌液洗滌2次。4組細胞用胰酶消化，PBS洗滌2次，完全培養(yǎng)基重懸，按5×104個/孔接種，設(shè)立對照組(不棄上清)。37 ℃孵箱孵育40 min。取出培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基洗滌3次，每孔加入100 μL完全培養(yǎng)基后再加入10 μL細胞染液，37 ℃孵育2 h后行細胞黏附檢測。

2 結(jié)果

2.1 小鼠原代CEP細胞鑒定

小鼠原代CEP細胞由組織塊緩慢爬出，逐漸布滿瓶底。生長密集的地方，細胞呈鋪路石樣聚集，較稀疏的地方呈梭型。經(jīng)甲苯胺藍染色，可見胞質(zhì)呈現(xiàn)藍紫色，而胞核呈現(xiàn)較深的藍色。Ⅱ型膠原是常規(guī)鑒定軟骨細胞的方法，熒光顯微鏡下可見軟骨細胞的胞質(zhì)呈綠色，而胞核不著色(圖1)。

A：小鼠CEP細胞；B：小鼠CEP細胞甲苯胺藍染色；C：小鼠CEP細胞Ⅱ型膠原免疫熒光染色；D：小鼠CEP細胞Ⅱ型膠原DAPI染色；E：小鼠CEP細胞Ⅱ型膠原染色混合圖。標(biāo)尺為20 μm。CEP：終板軟骨。圖1 小鼠原代CEP細胞鑒定

2.2 褪黑素逆轉(zhuǎn)炎性環(huán)境對軟骨細胞整合素β1和Ⅱ型膠原表達的抑制作用

對照組中，Ⅱ型膠原染色可見軟骨細胞胞漿著亮綠色，形態(tài)飽滿，胞核不著色。但是在炎癥誘導(dǎo)組中，軟骨細胞周圍的Ⅱ型膠原分泌減少，分布稀疏。經(jīng)過統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，在炎性環(huán)境中，Ⅱ型膠原相對熒光強度降低(炎癥誘導(dǎo)組vs對照組：22.21vs41.54，P<0.01，圖2A～B)。此外，炎癥誘導(dǎo)組整合素β1的熒光強度同樣減弱(炎癥誘導(dǎo)組vs對照組：2.54vs8.20，P<0.01，圖2C～D)。經(jīng)過Western blotting檢測顯示相同的結(jié)果，炎癥誘導(dǎo)組的整合素β1(炎癥誘導(dǎo)組vs對照組：0.48vs1.06，P<0.01)和Ⅱ型膠原(炎癥誘導(dǎo)組vs對照組：0.81vs1.02，P<0.01)的表達顯著下降(圖2E～G)。上述結(jié)果提示，可能是炎性環(huán)境影響了軟骨細胞的功能，使細胞膜表面的整合素β1表達減少，同時自身分泌Ⅱ型膠原的能力減弱。已有文獻證明褪黑素可以改善退變椎間盤NP的炎性環(huán)境[19]，但是對CEP的作用尚不明確。因此，使用褪黑素刺激軟骨細胞，經(jīng)過Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，雖然對照組和褪黑素對照組之間的作用無統(tǒng)計學(xué)差異，但是褪黑素可以緩解IL-1β和TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細胞功能的降低，在炎癥誘導(dǎo)基礎(chǔ)上上調(diào)整合素β1(炎癥誘導(dǎo)組vs褪黑素組：0.48vs0.79，P<0.01)和Ⅱ型膠原(炎癥誘導(dǎo)組vs褪黑素組：0.81vs0.94，P<0.01)的表達(圖2E～G)。

A：Ⅱ型膠原免疫熒光圖(標(biāo)尺為20 μm)；B：Ⅱ型膠原相對熒光強度統(tǒng)計圖；C：整合素β1免疫熒光圖(標(biāo)尺為100 μm)；D：整合素β1相對熒光強度統(tǒng)計圖；E：Ⅱ型膠原和整合素β1 Western blotting檢測圖；F～G：Ⅱ型膠原和整合素β1的Western blotting檢測統(tǒng)計圖。bP<0.01。圖2 褪黑素逆轉(zhuǎn)炎性環(huán)境對軟骨細胞整合素β1和Ⅱ型膠原表達的抑制

