張黎軍 趙盼盼 徐志秀 王凡 王朔 任靜 袁彬 吉四輩

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科二病區(qū)，河南 衛(wèi)輝 453100)

阿爾茨海默病(AD)是老年常見的因中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變導(dǎo)致的慢性癡呆類型疾病，主要的臨床表現(xiàn)有失語失認(rèn)、記憶障礙、視空間能力損害、計算力損害及人格和行為改變等〔1,2〕。AD常發(fā)生于65歲以上的老年人群，在我國每100萬人中有3～7萬AD患者，發(fā)病患者多為女性，在我國每年約有將近700萬AD患者，發(fā)病率較高，且隨年齡的增長患AD概率增加，且85歲后AD的患病率可高達30%〔3,4〕。在AD患者腦內(nèi)的老年斑周圍存在大量的星形膠質(zhì)細(xì)胞聚集〔5〕。本文研究星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移對AD的發(fā)病機制及其治療的作用。

1 材料與方法

1.1材料 研究動物：選取10只48 h內(nèi)的SD級乳鼠，雄雌各一半，由普萊柯生物工程有限公司提供(動物許可證號：SYXK(豫)2020-0002)，體重263～318 g，平均體重(290.50±13.75)g。本實驗經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。主要試劑：磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌液購于上?？道噬锟萍加邢薰荆籇MEM/F12培養(yǎng)基購于上海研謹(jǐn)生物科技有限公司；蛋白磷酸酶(PP)2A活性檢測試劑盒購于上海哈靈生物科技有限公司；鈣外液購于北京百奧萊博科技有限公司；Transwell小室購于康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司；Giemsa染料購于上海谷研實業(yè)有限公司；p38、p-p38、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9抗體購于武漢益普生物科技有限公司。

1.2星形膠質(zhì)細(xì)胞模型建立 酒精消毒后將乳鼠斷頸處死，迅速取出其整個大腦并放置在平皿中，使用PBS洗滌至洗滌液透亮后取出大腦的皮層組織并剝離血管膜，剪碎皮層組織加入0.125%胰蛋白酶放置在37℃消化15 min并每隔3 min搖晃1次，待組織完全消化后，加入含有10%胎牛血清、100 U/ml雙抗的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化并過篩后離心10 min，加入適量的細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中放置在37℃搖床上培養(yǎng)過夜；將分離培養(yǎng)的細(xì)胞到96孔板通過免疫熒光實驗檢測膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)，對細(xì)胞進行固定：使用PBS清洗后將4%多聚甲醛分別加入每孔中并固定15～20 min，細(xì)胞透膜，使用PBS漂洗后在每孔分別加入0.2% 100 μl TritonX-100，室溫透膜15 min，對細(xì)胞進行封閉，使用PBS漂洗后加入3% 100 μl牛血清白蛋白室溫封閉30 min后加入一抗：將1% 100 μl BSA 1∶2 000稀釋的GFAP放置在4℃環(huán)境下過夜孵育，隨后加入使用PBS緩沖液稀釋的二抗山羊抗兔IgG H&L并放置在室溫避光環(huán)境下孵育1～2 h，將二抗洗丟后使用激光共聚焦顯微鏡拍照觀察，符合星形膠質(zhì)細(xì)胞的特征，鑒定為星形膠質(zhì)細(xì)胞；更換新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)至第2代時進行后續(xù)實驗。

1.3分組 將星膠質(zhì)細(xì)胞按實驗要求分為對照組、抑制組和激活組，1×105個/ml為細(xì)胞濃度，并在抑制組和激活組分別添加15 nmol/L PP2A抑制劑廣譜基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(DES)、激活劑大鼠骨激活素(OA)，在對照組中添加等量二甲基亞砜(DMSO)，將各組細(xì)胞均放置在37℃環(huán)境下培養(yǎng)。

1.4PP2A酶活性檢測 在各組細(xì)胞中加入放射免疫沉淀試驗(RIPA)細(xì)胞裂解液并放置在冰上裂解20 min，將裂解液轉(zhuǎn)移到EP管中4℃離心10 min(15 000 r/min)，按照二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒檢測提取蛋白濃度，取50 μg蛋白樣品，按照PP2A活性檢測試劑盒檢測樣品中PP2A活性，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值，計算樣品中PP2A活性，實驗重復(fù)3次，取均值。

