余河漢 陸曉華 金桂芳 楊紅

(廣東藥科大學(xué)，廣東 廣州 510006)

阿爾茨海默病(AD)是一種伴有認(rèn)知能力和學(xué)習(xí)記憶能力嚴(yán)重減退的慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積導(dǎo)致的神經(jīng)毒性是AD的致病機(jī)制之一，有研究顯示，腦中Aβ沉積聚集而成的老年斑是AD病理過程的關(guān)鍵性事件〔1〕。Aβ主要由淀粉樣蛋白前體(APP)水解產(chǎn)生，正常情況下〔2,3〕，在大腦中，Aβ可以雙向運(yùn)輸穿過血腦屏障(BBB)，其流出和流入都由極化的BBB受體和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白控制，同時 Aβ的積累不僅是由于BBB的清除率降低，而且還與循環(huán)系統(tǒng)的攝取增加有關(guān)。低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)1在大腦和肝臟中大量表達(dá)，參與大腦和Aβ的全身清除，LRP1的功能障礙可能削弱BBB的清除能力。位于內(nèi)皮腔膜的晚期糖基化終產(chǎn)物(RAGE)受體將Aβ從循環(huán)中穿梭進(jìn)入大腦進(jìn)行晚期糖基化。 因此，LRP1和RAGE被認(rèn)為是負(fù)責(zé)腦中Aβ平衡的兩個主要受體。但當(dāng)這種受體轉(zhuǎn)運(yùn)異?；駻PP基因過表達(dá)時，將引起腦內(nèi)Aβ清除減少，導(dǎo)致Aβ的異常聚集和沉積。研究發(fā)現(xiàn)〔4〕，Aβ的沉積可通過刺激細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)，導(dǎo)致終末分化的神經(jīng)細(xì)胞周期再活化而失調(diào)，促使神經(jīng)元凋亡。遠(yuǎn)志皂苷(Ten)是中藥遠(yuǎn)志的主要活性成分，研究表明〔5～7〕，Ten能抑制Aβ導(dǎo)致的神經(jīng)毒性，具有抗氧化、抗衰老、抗癡呆等作用，但作用機(jī)制不明確。本文通過研究Ten調(diào)節(jié)Aβ的轉(zhuǎn)運(yùn)清除，探討其抑制Aβ導(dǎo)致的細(xì)胞周期紊亂及細(xì)胞凋亡的神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1材料 Ten(大連美侖生物技術(shù)有限公司)；Aβ25～35(Sigma公司)；半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、Caspase-8活性檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)；兔抗鼠β-actin、羊抗兔二抗、兔抗鼠LRP1、兔抗鼠RAGE、兔抗鼠p21、兔抗鼠CyclinD1、E2F1(Abcam 公司)；羊抗兔IgG(γ-chain specific,博士德公司);M450 型 ELISA Reader 酶標(biāo)儀(美國 Bio-Rad)；水平電泳儀、垂直電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)印儀(北京百晶生物技術(shù)有限公司)；倒置顯微鏡(德國 Leica)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 將PC12細(xì)胞常規(guī)解凍并在含有10%新生胎牛血清、100%青霉素和100%鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)液中在37℃下5%CO2濕潤的環(huán)境中生長。培養(yǎng)基每周更換2～3次。待細(xì)胞豐度達(dá)80%后用0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng)，將細(xì)胞用于下一步驟。

1.3藥物處理及實驗分組 按之前的實驗〔8〕，以Aβ25～3520 μmol/L作為造模處理劑量。實驗設(shè)為對照組、Aβ組、Ten組(50、100、200、400 μmol/L)，檢測細(xì)胞活力，選取Ten 100 μmol/L作為最佳給藥劑量進(jìn)行后期實驗指標(biāo)測定。