2.3 褪黑素促進軟骨細胞增殖及其與細胞外基質(zhì)的黏附

ki67的免疫熒光結(jié)果顯示，炎癥誘導(dǎo)組ki67陽性細胞數(shù)相較于對照組顯著降低(炎癥誘導(dǎo)組vs對照組：0.19%vs0.82%，P<0.01，圖3)。

A：ki67免疫熒光圖(標(biāo)尺為20 μm)；B：ki67陽性細胞數(shù)統(tǒng)計圖。bP<0.01。圖3 褪黑素促進軟骨細胞增殖

同時通過Western blotting檢測，我們發(fā)現(xiàn)ki67的表達水平也顯著降低(炎癥誘導(dǎo)組vs對照組：0.41vs1.06，P<0.01)，與免疫熒光結(jié)果相符合，結(jié)果證明炎性環(huán)境中的軟骨細胞增殖能力減弱(圖4A～B)。在細胞黏附能力檢測中發(fā)現(xiàn)，炎癥誘導(dǎo)組中細胞黏附率明顯下降(炎癥誘導(dǎo)組vs對照組：0.90%vs1.43%，P<0.01，圖4C)，揭示了炎性環(huán)境可以使細胞和細胞外基質(zhì)的黏附能力減弱。此外，我們發(fā)現(xiàn)褪黑素除了可以上調(diào)整合素β1和II型膠原表達外，還可以促進軟骨細胞增殖(炎癥誘導(dǎo)組vs褪黑素組：0.41vs0.86，P<0.01)和黏附(炎癥誘導(dǎo)組vs褪黑素組：0.90%vs1.06%，P<0.01，圖4A～C)。

A：ki67 Western blotting檢測圖；B：ki67 Western blotting檢測統(tǒng)計圖；C：細胞黏附率統(tǒng)計圖。aP<0.05，bP<0.01。圖4 褪黑素促進軟骨細胞增殖及其與細胞外基質(zhì)的黏附

3 討論

IDD是困擾人們生活、工作的最常見骨科疾病，具有發(fā)病率高、治療手段有限且周期長等特點。其治療主要依賴藥物和手術(shù)[19]，不僅會產(chǎn)生高昂的治療費用[20]，而且無法從根源上解決這一難題。因此，探索IDD的病因成為目前亟待解決的臨床熱點問題。目前學(xué)者們將目光聚焦于NP的研究上，與之相比，針對CEP的研究十分稀缺。而CEP作為椎間盤的受力結(jié)構(gòu)和物質(zhì)運輸?shù)某袚?dān)者，在IDD的發(fā)生與進展中意義重大。在生理狀態(tài)下CEP無血管分布，但是退變的CEP伴隨外周血管的入侵，促進IL-6、IL-8、TNF-α等因子釋放[1112,21]加速IDD的惡化。

健康軟骨細胞包埋在細胞外基質(zhì)中，并與細胞外基質(zhì)緊密連接；當(dāng)內(nèi)環(huán)境失衡時，軟骨細胞的細胞外基質(zhì)降解，二者間的黏附能力降低。整合素主要由α和β亞基組成，廣泛存在于哺乳動物的細胞中[5]。其中，整合素β1被證實在軟骨細胞中發(fā)揮主要作用，可以與細胞外基質(zhì)的配體共同介導(dǎo)細胞黏附[5,9,2223]。Ⅱ型膠原作為軟骨細胞細胞外基質(zhì)的主要成分之一，可以同整合素β1結(jié)合介導(dǎo)軟骨細胞黏附，共同維持軟骨細胞的生理功能和活性。相關(guān)研究表明炎性環(huán)境會破壞關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)，促進其降解[2426]，進而促使細胞外基質(zhì)中的Ⅱ型膠原的表達下調(diào)。此外，整合素β1的表達水平也會受到炎癥環(huán)境的干擾，二者均影響軟骨細胞功能與狀態(tài)[4,6,16,24,27]。但是我們尚不清楚退變CEP細胞與細胞外基質(zhì)成分是否同樣受炎癥環(huán)境影響。因此，在本研究中，我們分離培養(yǎng)了小鼠原代CEP細胞，證實培養(yǎng)的細胞為軟骨細胞后，根據(jù)文獻[16]選用IL-1β和TNF-α模擬炎性環(huán)境，進行了免疫熒光和Western blotting檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過IL-1β和TNF-α刺激后的細胞Ⅱ型膠原和整合素β1的表達下調(diào)。為了探索Ⅱ型膠原和整合素β1的低表達是否會干擾CEP細胞與細胞外基質(zhì)的黏附，我們又檢測了小鼠原代CEP細胞的黏附能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-1β和TNF-α的刺激確實會弱化細胞的黏附能力。同時經(jīng)過ki67的染色發(fā)現(xiàn)，IL-1β和TNF-α降低了小鼠原代CEP細胞的增殖能力。上述結(jié)果說明，炎性環(huán)境會改變CEP細胞和細胞外基質(zhì)的黏附能力和活力。

