曾瑞華 許秀蘭 黃平 曾昭珊

地中海貧血是常染色體隱性單基因遺傳病[1]。輕型患者無(wú)癥狀，不影響日常生活工作，稱為攜帶者，若與同型地中海貧血的攜帶者婚配、生育，根據(jù)地中海貧血遺傳規(guī)律，將會(huì)有25%概率生育中型、重型地中海貧血患兒，需定期輸血維持生命，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，甚至威脅生命，影響本地區(qū)的人口質(zhì)量[2]。陽(yáng)江地區(qū)位于粵西，人口200萬(wàn)，是地中海貧血高發(fā)區(qū)，廣東省2012年大規(guī)模流調(diào)數(shù)據(jù)顯示，攜帶同型地中海貧血基因的夫婦高達(dá)1.87%（這個(gè)是引用廣東省2012年大規(guī)模流調(diào)的數(shù)據(jù)），如果不加予干預(yù)，每年將會(huì)有大量中重型地中海貧血患兒出生。陽(yáng)江市婦幼保健院對(duì)懷孕中期攜帶同型地中海貧血基因的夫婦進(jìn)行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取羊水進(jìn)行地中海貧血基因分析，查出重型地中海貧血患兒，終止妊娠，保障母嬰健康，提高本地區(qū)人口素質(zhì)，更好地完成出生缺陷防控工作。本研究統(tǒng)計(jì)分析了2019年6月-2021年4月陽(yáng)江市婦幼保健院、陽(yáng)西縣婦幼保健院、陽(yáng)江市江城區(qū)平崗醫(yī)院、陽(yáng)江市陽(yáng)東區(qū)婦幼保健院抽取羊水檢查的236例孕婦的臨床資料，分析了陽(yáng)江地區(qū)同型地中海貧血夫婦的羊水地中海貧血基因的產(chǎn)前診斷情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2019年6月-2021年4月于陽(yáng)江市婦幼保健院、陽(yáng)西縣婦幼保健院、陽(yáng)江市江城區(qū)平崗醫(yī)院、陽(yáng)江市陽(yáng)東區(qū)婦幼保健院抽取羊水檢查的236例孕婦的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均具有平穩(wěn)的生命體征；（2）均為單胎；（3）夫妻兩人為同型地中海貧血。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并妊娠期并發(fā)癥；（2）合并惡性腫瘤。年齡20～47歲，平 均（33.62±5.46） 歲； 孕 周 16～26周， 平 均（18.32±1.05）周。在孕婦類型方面，初產(chǎn)婦120例，經(jīng)產(chǎn)婦116例。本研究通過(guò)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，孕婦均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 讓孕婦適當(dāng)活動(dòng)，B超監(jiān)護(hù)下經(jīng)母腹實(shí)施羊膜腔穿刺術(shù)，選取髂前上棘和臍連線的中點(diǎn)處確定穿刺點(diǎn)，常規(guī)消毒腹部皮膚，鋪洞巾，經(jīng)皮用22G活檢穿刺針，穿刺羊膜腔，抽取20 ml無(wú)菌羊水，分裝在2支15 ml無(wú)菌離心管中送檢。

1.2.2 DNA提取 標(biāo)本送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行DNA提取，具體操作為：抽取1管羊水，速率為2 500 r/min，離心10 min，每管留取0.5 ml羊水沉渣，接種在25 ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中并添加3.5 ml美國(guó)Gibco公司生產(chǎn)的Amnio Max培養(yǎng)液，放置在100%濕度、37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，1周后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。顯微鏡下見(jiàn)5、6個(gè)克隆細(xì)胞，每個(gè)克隆細(xì)胞含50～200個(gè)克隆羊水細(xì)胞，同時(shí)，在細(xì)胞克隆時(shí)，收獲具有較強(qiáng)折光性、較多圓形分裂細(xì)胞。向15 ml無(wú)菌離心管中轉(zhuǎn)移羊水細(xì)胞；另1管羊水離心10 min，速率為4 000 r/min，去除上清液，保留沉淀物（羊水細(xì)胞），向1.5 ml離心管中轉(zhuǎn)移，應(yīng)用離心柱型微量樣品基因組DNA提取試劑盒（凱普有限公司）進(jìn)行DNA提取，將蛋白酶K、細(xì)胞裂解液加入離心管中消化，向吸附柱轉(zhuǎn)移裂解液，進(jìn)行DNA洗脫。

1.2.3 DNA擴(kuò)增 （1）運(yùn)用Gap-PCR法檢測(cè)α-缺失型地中海貧血--SEA/、-α3.7/、-α4.2/三種缺型。α-缺失型擴(kuò)增程序：在96 ℃的溫度下擴(kuò)增5 min，在98 ℃、65 ℃、72 ℃的溫度下分別擴(kuò)增 45 s、90 s、3 min，共 10 個(gè)循環(huán)，在 98 ℃、65 ℃、72 ℃的溫度下分別擴(kuò)張 30 s、45 s、3 min，共 25 個(gè)循環(huán)，在 72 ℃的溫度下擴(kuò)增 10 min；（2）運(yùn)用 PCR- 反向點(diǎn)雜交法對(duì)α-非缺失型、β-地中海貧血突變CD14-15、CD17、CD27/28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD41-42、CD43、CD71-72、ⅠVS-Ⅱ-28、IVS-Ⅰ-1、IVS-Ⅰ-5、IVS-Ⅱ-654、Ⅰnt、βE、CAP、αWSα、αCSα、αQSα三種突變進(jìn)行檢測(cè)。α-非缺失型、β-地中海貧血突變擴(kuò)增程序：在50 ℃、95 ℃的溫度下分別擴(kuò)增 15、10 min，在94 ℃、55 ℃、72 ℃的溫度下分別擴(kuò)增 60、30、30 s，共35個(gè)循環(huán)，在72 ℃的溫度下擴(kuò)增5 min；（3）采用PCR擴(kuò)增儀（Hema 9600），應(yīng)用地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒（深圳亞能生物技術(shù)有限公司）擴(kuò)增。