1.4Western印跡測蛋白表達(dá) 細(xì)胞周期相關(guān)蛋白提取的樣品需按常用的血清饑餓法處理，使PC12細(xì)胞同步化于G0 期。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白提取的樣品常規(guī)處理。然后加入裂解緩沖液機(jī)械均化裂解細(xì)胞。將樣品在14 000 r/min，4℃下離心10 min，收集上清液。通過二喹啉甲酸(BCA)測定法定量蛋白質(zhì)提取物，并將其等量加載到十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠上。通過半干轉(zhuǎn)移將分離的樣品轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉溶液封閉后分別加入一抗(RAGE、LRP1、β-actin、p21、CyclinD1、E2F1)，4℃孵育過夜，TBST洗滌5次，5 min/次，在與相應(yīng)的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的IgG抗體溫育后，觀察條帶并將信號標(biāo)準(zhǔn)化為β-肌動蛋白作為內(nèi)標(biāo)，暗室進(jìn)行曝光、顯影與定影，并分析。

1.5噻唑藍(lán)(MTT)法測細(xì)胞活力 細(xì)胞按以下分組處理：新鮮完全培養(yǎng)基；Aβ組(20 μmol/L Aβ25～35)；20 μmol/L Aβ25～35+50 μmol/L Ten組；20 μmol/L Aβ25～35+100 μmol/L Ten組；20 μmol/L Aβ25～35+200 μmol/L Ten組；20 μmol/L Aβ25～35+400 μmol/L Ten組。于CO2恒溫培養(yǎng)箱持續(xù)24 h培養(yǎng)。24 h后棄去上清，將MTT(10 μl，5 mg/ml)加入每個培養(yǎng)孔中，在37℃下保持4 h。小心除去培養(yǎng)基并在每個孔中加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，置于低速搖床振蕩10 min。最后，通過使用波長為492 nm的酶標(biāo)儀評估吸光度A值。每組設(shè)置5個復(fù)孔，設(shè)不加細(xì)胞的空白調(diào)零孔，平行實驗3次，按常規(guī)公式計算，計算平均值，得出細(xì)胞存活率。

1.6RT-qPCR檢測細(xì)胞凋亡因子B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)及Caspase蛋白酶的表達(dá)水平 用Trizol提取收集的細(xì)胞總RNA，瓊脂糖凝膠電泳確定RNA完整性，紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度；RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再以適量cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)40次。引物：Caspase-3上游引物5′-GGTGGACAACATCGCTCTG-3′，下游5′-GAGACAG-ACAGTGGAACTGACGATG-3′；Caspase-8上游引物5′-GAGCTGCCAGTTTCTGTTTTG-3′，下游5′-GTTGAAGATCAGACAGTACCCC-3′；Bcl-2上游引物5′-GGTGGACAACATCGCTCTG-3′，下游5′-ACAGCC-AGGAGAAATCAAACA-3′；Bax上游引物5′-ACGCATCCACCAAGAAGC-3′，下游5′-GCCACACGGA-AGAAGACCT-3′；β-actin上游引物5′-CACTTTCTACAATGAGCTGCG-3′，下游5′-CTGGATGGCTACGTACATGG-3′。采用 2-ΔΔCt法計算基因相對表達(dá)量。

1.7Caspase-3和Caspase-8酶活力檢測 充分裂解細(xì)胞，4℃ 14 000 r/min離心15 min，把上清轉(zhuǎn)移到冰浴預(yù)冷的離心管中。按照試劑盒說明書測Caspase-3、Caspase-8的酶活性。同時取少量樣品，Bradford法測定蛋白濃度，使蛋白濃度達(dá)到1～3 mg/ml。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析，兩組間比較用t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1Ten調(diào)節(jié)Aβ誘導(dǎo)損傷后PC12細(xì)胞活力 與對照組〔(100.00±1.42)%〕相比，Aβ組PC12細(xì)胞存活率明顯降低〔(44.77±1.45)%，P<0.01〕，與Aβ組相比，不同濃度Ten對Aβ25～35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞存活率均有影響，50、100、200 、400 μmol/L Ten 藥物組的細(xì)胞存活率明顯升高〔(56.61±1.66)%、(61.97±1.65)%、(53.22±1.88)%、(46.03±1.79)%、均P<0.01〕。

