董軍立 賈誠(chéng)謙 姚憲寶 苗二芽 蔡毅 楊夏晴

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院疼痛科,湖北 武漢 430014)

下腰痛的發(fā)病率隨著人口老齡化的加劇逐漸上升，給人們的生活質(zhì)量和社會(huì)醫(yī)療帶來(lái)了極大的影響〔1〕。椎間盤(pán)退變是誘發(fā)下腰痛的重要原因，椎間盤(pán)包括外層的結(jié)締組織和內(nèi)層的髓核，髓核細(xì)胞的減少和過(guò)度凋亡可使椎間盤(pán)退變進(jìn)程加快〔2,3〕。而髓核細(xì)胞內(nèi)白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α等促炎因子的異常產(chǎn)生能夠誘導(dǎo)細(xì)胞大量凋亡，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白聚糖(aggrecan)和Ⅱ型膠原蛋白(collagen Ⅱ)的表達(dá)降低，從而加速椎間盤(pán)退變〔4,5〕。此外，自噬是一種分解代謝過(guò)程，可以通過(guò)降解溶酶體中的細(xì)胞內(nèi)底物來(lái)應(yīng)對(duì)缺氧、氧化應(yīng)激和營(yíng)養(yǎng)應(yīng)激，從而維持細(xì)胞活力和穩(wěn)態(tài)。自噬參與了椎間盤(pán)退變的發(fā)病機(jī)制，包括炎癥刺激和細(xì)胞凋亡〔6〕。二甲雙胍是廣泛應(yīng)用于Ⅱ型糖尿病臨床治療的雙胍類藥物，能夠明顯降低早期糖尿病患者發(fā)展成胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。研究表明，二甲雙胍不僅能通過(guò)蛋白磷酸酶(PP)2A/蛋白激酶B(Akt)通路抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)衰老〔7〕，也能通過(guò)腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)途徑促進(jìn)自噬、保護(hù)心肌細(xì)胞免受氧糖剝奪誘導(dǎo)的凋亡和損傷〔8〕，還能通過(guò)抑制Src/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)3通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡〔9〕。然而，二甲雙胍在人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞中的作用尚不清楚。因此，本研究將使用IL-1β誘導(dǎo)人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞，探討二甲雙胍對(duì)人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞凋亡和自噬的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及主要試劑、儀器 人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞，由美國(guó)ScienCell公司提供；二甲雙胍，購(gòu)自武漢豐泰威遠(yuǎn)科技有限公司；Akt/糖原合成酶激酶(GSK)3β/β-連環(huán)蛋白(β-Catenin)通路抑制劑MK2206，購(gòu)自上海芮暉化工科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、噻唑藍(lán)(MTT)試劑及Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，購(gòu)自北京索萊寶公司；hochest 33258染色試劑盒，購(gòu)自北京中科瑞泰生物科技有限公司；IL-1β、IL-6、TNF-α檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自上海通蔚實(shí)業(yè)有限公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3、促凋亡蛋白Bax、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)、aggrecan、collagen Ⅱ、微管相關(guān)蛋白1輕鏈(LC)3B、自噬相關(guān)蛋白(p62、Atg7、Beclin1)、Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β、β-Catenin抗體及相應(yīng)二抗，購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱，購(gòu)自Bio-Rad公司；酶標(biāo)儀，購(gòu)自Thermo公司；流式細(xì)胞儀，購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞復(fù)蘇后，置于DEME培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)上，37℃，在含5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%左右，加入適量胰蛋白酶進(jìn)行消化，并傳代培養(yǎng)。將第三代人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞采用10 ng/ml IL-1β誘導(dǎo)，然后隨機(jī)分組為IL-1β組、IL-1β+低濃度二甲雙胍(40 μg/ml)組、IL-1β+中濃度二甲雙胍(80 μg/ml)組、IL-1β+高濃度二甲雙胍(160 μg/ml)組、IL-1β+高濃度二甲雙胍+MK2206(10 μmol/L Akt/GSK3β/β-Catenin通路抑制劑MK2206〔10〕)組，上述各組分別于培養(yǎng)基中加入相應(yīng)濃度試劑，另使用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞作為Control組。

