李鋒 薛華 王小衛(wèi) 梁杰 翟梅

(咸陽市第一人民醫(yī)院 1急診科，陜西 咸陽 712000；2老年科二病區(qū)；3呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科)

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的癌癥之一，在全球范圍內(nèi)，每年有超過 1 410 萬新的肺癌患者被診斷出患有肺癌，估計(jì)每年有 820 萬例患者死亡。非小細(xì)胞肺癌是肺癌的主要類型，由于缺乏明顯的早期癥狀和檢測方法，非小細(xì)胞肺癌的診斷通常處于中晚期〔1,2〕。吉非替尼，一種酪氨酸激酶抑制劑，已經(jīng)被美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)用于非小細(xì)胞肺癌的治療〔3〕。但是由于耐藥性的發(fā)生，吉非替尼在非小細(xì)胞肺癌的治療作用減弱，導(dǎo)致化療失敗〔4〕。因此，探索新的分子靶標(biāo)和作用機(jī)制以改善非小細(xì)胞肺癌的治療。微小RNA(miRNA)與各種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，并且可以通過調(diào)節(jié)靶mRNA在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、分化和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。miR-145 在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)下調(diào)，miR-145 低表達(dá)不僅與非小細(xì)胞肺癌的低分化和較晚分期相關(guān)，還與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)〔5〕。p21活化激酶(PAK)4是Rho家族蛋白Cdc42的效應(yīng)子，是一種重要的致癌基因，在許多人類癌癥中表達(dá)增加，通常與晚期疾病和生存期下降呈正相關(guān)。PAK4表達(dá)增加與轉(zhuǎn)移、總生存期縮短、NSCLC晚期相關(guān)〔6〕。本文旨在探究miR-145-5p對非小細(xì)胞肺癌對吉非替尼的敏感性的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20只裸鼠購自四川夏派森醫(yī)藥科技有限公司，許可證：SYXK(川)2017-203，用于異種移植瘤模型。飼養(yǎng)光照/黑暗周期為12 h，維持(24±2)℃恒溫，濕度為55%～60%。所有裸鼠可自由獲得水和食物。

1.2主要試劑及儀器 BEAS-2B細(xì)胞、A549細(xì)胞和A549耐吉非替尼細(xì)胞(A549/GR)購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心；miR-NC、miR-145-5p inhibitor、miR-145-5p mimic、pc-PAK4質(zhì)粒及各種引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成；RPMI-1640培養(yǎng)基購自武漢純度生物科技有限公司；胎牛血清、青霉素和鏈霉素雙抗溶液購自上海吉至生化科技有限公司；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海博爾森生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購自杭州昊鑫生物科技股份有限公司；SYBR-Green PCR試劑盒購自武漢時(shí)勝生物科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購自上海哈靈生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗、PAK4兔來源的單克隆抗體均購自熒光Abcam公司；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自北京科睿思訊生物科技有限公司；FluorChem HD2凝膠成像系統(tǒng)購自美國Invitrogen公司；流式細(xì)胞儀購自德國美天旎生物技術(shù)有限公司。

1.3細(xì)胞及培養(yǎng) 標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，在含有10%胎牛血清，培養(yǎng)基中培養(yǎng)所有細(xì)胞，在37℃含5%CO2和95%的濕空氣中孵育。

1.4RT-qPCR檢測miR-145-5p和PAK4 mRNA的表達(dá) 用Trizol法從細(xì)胞中提取總RNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。參照RT-qPCR試劑盒說明書反應(yīng)體系進(jìn)行qPCR。反應(yīng)條件為：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。以U6和GAPDH為內(nèi)參基因，用2-△△Ct計(jì)算相對表達(dá)量。引物序列為：PAK4上游：5′-CGGATATTGTCACCCACACCA G-3′，PAK4下游：5′-CTAACAGGGACAGGA GCT-3′；GAPDH上游：5′-ACTGTGCCGACTTGACG TTT-3′，GAPDH下游：5′-ATCGTAGTGAACGGTCG ATTGT-3′；miR-145-5p上游：5′-GTCCAGTTTTCCCAGGAA TCCCT-3′，miR-145-5p下游：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；U6上游：5′-CAGCACATATACTAAAATTGGAACG-3′，U6下游：5′-ACGAATTTGCGTGTCATCC-3′。

