伍玥 祁亞賓 張延瑞 朱文亮 周勝理 丁松澤

(河南省人民醫(yī)院 1消化內(nèi)科，河南 鄭州 450000；2重癥醫(yī)學(xué)科；3病理科)

食管癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，是一種下咽至食管胃結(jié)合之間來源于食管上皮的癌癥，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性吞咽困難、背痛、胸骨后疼痛等〔1,2〕。我國(guó)食管癌發(fā)生率位于世界前列，且隨著發(fā)展帶來的環(huán)境問題，導(dǎo)致食管癌發(fā)生率呈上升趨勢(shì)，中老年人、飲食不良者、有惡性腫瘤家族史者為食管癌的高發(fā)人群，食管癌晚期死亡率高、預(yù)后差，嚴(yán)重威脅患者健康〔3～5〕。及早發(fā)現(xiàn)并干預(yù)治療對(duì)提高食管癌患者預(yù)后意義重大。大蒜素是從大蒜中提取的有機(jī)硫化合物，是一種廣譜抗菌藥，具有消炎、降血脂、抑制癌細(xì)胞的作用〔6,7〕。本文分析大蒜素對(duì)食管癌模型大鼠Wnt/β-catenin通路的影響，旨在探討食管癌是否通過Wnt/β-catenin通路干預(yù)食管癌的發(fā)生發(fā)展。

1 材料與方法

1.1材料 選取60只健康雄性大鼠〔北京北生研生物制品有限公司，使用許可證號(hào)：SYXK(京)2016-0051〕，鼠齡10～12 w，平均(8.6±1.2)w；體重320～343 g，平均(227.9±9.6)g。所有大鼠于(21.6±2.4)℃環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。本研究獲河南省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。主要試劑：兔抗大鼠細(xì)胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)抗體(Gibco公司)；小鼠抗大鼠鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCCAg)抗體(Invitrogen公司)；兔抗大鼠SCCAg、內(nèi)參CAPDH抗體(Selleck公司)；小鼠抗兔CD3+抗體(Sigma公司)；大鼠抗小鼠CD4+(BD公司)；小鼠抗兔CD8+抗體(Dako公司)；大鼠抗小鼠Wnt5a、β-連環(huán)蛋白(catenin)抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2建模及分組 60只健康雄性大鼠，隨機(jī)選取15只為正常組，其余45只建立食管癌大鼠模型，大鼠頸背部皮下注射甲基芐基亞硝胺(NMBA)，10 mg/kg，2次/w，連續(xù)干預(yù)18 w，大鼠瘤體總體積大于30 mm3說明建模成功，最終43只大鼠建模成功，隨機(jī)分為模型組15只，低劑量組、高劑量組各14只，低劑量組大鼠給予10 mg/kg大蒜素灌胃處理，高劑量組給予20 mg/kg大蒜素灌胃處理，正常組、模型組不做處理，連續(xù)干預(yù)10 w，觀察效果。

1.3指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1大鼠病理改變觀察 取各組大鼠靜脈血4 ml,3 000 r/min離心10 min，離心半徑5 cm，-29℃保存。麻醉各組大鼠后斷頸處死，剝離食管組織，記錄腫瘤發(fā)生情況，游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體長(zhǎng)徑(a)、短徑(b)，計(jì)算瘤體總體積(V)，V=ab2π/6；觀察并記錄體積大于1 mm3的瘤體個(gè)數(shù)，并稱取瘤體總質(zhì)量。將剝離的食管組織，4%甲醛中固定，石蠟包埋保存，以便后續(xù)檢測(cè)。

1.3.2蘇木素-伊紅(HE)染色 取出包埋后食管組織標(biāo)本，流水沖洗20 min，70%、90%、100%酒精脫水5 min，二甲苯透明，切片，溫水燙平，烘干，二甲苯脫蠟10 min，100%、90%、70%酒精覆水各5 min，流水沖洗15 min，蘇木素染色3 min，乙酸分化1 min，流水沖洗5 min，反藍(lán)，伊紅染色1 min，70%、90%、100%酒精脫水15 s，二甲苯1 min，自然風(fēng)干，滴中性樹膠封片，置于光學(xué)顯微鏡下(北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司，型號(hào)：TS2009)觀察其食管組織病理學(xué)變化。