1.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 在經(jīng)過(guò)處理后的各組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞中分別加入10 μl MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞在450 nm波長(zhǎng)下的吸光度值。

1.4hochest 33258法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將各組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞采用多聚甲醛進(jìn)行固定，然后使用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗后，加入hochest 33258染色試劑，遮光反應(yīng)5 min，在熒光顯微鏡下觀察到的染色質(zhì)濃縮和核碎裂突出的為凋亡細(xì)胞，呈現(xiàn)亮藍(lán)色，而正常細(xì)胞核表現(xiàn)為淡藍(lán)色。含有凋亡細(xì)胞核的細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞總數(shù)的百分比為細(xì)胞凋亡率。

1.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)炎癥因子水平 將各組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞進(jìn)行消化、裂解、離心后，收集上清液，使用ELISA檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-α水平，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法檢測(cè)細(xì)胞自噬水平 各組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞清洗后，將GFP-LC3質(zhì)粒利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞，24 h后，棄去培養(yǎng)基，按照1.2的方法處理各組細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)后進(jìn)行清洗、固定，然后加入二脒基苯基吲哚(DAPI)，在37℃下靜置染色10 min，對(duì)激光共聚焦顯微鏡下觀察到的自噬體(一個(gè)綠色熒光斑點(diǎn)為一個(gè)自噬體)進(jìn)行拍照并計(jì)數(shù)。

1.7Western印跡檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá)水平 提取各組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞總蛋白，取適量蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜后封閉1 h，加入稀釋過(guò)的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶caspase-3、Bax、Bcl-2、aggrecan、collagen Ⅱ、LC3B、p62、Atg7、Beclin1、Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β、β-Catenin抗體，繼續(xù)孵育24 h，然后加入對(duì)應(yīng)的二抗稀釋液，1.5 h后進(jìn)行顯色反應(yīng)并分析其蛋白表達(dá)水平。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1二甲雙胍對(duì)各組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞活性的影響 與Control組〔(100.00±2.14)%〕相比，IL-1β組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞活性〔(41.25±1.23)%〕顯著下降(P<0.05)；IL-1β+低濃度二甲雙胍組〔(53.06±1.45)%〕、IL-1β+中濃度二甲雙胍組〔(67.89±1.77)%〕、IL-1β+高濃度二甲雙胍組〔(79.68±1.84)%〕人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞活性顯著高于IL-1β組(P<0.05)，且呈濃度依賴性；而與IL-1β+高濃度二甲雙胍組比較，IL-1β+高濃度二甲雙胍+MK2206組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞活性〔(44.51±1.36)%〕明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2二甲雙胍對(duì)各組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞凋亡的影響 Control組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞的細(xì)胞核被染成淡藍(lán)色；IL-1β組大部分細(xì)胞核被染成亮藍(lán)色，細(xì)胞凋亡率相比Control組顯著升高，caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與IL-1β組相比，IL-1β+低濃度二甲雙胍組、IL-1β+中濃度二甲雙胍組、IL-1β+高濃度二甲雙胍組細(xì)胞凋亡率依次降低，caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平依次下降，Bcl-2蛋白表達(dá)水平依次升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與IL-1β+高濃度二甲雙胍組比較，IL-1β+高濃度二甲雙胍+MK2206組細(xì)胞凋亡率顯著升高，caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖1、表1、圖2。

2.3二甲雙胍對(duì)各組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞炎性因子的影響 IL-1β組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞中IL-6、TNF-α表達(dá)量顯著高于Control組(P<0.05)；與IL-1β組相比，IL-1β+低濃度二甲雙胍組、IL-1β+中濃度二甲雙胍組、IL-1β+高濃度二甲雙胍組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞中IL-6、TNF-α表達(dá)量呈濃度依賴性降低(P<0.05)；而與IL-1β+高濃度二甲雙胍組比較，IL-1β+高濃度二甲雙胍+MK2206組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞中IL-6、TNF-α表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