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染 以5×105個(gè)/ml的密度將A549/GR細(xì)胞接種于12孔板中，約80%匯合度時(shí)使用Lipofectamine2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將100 nmol/L的miR-NC(miR-NC組)、miR-145-5p mimic(miR-145-5p mimic組)、miR-145-5p inhibitor(miR-145-5p inhibitor組)、pc-PAK4質(zhì)粒分別或聯(lián)合轉(zhuǎn)染進(jìn)入A549/GR細(xì)胞，未轉(zhuǎn)染的A549/GR細(xì)胞為對照組。

1.6噻唑藍(lán)(MTT)法檢測細(xì)胞活性 取對數(shù)生長期A549/GR細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為3×104/ml，接種于96孔板中，按方法1.5分組處理，每孔加入MTT溶液(50 μl/孔)，孵育4 h，吸出上清液，每孔加150 μl二甲基亞砜(DMSO)，用平板搖床搖勻，用酶標(biāo)儀在570 nm處檢測各劑量OD值。

1.7流式細(xì)胞法檢測細(xì)胞的凋亡 取按方法1.5處理后的各組A549/GR細(xì)胞，用胰酶消化后收集，1 000 r/min離心5 min，棄去上清，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入1 ml結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，使?jié)舛葹?×106/ml，嚴(yán)格按照膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書上機(jī)分析。

1.8雙熒光素酶報(bào)告檢測靶向關(guān)系 TargetScan數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果顯示PAK4是miR-145-5p的潛在靶點(diǎn)。選用熒光素酶報(bào)告分析，構(gòu)建野生型(Wt)和突變型(Mut)PAK4 3′UTR區(qū)熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至A549/GR細(xì)胞。將細(xì)胞隨機(jī)分為miR-NC+PAK4 Wt組(轉(zhuǎn)染PAK4 Wt)、miR-145-5p mimic+PAK4 Wt組(共轉(zhuǎn)染PAK4 Wt和miR-145-5p mimic)、miR-NC+PAK4 Mut組(轉(zhuǎn)染PAK4 Mut)和miR-145-5p mimic+PAK4 Mut組 (共轉(zhuǎn)染PAK4 Mut和miR-145-5p mimic)。采用雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒檢測細(xì)胞熒光素酶相對活性。

1.9Western印跡檢測PAK4蛋白相對表達(dá)水平 將各組A549/GR細(xì)胞加裂解液后提取總蛋白，BCA試劑盒測定總蛋白含量。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，4℃下加入一抗PAK4孵育過夜，TBST洗膜，加入二抗HRP-IgG，室溫孵育1 h，TBST洗膜。通過Image LabTM軟件行灰度值分析。

1.10裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 所有裸鼠分為：空白組、miR-145-5p mimic組、pc-PAK4組、miR-145-5p mimic+pc-PAK4組。在裸鼠左腋下皮下注射轉(zhuǎn)染過的A549/GR細(xì)胞(每只小鼠在100 ml PBS中5×106個(gè)細(xì)胞)，在每個(gè)腫瘤達(dá)到肉眼可見的大小后，每隔一天給每只小鼠口服吉非替尼(100 mg/kg)。每隔4 d檢測腫瘤體積，在第24天，通過頸椎脫位法處死裸鼠，然后完整取出皮下腫瘤，用電子天平稱重，RT-PCR檢測小RNA和靶基因的表達(dá)，TUNEL染色檢測凋亡。

1.11TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡 取4%多聚甲醛固定的裸鼠腫瘤組織，石蠟包埋切片后，按TUNEL試劑盒操作說明進(jìn)行檢測，光鏡下觀察并計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。光鏡下棕黃色或褐色為陽性細(xì)胞即凋亡細(xì)胞。

1.12統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析、LSD-t檢驗(yàn)，多重性比較采用Duncan法。

2 結(jié) 果

2.1miR-145-5p在 A549、A549/GR細(xì)胞中低表達(dá) 與正常肺細(xì)胞BEAS-2B(1.00±0.03)相比，A549(0.45±0.04)和A549/GR細(xì)胞中miR-145-5p表達(dá)(0.53±0.04)明顯降低(P<0.01)。與對照組(1.00±0.08)相比，miR-NC 組A549/GR細(xì)胞中miR-145-5p表達(dá)(0.98±0.09)無明顯變化(P>0.05)，miR-145-5p inhibitor 組A549/GR細(xì)胞中miR-145-5p表達(dá)(0.23±0.08)明顯降低，miR-145-5p mimic 組A549/GR細(xì)胞中miR-145-5p表達(dá)(3.62±0.11)明顯升高(P<0.01)，表明轉(zhuǎn)染成功。