1.5各組細(xì)胞鈣離子濃度變化評價 采用鈣離子熒光探針技術(shù)(Fura-2/AM)檢測鈣離子濃度變化，將星形膠質(zhì)細(xì)胞傳代至玻片且密度在50%；棄去每個培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基，使用鈣外液清洗3次，每次5 min后在其中加入1 ml鈣外液及2 μl Fura-2/AM放置在避光環(huán)境下于37℃恒溫孵育30 min后再次使用鈣外液清洗3次，每次5 min，備用；將玻片放置在實驗皿中并使用小砝碼將其固定后將實驗皿固定在倒置熒光顯微鏡載物臺，將1 ml鈣外液加入皿中，使用顯微鏡觀察細(xì)胞，并選取好的視野作為檢測對象，通過軟件選中數(shù)個細(xì)胞，以340、380 nm分別激發(fā)光，實時檢測并每秒記錄1張ROIs的F340/F380熒光比值圖像，以F340/F380的熒光比值間接表示星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的變化，同一實驗取不同批次的細(xì)胞重復(fù)3次以上。

1.6各組細(xì)胞遷移、侵襲能力比較 細(xì)胞遷移、侵襲采用Transwell小室檢測，將星膠質(zhì)細(xì)胞用胰蛋白酶消化并在其中加入1%胎牛血清細(xì)胞懸液，再在Transwell小室的上室中加入500 μl細(xì)胞懸液并在Transwell小室的下室中加入10% 700 μl胎牛血清細(xì)胞培養(yǎng)液后將小室放置在12孔板放置在37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，去除多余的細(xì)胞并濾膜后使用甲醛固定5 min于25℃ 使用Giemsa染料染色15 min，8 h后使用顯微鏡觀察細(xì)胞遷移、侵襲的數(shù)目，實驗重復(fù)3次，取均值。

1.7各組細(xì)胞p38信號通路因子表達量 采用實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)測定各組細(xì)胞中p38通路因子表達量,cDNA合成反轉(zhuǎn)錄體積20 μl，其中4 μl 總RNA，1 μl(0.5 μg)隨機引物、0.5 μl(20 U)RNase、2 μl(10 U)MdNTP、0.8 μl(15 U)M-MLV反轉(zhuǎn)錄10×RT緩沖液3 μl，加滅菌DDW至20 μl，42℃水浴1 h，95℃ 5 min滅活M-MLV逆轉(zhuǎn)錄，-30℃凍存?zhèn)溆?。PCR體系：PCR體積20 μl,其中2 μl 10×緩沖液，2 μl氯化鎂(Mgcl2)，2 μl dNTP，2 μl cDNA，2 μl引物，2.5 U Taq DNA多聚酶，滅菌DDW加至20 μl。PCR條件：經(jīng)95℃預(yù)變性10 min；95℃，15 s；60℃，30 s；循環(huán)40次。采用2-△△Ct法計算出細(xì)胞中p38通路因子p38、p-p38、MMP-2、MMP-9表達量。p38：上游：5′-GAACAAGACCGTCTGGGAGGTGC-3′，下游：5′-TTGGCGTGAATGATGGACTG AAA-3′；p-p38：上游：5′-CCATTATACGCACGACA ACG-3′，下游：5′-CATTCTGACACCGTGTGACC-3′；MMP-2：上游：5′-CAGGACATTGTCTTGATGGCATC GC-3′，下游：5′-TGAAGAAGTAGCTATGACCACCGC C-3′；MMP-9：上游：5′-AAAGGTCGCTCGGATGGTTATC-3′，下游：5′-TACTCTTGCCCAGGAAGACGAA-3′；β-actin：上游：5′-CTGGCATTGTCATGGACTCT-3′，下游：5′-GCGATGATCTTGATCTTCAT-3′。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞PP2A活性比較 激活組PP2A活性(135.94±6.82)明顯高于對照組(95.36±4.21)，抑制組(43.82±2.07)明顯低于對照組；激活組細(xì)胞PP2A活性明顯高于抑制組(均P<0.05)。

2.2各組細(xì)胞鈣離子濃度變化比較 激活組(46.27±16.28)細(xì)胞鈣離子濃度變化幅度明顯高于對照組(34.58±11.09)，抑制組(24.16±5.29)細(xì)胞鈣離子濃度變化幅度明顯低于對照組；激活組細(xì)胞鈣離子濃度變化幅度明顯高于抑制組(均P<0.05)。