褪黑素是一種主要由松果體分泌的激素[28]，其通過緩解炎性環(huán)境對IDD和骨關(guān)節(jié)炎均有明顯的治療作用[1718,29]。在關(guān)節(jié)軟骨的研究中，褪黑素被證明可以抑制關(guān)節(jié)軟骨IL-1β和TNF-α等促炎因子的表達[2933]。經(jīng)文獻證明，褪黑素在CEP中也發(fā)揮著類似的作用。褪黑素可以降低LPS刺激的感染模型CEP細胞中IL-1β的水平，抑制細胞外基質(zhì)的降解，上調(diào)Ⅱ型膠原的表達。同時通過影像學(xué)和組織學(xué)評分證明褪黑素能夠延緩IDD小鼠CEP退變的進展[34]。不同的是，本研究使用IL-1β和TNF-α在體外模擬CEP退變中的細胞因子浸潤環(huán)境。并且在此基礎(chǔ)上，對降解的細胞外基質(zhì)與CEP細胞的相互作用(黏附)進行探討，并在小鼠原代CEP細胞上進行了褪黑素對炎癥誘導(dǎo)的CEP退變細胞黏附作用的研究。經(jīng)過Western blotting檢測，證明褪黑素組可以減緩IL-1β和TNF-α造成的細胞整合素β1和Ⅱ型膠原的低表達，加強細胞的黏附和增殖能力。這些結(jié)論均為褪黑素治療CEP退變提供了理論支持。

雖然IL-1β和TNF-α均有促炎作用，但是二者促進CEP退變的程度值得后續(xù)探索。有研究證明，分別使用IL-1β和TNF-α刺激正常人的原代關(guān)節(jié)軟骨細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與IL-1β相比，TNF-α對軟骨細胞的損傷更加嚴(yán)重[35]。而本實驗證實了二者的聯(lián)合應(yīng)用可以誘導(dǎo)CEP細胞退變，然而IL-1β或TNF-α哪一方的作用占主導(dǎo)尚不能知曉。同理，褪黑素雖然可以抑制IL-1β和TNF-α導(dǎo)致的CEP細胞退變，但是褪黑素主要通過抑制IL-1β或TNF-α發(fā)揮保護作用的結(jié)論也不明確。普遍觀點認為褪黑素在不同疾病中均發(fā)揮抑制炎癥的作用[18,28]，也有證據(jù)表明褪黑素對TNF-α刺激的細胞損傷有更大的保護作用，而對于IL-1β刺激的細胞效果不佳[36]。這些結(jié)論提示在CEP細胞退變中，IL-1β和TNF-α對CEP細胞的損傷可能不同，IL-1β和TNF-α對褪黑素的敏感度也可能存在差異，這些差異都將作為后續(xù)實驗的關(guān)注點。

綜上所述，本研究證明IL-1β和TNF-α?xí)笴EP細胞的整合素β1和Ⅱ型膠原表達減少，同時抑制細胞增殖及黏附能力。而褪黑素可以減輕這些病理改變，上調(diào)其表達，增強細胞的增殖與黏附。雖然本研究內(nèi)容有限，但從細胞黏附的角度探討了炎性環(huán)境與CEP退變的關(guān)系，并豐富了褪黑素可以治療CEP退變的證據(jù)。后續(xù)將針對IL-1β和TNF-α二者導(dǎo)致CEP退變的機制及其對褪黑素的敏感度進行更深入的研究，探索褪黑素抑制CEP退變的具體機制，為治療IDD提供新的思路。