2.2Ten調(diào)節(jié)Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LRP1和RAGE表達(dá) 與對照組相比，Aβ組細(xì)胞LRP1表達(dá)明顯減少，RAGE表達(dá)明顯增多(P<0.01)；與Aβ組相比，Ten組細(xì)胞LRP1表達(dá)明顯增多(P<0.01)，RAGE表達(dá)明顯減少(P<0.01)。見表1、圖1。

表1 Ten對Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞LRP1與RAGE蛋白表達(dá)的影響

圖1 Western印跡檢測LRP1與RAGE蛋白表達(dá)

2.3Ten抑制Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞周期活化 與對照組相比，Aβ組細(xì)胞p21蛋白表達(dá)明顯降低，CyclinD1和E2F1蛋白表達(dá)明顯升高(均P<0.01)；與Aβ組相比，Ten組細(xì)胞p21蛋白表達(dá)明顯升高，CyclinD1和E2F1蛋白表達(dá)明顯降低(均P<0.01)。見圖2、表2。

2.4Ten對Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞Bcl-2、Bax基因mRNA表達(dá)水平的影響 與對照組相比，Aβ組Bcl-2表達(dá)明顯下降，Bax表達(dá)明顯上升(P<0.01)；而使用Ten 干預(yù)后，Bcl-2和Bax的基因表達(dá)得到逆轉(zhuǎn)(P<0.01)。見表3。

2.5Ten對Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8 mRNA表達(dá)水平及酶活力的影響 與對照組相比，Aβ組Caspase-3和Caspase-8 mRNA表達(dá)水平明顯升高及酶活力明顯增強(qiáng)(P<0.01)，與Aβ組比較，Ten組Caspase-3和Caspase-8 mRNA表達(dá)及酶活力明顯下降(P<0.01)。見表3。

圖2 Western印跡檢測p21、CyclinD1及E2F1蛋白表達(dá)

表2 Ten對Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞p21、CyclinD1及E2F1蛋白表達(dá)的影響

表3 Ten對Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞Bcl-2與Bax mRNA表達(dá)、Casapse-3與Caspase-8 mRNA及酶活力的影響

3 討 論

AD是由多種原因共同作用導(dǎo)致的病理機(jī)制復(fù)雜的老年疾病，“Aβ沉積及其神經(jīng)毒性”被認(rèn)為是AD發(fā)病關(guān)鍵環(huán)節(jié)中的重要因素。正常情況下，腦內(nèi)Aβ的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡，而在神經(jīng)系統(tǒng)功能出現(xiàn)異常時，腦內(nèi)Aβ的清除能力降低30%，導(dǎo)致Aβ在腦內(nèi)異常集聚，損害大腦認(rèn)知功能，加劇AD病程〔9，10〕。Aβ的清除方式主要有以下四種：跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)清除、降解酶降解、小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬和細(xì)胞自噬，其中以通過BBB轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制將Aβ轉(zhuǎn)出腦組織進(jìn)入到外周血液并進(jìn)行清除為主，該途徑主要由LRP1、RAGE介導(dǎo)〔11,12〕。當(dāng)腦內(nèi)Aβ形成異常時，RAGE與LRP1的表達(dá)水平直接影響Aβ的轉(zhuǎn)運(yùn)清除〔12〕。本實驗結(jié)果顯示，Ten可以通過上調(diào)LRP1和下調(diào)RAGE的表達(dá)而加快Aβ的轉(zhuǎn)運(yùn)及清除，減少神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Aβ沉積。