2.2miR-145-5p促進(jìn) A549/GR細(xì)胞對吉非替尼的敏感性 隨著時(shí)間的增長，各組A549/GR細(xì)胞活性差異逐漸明顯；在相同時(shí)間點(diǎn)，與對照組相比，miR-NC 組A549/GR細(xì)胞活性無明顯變化(P>0.05)，miR-145-5p inhibitor 組A549/GR細(xì)胞活性從24 h開始明顯升高，miR-145-5p mimic 組A549/GR細(xì)胞活性從24 h開始明顯降低(P<0.05，P<0.01)，見表1。與對照組〔(21.32±9.25)%〕相比，miR-NC 組A549/GR細(xì)胞凋亡率〔(22.16±1.32)%〕無明顯變化(P>0.05)，miR-145-5p inhibitor 組A549/GR細(xì)胞凋亡率〔(14.27±1.16)%〕明顯降低，miR-145-5p mimic 組A549/GR細(xì)胞凋亡率〔(45.62±1.21)%〕明顯升高(P<0.05，P<0.01)，見表1、圖1。

2.3miR-145-5p靶向PAK4 與miR-NC+PAK4 Wt組(1.00±0.05)比較，miR-145-5p mimic+PAK4 Wt組熒光素酶活(0.45±0.06)明顯下調(diào)(P<0.01)，說明 miR-145-5p直接靶向作用于PAK4，見圖2。與正常肺細(xì)胞BEAS-2B(1.00±0.06、0.39±0.04)相比，A549(4.26±0.17、0.78±0.05)和A549/GR細(xì)胞PAK4 mRNA和蛋白表達(dá)(3.37±0.15、0.67±0.06)明顯升高(P<0.01)，見圖3。

表1 各組A549/GR細(xì)胞中細(xì)胞活性比較

圖1 流式細(xì)胞法檢測各組細(xì)胞的凋亡

圖2 通過TargetScan數(shù)據(jù)庫篩選出的miR-145-5p靶基因

圖3 Western印跡檢測PAK4 蛋白表達(dá)

2.4miR-145-5p通過靶向PAK4促進(jìn)A549/GR對吉非替尼的敏感性 與空白組相比，miR-145-5p mimic組A549/GR細(xì)胞中PAK4蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，A549/GR細(xì)胞活性明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01)；pc-PAK4組A549/GR細(xì)胞中PAK4蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，A549/GR細(xì)胞活性明顯升高，細(xì)胞凋亡率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與miR-145-5p mimic組相比，miR-145-5p mimic+pc-PAK4組A549/GR細(xì)胞中PAK4蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，A549/GR細(xì)胞活性明顯升高，細(xì)胞凋亡率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖、圖5、表2、表3。

2.5miR-145-5p促進(jìn)A549/GR移植瘤對吉非替尼的敏感性 與空白組相比，miR-145-5p mimic組A549/GR移植瘤體積明顯減小，重量明顯減輕，miR-145-5p mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，PAK4 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，細(xì)胞凋亡率明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；pc-PAK4組A549/GR移植瘤體積明顯增大，重量明顯升高，miR-145-5p mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，PAK4 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，細(xì)胞凋亡率明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與miR-145-5p mimic組相比，miR-145-5p mimic+pc-PAK4組A549/GR移植瘤體積明顯增大，重量明顯升高，miR-145-5p mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，PAK4 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，細(xì)胞凋亡率明顯下降(P<0.01)，見圖6、圖7、表4、表5。

1～4：空白組，miR-145-5p mimic組，pc-PAK4組，miR-145-5pmimic+pc-PAK4組，下圖同圖4 Western印跡檢測各組PAK4 蛋白表達(dá)

圖5 流式細(xì)胞法檢測細(xì)胞凋亡

表2 各組A549/GR細(xì)胞中細(xì)胞活力比較

表3 各組A549/GR細(xì)胞中PAK4蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞的凋亡率

圖6 各組A549/GR移植瘤

圖7 TUNEL染色檢測各組細(xì)胞凋亡(×200)