1.3.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物水平 酶標(biāo)板每孔加稀釋后的待測(cè)血清50 μl，封孔，恒溫靜置60 min，棄反應(yīng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，每孔加生物素化工作液20 μl，封孔，恒溫靜置30 min，洗滌，每孔加酶標(biāo)抗體20 μl，恒溫靜置30 min，加顯色劑，避光顯色10 min，加底物液，酶聯(lián)免疫試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)檢測(cè)CYFRA21-1、癌胚抗原(CEA)、SCCAg水平。

1.3.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)免疫功能指標(biāo) 待測(cè)的標(biāo)本做抗凝處理，分為待測(cè)管和標(biāo)準(zhǔn)管，待測(cè)管分別加入CD3+、CD4+、CD8+單克隆抗體，標(biāo)準(zhǔn)管加入標(biāo)準(zhǔn)液，室溫孵育40 min，加溶血?jiǎng)耆苎?，離心，棄上清，洗滌，加固定劑，加儀器緩沖液用以懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀(廣州吉源生物科技有限公司，型號(hào)：CyFlow Cube6)檢測(cè)CD3+、CD4+、CD8+水平。

1.3.5Western印跡檢測(cè)Wnt/β-catenin通路蛋白表達(dá)量 電泳上樣緩沖液裂解細(xì)胞，收集蛋白樣品，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，硝酸纖維素(NC)膜轉(zhuǎn)膜，洗滌液漂洗2 min，加Western封閉液封閉60 min，1∶1 000稀釋一抗并添加，4℃孵育過夜，回收一抗，洗滌，1∶1 000稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗并添加，室溫孵育60 min,洗滌，顯色、成像，檢測(cè)Wnt5a、β-catenin相對(duì)表達(dá)量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行重讀測(cè)量方差分析、方差齊性檢驗(yàn)、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組食管組織病理學(xué)觀察 如圖1所示，正常組食管組織未見異常，黏膜平整光滑；模型組食管組織變粗，食管黏膜粗糙，管腔狹窄，黏膜層出現(xiàn)乳突瘤樣改變；低劑量組、高劑量組食管黏膜較平整光滑，管腔狹窄明顯改善。

2.2各組腫瘤生長(zhǎng)情況比較 與模型組相比，低劑量組、高劑量組瘤體總體積、瘤體總質(zhì)量、瘤體個(gè)數(shù)較少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與低劑量組相比，高劑量組瘤體總體積、瘤體總質(zhì)量、瘤體個(gè)數(shù)較少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表1。

圖1 各組食管組織病理學(xué)(HE染色，×200)

2.3各組腫瘤標(biāo)志物水平比較 與正常組相比，其他3組CYFRA21-1、CEA、SCCAg水平顯著較高(P<0.05)；與模型組相比，低劑量組、高劑量組CYFRA21-1、CEA、SCCAg水平顯著較低(P<0.05)。與低劑量組相比，高劑量組CYFRA21-1、CEA、SCCAg水平顯著較低(P<0.05)。見表2。

2.4各組免疫功能比較 如表3所示，與正常組相比，其他3組CD3+、CD4+水平較低，CD8+水平較高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與模型組相比，低劑量組、高劑量組大鼠CD3+、CD4+水平較高，CD8+水平較低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。與低劑量組相比，高劑量組大鼠CD3+、CD4+水平較高，CD8+水平較低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.5各組Wnt/β-catenin通路蛋白表達(dá)對(duì)比 如表3、圖2所示，與正常組相比，其他3組Wnt5a、β-catenin表達(dá)較高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與模型組相比，低劑量組、高劑量組Wnt5a、β-catenin表達(dá)較低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。與低劑量組相比，高劑量組Wnt5a、β-catenin表達(dá)較低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表1 各組腫瘤生長(zhǎng)情況比較

