張玉靜 劉倩

(邢臺市人民醫(yī)院腎內(nèi)科，河北 邢臺 054000)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)的一種重要微血管病變，其發(fā)病率占DM的30%～35%，同時也是導致終末期腎病的一個主要原因〔1〕。由于DN呈漸進式緩慢發(fā)展，患者起病較為隱匿，加之目前由于臨床診斷手段的局限性，給患者的早期診斷及治療帶來了阻礙〔2〕。目前研究顯示〔3〕，長鏈非編碼RNA(LncRNA)異常表達在多種疾病發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。LncRNA作為一類長度超過200個核苷酸的功能性RNA，可在多水平調(diào)控機體基因表達，從而發(fā)揮相應(yīng)的調(diào)控作用〔4〕。研究顯示〔5〕，LncRNA的表達調(diào)控與多種內(nèi)分泌及代謝疾病密切相關(guān)。本研究探討DN患者外周血LncRNA電壓門控鉀通道亞家族Q1重疊轉(zhuǎn)錄物(KCNQ1OT)1表達與氧化應(yīng)激水平及轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1/p38絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)通路的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選擇2017年3月至2019年12月邢臺市人民醫(yī)院收治的2型糖尿病(T2DM)患者162例，其中T2DM合并DN患者75例作為DN組，其余單純T2DM患者87例作為DM組。此外，選擇同期醫(yī)院健康體檢人員80例作為對照組。3組受試者性別、年齡、收縮壓、舒張壓、體重指數(shù)(BMI)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，DN組與DM組DM病程比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準同意。

1.2納入標準與排除標準 納入標準：①T2DM診斷符合世界衛(wèi)生組織(WHO)T2DM相關(guān)診斷標準；②DN符合《內(nèi)科學》相關(guān)診斷標準〔6〕；③受試者自愿簽署知情同意書。排除標準：①合并惡性腫瘤、心血管疾病、肝損傷及其他腎臟疾病者；②合并原發(fā)性高血壓；③合并嚴重認知功能障礙者；④合并外傷、感染及自身免疫性疾病者；⑤繼發(fā)性DM患者。

表1 3組臨床資料比較

1.3LncRNA KCNQ1OT1、TGF-β1、P38MAPK、半胱天冬酶(Caspase)-3 mRNA檢測 抽取各組受試者清晨空腹靜脈血，應(yīng)用Trizol(美國Invitrogen公司)試劑提取血清中總RNA。提取外周血RNA，參照AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用2×SYBR Green PCR Master Mix，以cDNA為模板，進行qRT-PCR。根據(jù)目標基因設(shè)計合成上下游引物進行PCR擴增，以GAPDH作為內(nèi)參基因，引物序列：LncRNA KCNQ1OT1上游引物：5′-CCCAGAAAT CCACACCTCGG-3′，下游引物：5′-TCCTCAGEGAGCAGATGGAGA-3′；TGF-β1上游引物：5′-CGCGAG CTGTCAATTGACTT-3′，下游引物：5′-TCGACTGCAC TTGCAGGTGC-3′；P38MAPK上游引物：5′-GCTTGTT TCCTGGTACAGACC-3′，下游引物：5′-CAGTTTCT CTTGGTCAAGGG-3′；Caspase-3上游引物：5′-ATGGACAACTTGGAAACCTCCGTG-3′，下游引物：5′-CC ACTCCCAGTCAAACCTTTAGTG-3′；GAPDH上游引物：5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′，下游引物：5′-GTCCACCACCCGATTGCTGTAG-3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，共40個循環(huán)。以2-△△Ct值表達各目的基因相對表達量。

1.4氧化應(yīng)激指標檢測 抽取各組受試者空腹靜脈血，4 000 r/min離心10 min分離血清，然后置于-20℃冰箱內(nèi)保存待測。采用分光光度計檢測血清超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)活性。采用比色法檢測血清活性氧(ROS)，檢測嚴格參照試劑盒使用說明書進行。

1.5統(tǒng)計學分析 采用統(tǒng)計學軟件SPSS22.0進行方差分析、t檢驗、秩和檢驗、χ2檢驗、受試者工作特征(ROC)曲線。

2 結(jié) 果

2.13組外周血LncRNA KCNQ1OT1表達比較 DN組和DM組外周血LncRNA KCNQ1OT1相對表達量顯著高于對照組(4.585±1.470、3.227±1.027、1.974±0.602，P<0.05)，其中DN組外周血LncRNA KCNQ1OT1相對表達量顯著高于DM組(P<0.05)。

2.23組外周血TGF-β1、p38MAPK及Caspase-3 mRNA表達比較 DN組和DM組外周血TGF-β1、p38MAPK、Caspase-3 mRNA相對表達量顯著高于對照組(P<0.05)，其中DN組外周血TGF-β1、p38MAPK、Caspase-3 mRNA相對表達量顯著高于DM組(P<0.05)，見表2。

表2 3組外周血TGF-β1、p38MAPK及Caspase-3 mRNA表達比較

2.33組血清氧化應(yīng)激指標比較 DN組和DM組血清MDA、ROS顯著高于對照組(P<0.05)，SOD顯著低于對照組(P<0.05)，其中DN組血清MDA、ROS顯著高于DM組(P<0.05)，DN組血清SOD顯著低于DM組(P<0.05)，見表3。