1.2.4 電泳和雜交 （1）α-缺失型地中海貧血將2 μl擴(kuò)增產(chǎn)物取出來(lái)，在5 V/cm電壓下用含核酸染料的1.0%瓊脂糖凝膠電泳1 h，在黑馬凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果；（2）α-非缺失型、β-地中海貧血突變檢測(cè)。在42 ℃的溫度下在恒溫水浴搖床上雜交1.5～4 h，洗膜，顯色后觀察結(jié)果。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）觀察陽(yáng)江地區(qū)同型地中海貧血夫婦均為α-地中海貧血的羊水地中海貧血基因的產(chǎn)前診斷結(jié)果；（2）觀察陽(yáng)江地區(qū)同型地中海貧血夫婦均為β-地中海貧血的羊水地中海貧血基因的產(chǎn)前診斷結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料用（±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 陽(yáng)江地區(qū)同型地中海貧血夫婦均為α-地中海貧血的羊水地中海貧血基因的產(chǎn)前診斷結(jié)果分析

236例中，夫妻雙方均為α-地中海貧血168例，均為單胎，其胎兒重型α-地中海貧血22例，中間型α-地中海貧血29例，輕型α-地中海貧血60例，靜止型α-地中海貧血22例，正常35例， 分 別 占 13.10%、17.26%、35.71%、13.10%、20.83%，見(jiàn)表1。

表1 陽(yáng)江地區(qū)同型地中海貧血夫婦均為α-地中海貧血的羊水地中海貧血基因的產(chǎn)前診斷結(jié)果分析

2.2 陽(yáng)江地區(qū)同型地中海貧血夫婦均為β-地中海貧血的羊水地中海貧血基因的產(chǎn)前診斷結(jié)果分析

236例中，均為β-地中海貧血的夫妻68例，均為單胎，其中重型/中間型β-地中海貧血16例，輕型β-地中海貧血32例，正常20例，分別占23.53%、47.06%、29.41%，見(jiàn)表2。

表2 陽(yáng)江地區(qū)同型地中海貧血夫婦均為β-地中海貧血的羊水地中海貧血基因的產(chǎn)前診斷結(jié)果分析

3 討論

地中海貧血又稱海洋性貧血或珠蛋白合成障礙性貧血，是常染色體隱性單基因遺傳病[3]。由于珠蛋白鏈合成缺如或不足所導(dǎo)致的貧血或病理狀態(tài)。緣于基因缺陷的復(fù)雜性與多樣性，使缺乏的珠蛋白鏈類型、數(shù)量及臨床癥狀變異性較大[4]。根據(jù)所缺乏的珠蛋白鏈種類及缺乏程度予以命名和分類。本病廣泛分布于世界許多地區(qū)，東南亞即為高發(fā)區(qū)之一[5]。

基因珠蛋白鏈的分子結(jié)構(gòu)及合成是由基因決定的。γ、δ、ε和β珠蛋白基因組成“β基因族”，ζ和α珠蛋白組成“α基因族”[6]。正常人自父母雙方各繼承2個(gè)α珠蛋白基因（αα/αα）合成足夠的α珠蛋白鏈；自父母雙方各繼承1個(gè)β珠蛋白基因合成足夠的β珠蛋白鏈[7-8]。由于珠蛋白基因的缺失或點(diǎn)突變，肽鏈合成障礙導(dǎo)致發(fā)病，根據(jù)缺失或者突變的基因數(shù)目多少導(dǎo)致貧血的程度又分為輕、中、重度貧血[9-12]。地中海貧血分為α型、β型、δβ型和δ型4種，其中以β和α地中海貧血較為常見(jiàn)[13-15]。

本研究結(jié)果表明，236例中，夫妻雙方均為α-地中海貧血168例，其中診斷為重型α-地中海貧血22例，中間型α-地中海貧血29例，輕型α-地中海貧血60例，靜止型α-地中海貧血22例，正常35例，分別占13.10%、17.26%、35.71%、13.10%、20.83%。均為β-地中海貧血的夫妻68例，其中重型/中間型β-地中海貧血16例，輕型β-地中海貧血32例，正常20例，分別占23.53%、47.06%、29.41%。據(jù)此能夠?qū)⒂行б罁?jù)提供給終止妊娠與否，進(jìn)而促進(jìn)新生兒出生缺陷的降低，從而減輕家庭及社會(huì)的負(fù)擔(dān)。

綜上所述，陽(yáng)江地區(qū)同型地中海貧血夫婦的羊水地中海貧血基因的產(chǎn)前診斷能夠?qū)崿F(xiàn)地中海貧血的早診斷，早干預(yù)，預(yù)防重型地中海貧血患兒的出生，減輕家庭及社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，提升人口素質(zhì)。