圖1 各組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞凋亡(hochest 33258,×200)

表1 二甲雙胍對(duì)各組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞凋亡的影響

1～6:Control組、IL-1β組、IL-1β+低濃度二甲雙胍組、IL-1β+中濃度二甲雙胍組、IL-1β+高濃度二甲雙胍組、IL-1β+高濃度二甲雙胍+MK2206組；圖3、5、6同圖2 各組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較

2.4二甲雙胍對(duì)各組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞aggrecan、collagen Ⅱ蛋白表達(dá)的影響 與Control組比較，IL-1β組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞中aggrecan、collagen Ⅱ蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)；與IL-1β組相比，IL-1β+低濃度二甲雙胍組、IL-1β+中濃度二甲雙胍組、IL-1β+高濃度二甲雙胍組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞中aggrecan、collagen Ⅱ蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，且IL-1β+低濃度二甲雙胍組

表2 二甲雙胍對(duì)各組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞炎性因子及aggrecan、collagen Ⅱ蛋白表達(dá)的影響

2.5二甲雙胍對(duì)各組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞自噬的影響 Control組呈現(xiàn)極少的點(diǎn)狀聚集的自噬體；與Control組相比，IL-1β組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞自噬體數(shù)明顯增加，LC3B、Atg7、Beclin1蛋白表達(dá)水平明顯升高，p62蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與IL-1β組相比，IL-1β+低濃度二甲雙胍組、IL-1β+中濃度二甲雙胍組、IL-1β+高濃度二甲雙胍組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞自噬體數(shù)依次減少，LC3B、Atg7、Beclin1蛋白表達(dá)水平依次降低，p62蛋白表達(dá)水平依次升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與IL-1β+高濃度二甲雙胍組比較，IL-1β+高濃度二甲雙胍+MK2206組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞自噬體數(shù)明顯增加，LC3B、Atg7、Beclin1蛋白表達(dá)水平明顯增加，p62蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖4、表3、圖5。

圖3 各組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞aggrecan、collagen Ⅱ蛋白表達(dá)比較

圖4 各組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞自噬(DAPI，×200)

2.6二甲雙胍對(duì)各組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞Akt/GSK3β/β-Catenin信號(hào)通路的影響 IL-1β組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β比值明顯低于Control組，β-Catenin蛋白表達(dá)水平明顯高于Control組(P<0.05)；與IL-1β組相比，IL-1β+低濃度二甲雙胍組、IL-1β+中濃度二甲雙胍組、IL-1β+高濃度二甲雙胍組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β比值依次升高，β-Catenin蛋白表達(dá)水平依次降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；IL-1β+高濃度二甲雙胍+MK2206組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β比值明顯低于IL-1β+高濃度二甲雙胍組，β-Catenin蛋白表達(dá)水平明顯高于IL-1β+高濃度二甲雙胍組(P<0.05)，見(jiàn)圖6、表4。

表3 二甲雙胍對(duì)各組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞自噬的影響

圖5 各組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較

圖6 各組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞Akt/GSK3β/β-Catenin信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較

表4 二甲雙胍對(duì)各組人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞Akt/GSK3β/β-Catenin信號(hào)通路的影響

3 討 論

研究〔11〕發(fā)現(xiàn)，椎間盤(pán)退變的影響因素甚多，主要包括年齡、壓力等外界因素及遺傳、氧化應(yīng)激、炎癥因子等內(nèi)在因素，其作用機(jī)制十分復(fù)雜。目前主要通過(guò)藥物治療和外科手術(shù)來(lái)治療椎間盤(pán)退變疾病，但并不能從根源上消除患者的病痛〔12〕。