表3 3組血清氧化應(yīng)激指標比較

2.4LncRNA KCNQ1OT1表達與TGF-β1/p38MAPK通路相關(guān)性 DN患者外周血LncRNA KCNQ1OT1表達與TGF-β1、p38MAPK、Caspase-3 mRNA、MDA、ROS呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，外周血LncRNA KCNQ1OT1表達與SOD呈顯著負相關(guān)(P<0.05)，見圖1。

圖1 DN患者外周血LncRNA KCNQ1OT1表達與TGF-β1/p38MAPK通路相關(guān)性

2.5ROC曲線分析LncRNA KCNQ1OT1對DN的診斷價值 T2DM患者中LncRNA KCNQ1OT1對DN的診斷價值ROC曲線下面積為0.875，見圖2。

圖2 ROC曲線分析LncRNA KCNQ1OT1對DN的診斷價值

3 討 論

DN的發(fā)生及發(fā)展主要原因與長期血糖控制不佳而導致的腎單位局部氧化應(yīng)激損傷等有關(guān)，尤其在具有相關(guān)高危因素的人群當中具有更高的DN發(fā)生率〔7〕。目前臨床上對于DN患者的總體治療有效率較低，雖然可在短期內(nèi)抑制患者腎功能的惡化，但患者治療后病情復發(fā)率仍較高〔8〕。因此對于DN發(fā)病機制過程中相關(guān)生物學因子的研究，可揭示疾病發(fā)病原因提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)，從而也為DN的治療，尤其是免疫及生物學靶向治療提供相應(yīng)的依據(jù)〔9〕。

LncRNA KCNQ1OT1是一個位于KCNQ1位點上的長鏈非編碼RNA基因，近年來研究顯示，印跡基因的異常表達可引發(fā)伴有復發(fā)突變和表型缺陷的多種人類疾病，同時印跡基因的異常表達與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，也與機體炎癥及血管相關(guān)性疾病有關(guān)〔10〕。本研究結(jié)果與相關(guān)研究報道結(jié)果相似〔11〕，LncRNA KCNQ1OT1在T2DM及DN的發(fā)生發(fā)展進程中發(fā)揮著重要作用。本研究ROC曲線提示T2DM患者外周血LncRNA KCNQ1OT1對DN具有良好的診斷價值。

DN發(fā)生時，高血糖及代謝紊亂所產(chǎn)生的糖基化終末產(chǎn)物可導致患者機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)之下，從而引發(fā)腎臟局部炎癥、腎臟血流動力學的改變，進而促進各種細胞因子的大量釋放，最終可導致細胞外基質(zhì)的增多，引發(fā)腎小球基底增厚及腎小球硬化〔12，13〕。目前研究顯示〔14，15〕，TGF-β1高表達與多種原因所引起的腎小球硬化及腎臟纖維化具有密切聯(lián)系。且近年來研究顯示〔16,17〕，TGF-β1介導的足細胞損傷在DN蛋白尿發(fā)生、發(fā)展及腎小球硬化過程中發(fā)揮重要作用，其中腎臟氧化應(yīng)激是導致足細胞凋亡的一種主要原因，而TGF-β1及Caspase-3是氧化應(yīng)激所導致足細胞損傷凋亡的重要細胞因子。而p38MAPK作為信號轉(zhuǎn)導通路的交匯點，能夠被多種細胞外刺激所活化，從而對細胞的增殖、生長及分化發(fā)生相應(yīng)的調(diào)控作用，可介導TGF-β1誘發(fā)的系膜區(qū)基質(zhì)沉積〔18〕。此外，氧化應(yīng)激所誘導的p38MAPK激活可進一步促進細胞凋亡因子Caspase-3引起的足細胞凋亡〔19〕。本研究結(jié)果與相關(guān)研究結(jié)果相似〔20〕，DN患者LncRNA KCNQ1OT1的異常表達與TGF-β1/p38MAPK信號轉(zhuǎn)導通路的激活有關(guān)。

有研究提出〔21〕，機體氧化應(yīng)激反應(yīng)的增強將導致巨大的損害，大大加速了DN的病程進展。在DN患者腎組織中ROS濃度的升高，過量的ROS將導致腎臟負擔，進一步引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)〔22〕。SOD作為一種自由基清除劑，可間接反映機體氧自由基水平；MDA作為一種脂質(zhì)過氧化物，可反映機體過氧化強度；ROS由線粒體產(chǎn)生，過量的ROS也是導致腎臟損傷的重要因素〔23〕。本研究MDA、ROS、SOD結(jié)果與學者研究結(jié)果相似〔24〕，提示DN患者存在明顯的氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激損傷可能是導致DN進展的重要原因，DN患者LncRNA KCNQ1OT1表達與MDA、ROS呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，與SOD呈顯著負相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。進一步提示糖尿病腎病患者LncRNA KCNQ1OT1的異常表達與機體的氧化應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)。

由于本研究納入樣本量較小，且DN疾病發(fā)展機制較為復雜，受多通路多基因調(diào)控的影響，進一步研究還需要擴大樣本量，并進行進一步深入研究分析。

綜上所述，DN患者可出現(xiàn)外周血LncRNA KCNQ1OT1異常表達，且其表達情況與患者氧化應(yīng)激水平及TGF-β1/p38MAPK信號轉(zhuǎn)導通路激活有關(guān)，LncRNA KCNQ1OT1對DN具有良好的診斷價值。