2.3各組細(xì)胞遷移、侵襲能力比較 激活組細(xì)胞遷移、侵襲能力明顯強于對照組，抑制組細(xì)胞遷移、侵襲能力明顯弱于對照組(P<0.05)；激活組細(xì)胞遷移、侵襲能力明顯強于抑制組(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 各組細(xì)胞遷移、侵襲能力比較

圖1 各組細(xì)胞遷移、侵襲能力(結(jié)晶紫染色，×400)

2.4各組細(xì)胞p38信號通路因子表達量比較 激活組p38、p-p38、MMP-2、MMP-9 mRNA因子表達量明顯低于對照組，抑制組p38、p-p38、MMP-2、MMP-9 mRNA因子表達量明顯高于對照組(P<0.05)；激活組p38、p-p38、MMP-2、MMP-9 mRNA因子表達量明顯低于抑制組(P<0.05)。見表2。

表2 各組p38信號通路因子表達量比較

3 討 論

AD受生活方式、環(huán)境、基因等多種因素的影響，其中部分基因也可引起此病〔6～8〕。當(dāng)患者出現(xiàn)注意力難以集中、記憶力或思維能力減退、幻覺、錯覺等主要癥狀，影響正常生活和工作時應(yīng)及時治療，患者家屬應(yīng)對其更加照顧，防止患者出現(xiàn)生命危險〔9〕。目前臨床上常用藥物治療，包括石杉堿甲、多奈哌齊、卡巴拉汀等可提高腦內(nèi)乙酰膽堿水平，加強突觸傳遞。PP2A屬于多功能性酶，對真核細(xì)胞中大部分的磷酸化酶有調(diào)節(jié)作用，此外，還可調(diào)節(jié)特定信號通路〔10,11〕。有研究證實PP2A激活劑可有效改善神經(jīng)損傷。星形膠質(zhì)細(xì)胞廣泛存在于哺乳動物腦內(nèi)，用經(jīng)典的金屬浸鍍技術(shù)顯示此類膠質(zhì)細(xì)胞呈星形，從胞體發(fā)出許多長而分支的突起，伸展充填在神經(jīng)細(xì)胞的胞體及其突起之間，起著支持和分隔神經(jīng)細(xì)胞的作用〔12,13〕。

PP2A底物為眾多體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶，在大部分果蠅和小鼠的動物模型實驗中顯示PP2A對細(xì)胞的生長發(fā)育起著調(diào)控作用，還可與其他磷酸化酶和激酶在信號傳導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)中相互作用，還對下游信號有調(diào)節(jié)作用，其中催化亞基活性主要由轉(zhuǎn)錄水平磷酸化和甲基化的狀態(tài)調(diào)控〔14～16〕。在諶勤等〔17〕研究中，激活PP2A活性可降低Tau蛋白的磷酸化水平，提高突出相關(guān)蛋白表達水平起到修復(fù)受損神經(jīng)元的功能。在黃惠麗等〔18〕的研究中，PP2A與血流動力學(xué)和心肌細(xì)胞相關(guān)，若抑制PP2A活性可有效改善心功能。

p38信號通路是經(jīng)典信號通路之一，其中p38是絲裂原活化蛋白激酶，在宮頸瘤、卵巢瘤、淋巴瘤等腫瘤中起作用，在細(xì)胞凋亡、增殖等生物學(xué)行為及細(xì)胞周期中呈特異性表達，且在不同腫瘤中所起的作用也各不相同，甚至作用完全相反〔19,20〕。MMP-2由17個外顯子組成其基因組且位于16q12.2，大小約為3 416 bp；該基因約含660個氨基酸殘基，蛋白質(zhì)大小約73 882 D，可降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白并傳遞信號，可作用于非基質(zhì)蛋白質(zhì)，還可促進血管收縮MMP-2基因C端非催化片段具備抗血管生成腫瘤等特性〔21〕。MMP-9是以酶原形式從胞內(nèi)分泌到胞外，通過有機汞制劑反應(yīng)可具有活性，在體內(nèi)則可經(jīng)一系列蛋白酶級聯(lián)而激活〔22〕。

綜上，PP2A激活劑通過下調(diào)p38、p-p38、MMP-2、MMP-9 mRNA因子表達量，進而抑制p38信號通路，促進星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移。