研究〔13〕表明，髓核細(xì)胞的活性降低與凋亡增加是誘發(fā)椎間盤(pán)退變的重要原因。IL-1β是研究較為廣泛的促炎因子。Zhu等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β能誘導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡，同時(shí)促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase 3表達(dá)上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)。Liu等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β誘導(dǎo)抑制aggrecan、collagen Ⅱ表達(dá)，促進(jìn)IL-6、TNF-α表達(dá)。而當(dāng)且椎間盤(pán)發(fā)生退變時(shí)，其髓核細(xì)胞內(nèi)的aggrecan、collagen Ⅱ蛋白表達(dá)降低。本研究通過(guò)IL-1β誘導(dǎo)人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，IL-1β可抑制人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡和炎癥反應(yīng)，加快椎間盤(pán)退變進(jìn)程。二甲雙胍已被證實(shí)能夠通過(guò)調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)抑制宮頸癌〔16〕、結(jié)腸癌〔17〕、胃癌〔18〕細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡。本研究結(jié)果說(shuō)明二甲雙胍能夠促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)的人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞增殖，抑制其凋亡和炎癥反應(yīng)，并減緩椎間盤(pán)退變進(jìn)程。

自噬是細(xì)胞程序性死亡的一種方式，可與凋亡協(xié)同作用加速腫瘤細(xì)胞死亡。同時(shí)，自噬也是一種重要的細(xì)胞內(nèi)分解代謝過(guò)程，在炎癥、營(yíng)養(yǎng)剝奪和應(yīng)激條件下，通過(guò)降解和回收受損成分、有毒蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，有助于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)量控制和維持細(xì)胞生存〔19〕。自噬降解凋亡蛋白來(lái)調(diào)節(jié)各種疾病的進(jìn)展，如癌癥、神經(jīng)退行性疾病〔20〕和骨關(guān)節(jié)炎〔21〕。正常情況下，自噬對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用，但過(guò)度自噬會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。研究〔22〕表明，LC3B、Atg7、p62、Beclin1是自噬標(biāo)志蛋白，細(xì)胞受到刺激發(fā)生損傷時(shí)會(huì)增加其自噬水平，進(jìn)一步提高LC3B、Atg7、Beclin1表達(dá)并降低p62表達(dá)。Saladini等〔23〕研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍能夠通過(guò)抑制自噬發(fā)揮抗乳腺癌和宮頸癌的作用。然而，二甲雙胍在人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞自噬中的作用仍不清楚。本研究結(jié)果提示二甲雙胍對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞自噬有保護(hù)作用。

已有研究〔24〕表明，前葉素能夠通過(guò)激活A(yù)kt/GSK3β/β-Catenin途徑促進(jìn)成骨，抑制破骨細(xì)胞分化。通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路增強(qiáng)椎間盤(pán)退變細(xì)胞自噬，可顯著降低IL-6、IL-1β、TNF-α的表達(dá)水平，抑制衰老和細(xì)胞凋亡〔20，25〕。MK2206是Akt抑制劑，會(huì)致使Akt及其下游基因GSK3β磷酸化水平降低，同時(shí)使β-Catenin表達(dá)升高〔26〕。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β誘導(dǎo)后人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞Akt、GSK3β磷酸化水平顯著降低，β-Catenin蛋白表達(dá)水平明顯升高；低、中、高濃度二甲雙胍能夠使人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞Akt、GSK3β磷酸化水平依次升高，β-Catenin蛋白表達(dá)水平依次降低；而MK2206的加入則能使Akt、GSK3β磷酸化、β-Catenin蛋白表達(dá)水平得到逆轉(zhuǎn)。此外，抑制Akt/GSK3β/β-Catenin通路會(huì)逆轉(zhuǎn)二甲雙胍對(duì)人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥因子及自噬的調(diào)控作用。揭示，二甲雙胍能夠通過(guò)激活A(yù)kt/GSK3β/β-Catenin信號(hào)通路促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)的人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞增殖、抑制凋亡、自噬。

綜上所述，二甲雙胍可促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)的人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞增殖并抑制其凋亡、炎癥反應(yīng)及自噬，進(jìn)而減緩椎間盤(pán)退變進(jìn)程，其機(jī)制與Akt/GSK3β/β-Catenin信號(hào)通路的激活有關(guān)，二甲雙胍有望成為治療椎間盤(pán)退變疾病的靶向藥物。