在探索AD病理機(jī)制中,研究人員發(fā)現(xiàn)AD 病人腦內(nèi)的神經(jīng)元中出現(xiàn)細(xì)胞周期重啟，Aβ形成聚集沉積與細(xì)胞周期紊亂有關(guān)，研究中還發(fā)現(xiàn)周期相關(guān)蛋白的異常表達(dá)〔13～15〕，細(xì)胞周期調(diào)控異常會導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙甚至死亡。神經(jīng)細(xì)胞為終末分化細(xì)胞，正常情況下神經(jīng)細(xì)胞不再進(jìn)入細(xì)胞周期，應(yīng)該停留在G0期，異常重新進(jìn)入細(xì)胞周期便會導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的變性損傷，甚至凋亡〔16〕，而不是細(xì)胞增殖。p21是具有廣泛激酶抑制活性的細(xì)胞周期抑制蛋白，研究證實〔17〕，Aβ的過量沉積會使p21表達(dá)水平下調(diào)，接著導(dǎo)致CyclinD1表達(dá)水平上調(diào)，從而活化和結(jié)合周期蛋白依賴性蛋白激酶CDK4，形成CyclinD1/CDK4復(fù)合物，進(jìn)而磷酸化Rb，釋放E2F1，最后造成神經(jīng)細(xì)胞突破細(xì)胞周期限制點(diǎn)，異常進(jìn)入G1期。E2F1是細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活化因子，在G1至S期的調(diào)控中可直接活化許多DNA合成基因和細(xì)胞生長控制基因，能高強(qiáng)度的促使細(xì)胞進(jìn)入S期〔18～20〕。細(xì)胞周期進(jìn)程可被內(nèi)源性抑制物p21阻斷，負(fù)性調(diào)節(jié)CDKs的激活從而調(diào)控周期各時期的轉(zhuǎn)換。本實驗結(jié)果顯示，Aβ25～35誘導(dǎo) PC12細(xì)胞后，p21蛋白表達(dá)下調(diào)，CyclinD1及E2F1的蛋白均上調(diào)，該結(jié)果與上述文獻(xiàn)報道相符。而Ten作用后，可上調(diào)p21蛋白表達(dá)，下調(diào)CyclinD1及E2F1的蛋白表達(dá)，提示Ten通過負(fù)性調(diào)節(jié)CDKs 的激活而調(diào)控周期，從而抑制Aβ介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞周期活化。

Aβ具有神經(jīng)毒性，在腦內(nèi)異常聚集時，會破壞神經(jīng)元細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞通透性增加，Ca2+會大量涌入細(xì)胞內(nèi)，誘發(fā)脂質(zhì)氧化等一系列不良反應(yīng)〔21〕，進(jìn)而影響凋亡基因Bcl-2家族及Caspase家族的表達(dá)，最終引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔22,23〕，Bcl-2家族是同源編碼蛋白的大基因家族，在細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起關(guān)鍵作用，決定著細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡通路，其包括抑制凋亡的Bcl-2及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的Bax等〔24〕。Caspase家族是哺乳動物細(xì)胞凋亡的啟動者和執(zhí)行者，Caspase-3和Caspase-8則是細(xì)胞凋亡過程中的兩個重要蛋白。Caspase-3是重要的凋亡啟動蛋白，可通過多種途徑促使細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞骨架等參與凋亡所必需的重要蛋白質(zhì)降解失活，Caspase-8作為關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白,在激活后可對細(xì)胞的凋亡起到一定的促進(jìn)作用〔25〕。本實驗結(jié)果顯示，Ten能上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)促凋亡基因Bax的表達(dá)，并且抑制Caspase-3與Caspase-8表達(dá)及活性。即Ten對Aβ誘導(dǎo)的Bcl-2、Bax、Caspase-3及Caspase-8的異常表達(dá)有調(diào)控作用，能減少細(xì)胞的非正常性死亡，從而發(fā)揮對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。

Ten作為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要藥物，具有益智、抗癡呆作用，大量研究表明，Ten可改善AD小鼠認(rèn)知功能和學(xué)習(xí)記憶能力〔26～29〕，提高細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力〔30〕，減少Aβ分泌及沉積，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。但其作用機(jī)制還有待研究。本研究表明，Ten對Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷及凋亡具有很好的保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過加快Aβ的轉(zhuǎn)運(yùn)清除，減少細(xì)胞內(nèi)Aβ的沉積，阻滯神經(jīng)細(xì)胞周期的再活化而導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程。本結(jié)果為Ten多靶點(diǎn)抗AD藥物的研究提供了實驗依據(jù)。