表4 各組A549/GR移植瘤體積比較

表5 各組A549/GR移植瘤重量、凋亡率、miR-145-5p 和PAK4 mRNA 表達(dá)水平比較

3 討 論

盡管近年來非小細(xì)胞肺癌的診斷和治療取得了很大的進(jìn)展，但其復(fù)發(fā)率和死亡率仍然很高〔7〕。吉非替尼是一種表皮生長因子受體酪氨酸激酶的選擇性抑制劑，是治療晚期非小細(xì)胞肺癌的首個(gè)靶向藥物，吉非替尼在其應(yīng)用過程中會產(chǎn)生抗藥性。最近，有大量研究報(bào)道了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對吉非替尼的耐藥性，對吉非替尼的耐藥性限制了其對非小細(xì)胞肺癌患者的治療效果〔8〕。如抑制miR-873可通過靶向與膠質(zhì)瘤相關(guān)的致癌基因同源物1來增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對吉非替尼的耐藥性〔9〕；姜黃素通過誘導(dǎo)自噬相關(guān)細(xì)胞死亡克服非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對吉非替尼的原代耐藥〔10〕。 miRNA在癌細(xì)胞的增殖、新陳代謝的發(fā)展、遷移、侵襲、分化和耐藥性中起著重要作用。miR-145-5p在多種癌癥中發(fā)揮抑癌作用，如，miR-145過表達(dá)可觸發(fā)整個(gè)轉(zhuǎn)錄組的改變并抑制乳腺癌的發(fā)展〔11〕，miR-145-5p通過直接靶向KLF5影響胃癌的分化〔12〕。研究表明，miR-145通過靶向多藥耐藥相關(guān)蛋白-1使乳腺癌對阿霉素敏感〔13〕，miR-145通過直接抑制磷脂磷酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶(AKT)信號通路使食管鱗癌對順鉑敏感〔14〕。本研究結(jié)果說明miR-145-5p促進(jìn) A549/GR細(xì)胞對吉非替尼的敏感性。

miRNA是一類小的非編碼RNA，它們與靶基因3′非翻譯區(qū)(3′UTR)中的特定序列結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解和(或)翻譯抑制。為更好地了解miR-145-5p對非小細(xì)胞肺癌的吉非替尼敏感性的作用機(jī)制，通過TargetScan數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)miR-145-5p與PAK4存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，并通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-145-5p與PAK4存在靶向作用。p21激活的激酶(PAK)是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，是Rac和Cdc42的下游效應(yīng)子的最佳特征〔15〕。PAKs在幾種人類腫瘤(如乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌和胃癌)中過表達(dá)和/或過度活化，與癌癥的發(fā)展密切相關(guān)〔16〕。PAK4過表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的不良預(yù)后相關(guān)，并促進(jìn)其遷移和侵襲〔17〕。PAKs通過調(diào)節(jié)Ras誘導(dǎo)的細(xì)胞周期進(jìn)程和新陳代謝、上皮-間充質(zhì)性上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化和血管生成與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。miR-193a-3p抑制Slug激活劑PAK4通過p53基因/鋅指轉(zhuǎn)錄因子/L1細(xì)胞黏附分子通路抑制非小細(xì)胞肺癌的侵襲性〔18〕；PAK4通過PI3K/AKT通路參與宮頸癌細(xì)胞的順鉑耐藥〔19〕；PAK4通過PI3K/AKT和絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶依賴途徑使胃癌細(xì)胞產(chǎn)生順鉑耐藥〔20〕。本研究表明，miR-145-5p通過靶向PAK4促進(jìn)A549/GR對吉非替尼的敏感性。

通過體外實(shí)驗(yàn)可知，miR-145-5p通過靶向PAK4促進(jìn)A549/GR對吉非替尼的敏感性。為了更好地了解miR-145-5p通過靶向PAK4促進(jìn)A549/GR對吉非替尼敏感性的影響，本文進(jìn)行了裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-145-5p高表達(dá)減小裸鼠移植瘤腫瘤體積，減輕裸鼠移植瘤腫瘤重量，上調(diào)miR-145-5p mRNA表達(dá)，下調(diào)PAK4 mRNA表達(dá)，上升細(xì)胞凋亡率；共轉(zhuǎn)染pc-PAK4逆轉(zhuǎn)miR-145-5p高表達(dá)對A549/GR移植瘤作用。

綜上，miR-145-5p通過靶向PAK4促進(jìn)A549/GR對吉非替尼的敏感性，為臨床治療非小細(xì)胞肺癌提供一種新的治療方法，但更為細(xì)致的分子通路機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。