表2 各組腫瘤標(biāo)志物水平比較

表3 各組免疫功能及Wnt/β-catenin通路蛋白表達(dá)比較

1～4：正常組，模型組，低劑量組，高劑量組圖2 Wnt/β-catenin通路蛋白表達(dá)

3 討 論

食管癌為常見的惡性腫瘤，有研究發(fā)現(xiàn)，食管癌病因復(fù)雜，與年齡、職業(yè)、種族、生活環(huán)境、飲食習(xí)慣、遺傳等因素均有一定相關(guān)性，具有臨床發(fā)現(xiàn)晚、惡性程度高的特點(diǎn)〔8,9〕。我國(guó)每年食管癌的發(fā)病率占全世界發(fā)病率的一半，且食管癌5年生存率較低〔10〕。細(xì)胞增殖失控是腫瘤的基本特征，故抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤凋亡具有重要作用〔11〕。

大蒜素是多種有機(jī)硫化物的復(fù)合體，具有抗炎、抗?jié)儭⒔笛茄?、抗腫瘤等多種藥理學(xué)作用〔12〕。有研究顯示，大蒜素可抑制多種癌癥，如食管癌、胃癌等，可能與大蒜素可通過激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)8、外源凋亡通路、p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路活性，抑制食管癌細(xì)胞及胃癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡相關(guān)〔13,14〕。相關(guān)研究顯示，老年食管癌患者使用復(fù)方苦參注射液+放化療，CEA、糖類抗原(CA)125等腫瘤標(biāo)志物水平明顯下降，CD3+、CD4+水平明顯提升，可能是復(fù)方苦參注射液主要由苦參、白土苓、首烏等中草藥中提取，具有涼血解毒、抗癌的功效，其有效成分可阻斷內(nèi)皮及腫瘤細(xì)胞黏附、抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，激活T淋巴細(xì)胞活性，放化療可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，二者聯(lián)合可有效殺滅腫瘤細(xì)胞，改善腫瘤標(biāo)志物水平，提高免疫力〔15〕。還有研究發(fā)現(xiàn)，食管癌晚期大鼠經(jīng)大蒜素干預(yù)后，食管內(nèi)瘤體總質(zhì)量、瘤體個(gè)數(shù)明顯減少，可能是大蒜素可抑制癌細(xì)胞增殖，清除自由基，緩解氧化應(yīng)激損傷，抑制食管黏膜病變，效果顯著〔16〕。本文研究結(jié)果表明，經(jīng)大蒜素處理后，食管癌大鼠腫瘤生長(zhǎng)情況、腫瘤標(biāo)志物水平得到改善，免疫功能得到調(diào)節(jié)，從而使食管黏膜細(xì)胞損傷降低，抑制食管組織進(jìn)一步損傷，促進(jìn)食管功能的修復(fù)。

Wnt/β-catenin通路是生物進(jìn)化過程中較保守的通路，可調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖、發(fā)育及腫瘤發(fā)展，另在血管生成中有重要作用〔17〕。Wnt5a屬于Wnt蛋白家族，是一種分泌性糖蛋白，可調(diào)控多種細(xì)胞功能；β-catenin是一種黏膜因子，主要位于細(xì)胞膜，具有活化靶細(xì)胞的功效〔18,19〕。食管鱗癌患者中，β-catenin、淋巴細(xì)胞結(jié)合增強(qiáng)因子(LEF)1表達(dá)升高，且隨著病情加重，β-catenin、LEF1表達(dá)隨之升高，二者表達(dá)與分化程度、浸潤(rùn)深度相關(guān)〔20〕。還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，食管癌患者Wnt5a、β-catenin表達(dá)較高，經(jīng)白藜蘆醇干預(yù)后，Wnt5a、β-catenin表達(dá)降低，可能是白藜蘆醇可抑制Wnt/β-catenin通路活性，抑制Wnt5a、β-catenin表達(dá)，從而抑制食管癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)食管組織的修復(fù)〔21〕。本研究結(jié)果表明，大蒜素可能抑制Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白活性，有效阻止食管組織細(xì)胞的凋亡，從而起到保護(hù)食管的功效。