蔡成杰 葉敏 林志潮

肺癌是全球死亡率最高的癌癥。隨著診斷技術(shù)不斷進(jìn)步，多原發(fā)肺癌（multiple primary lung cancer，MPLC）發(fā)病率也逐年提高。多原發(fā)肺癌是指患者體內(nèi)先后發(fā)生兩個(gè)以上的惡性腫瘤[1]。腫瘤時(shí)間間隔6個(gè)月臨床定義為同時(shí)性MPLC（synchronous multiple primary lung cancer，sMPLC）。當(dāng)前，sMPLC 全球發(fā)病率為0.5%～10%。根據(jù)Martini和Melamed的診斷標(biāo)準(zhǔn)，美國(guó)胸科協(xié)會(huì)增加了分子遺傳學(xué)水平測(cè)序作為更加精確的診斷標(biāo)準(zhǔn)。近些年，二代高通量測(cè)序（second generation high throughput sequencing）和免疫學(xué)的發(fā)展為診斷sMPLC提供了新思路。有研究表明，結(jié)合臨床病理特征、影像學(xué)、基因特征分析sMPLC鑒別與M-M標(biāo)準(zhǔn)有著較高的一致性，也能補(bǔ)充M-M標(biāo)準(zhǔn)[2]。二代高通量測(cè)序的特點(diǎn)是增加測(cè)序深度，提高分析敏感度和測(cè)序的準(zhǔn)確性，有效改善了常規(guī)診斷方式測(cè)序慢、敏感度和準(zhǔn)確性不高的缺點(diǎn)。本次研究探究二代高通量測(cè)序肺癌多驅(qū)動(dòng)基因突變對(duì)鑒別診斷sMPLC的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年6月-2021年6月江門市中心醫(yī)院30例sMPLC患者手術(shù)標(biāo)本作為試驗(yàn)組，同時(shí)收集30例經(jīng)病理證實(shí)的肺內(nèi)轉(zhuǎn)移癌患者手術(shù)標(biāo)本作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《中華醫(yī)學(xué)會(huì)肺癌臨床診療指南（2019版）》中關(guān)于sMPLC的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]；（2）病理學(xué)分型為肺癌；（3）均為初次診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有其他肝、腎等嚴(yán)重疾病；（2）合并其他原發(fā)性癌癥；（3）腫瘤直徑≤2 cm。對(duì)照組男17例，女13例；年齡35～75歲，平均（55.50±3.70）歲。試驗(yàn)組男16例，女14例；年齡34～74歲，平均（54.20±3.60）歲。兩組一般資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），有可比性?；颊吆炇鹬橥鈺?，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

兩組均采用二代高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)30例sMPLC患者肺癌組織手術(shù)標(biāo)本及肺內(nèi)轉(zhuǎn)移癌患者手術(shù)標(biāo)本11個(gè)肺癌驅(qū)動(dòng)基因突變，所有標(biāo)本經(jīng)過(guò)中性甲醛液固定處理，石蠟包埋，切片和HE染色。使用Illumina Miniseq測(cè)序平臺(tái)和人多基因突變檢測(cè)通用試劑盒，人多基因突變檢測(cè)捕獲探針；所有檢測(cè)依據(jù)試劑說(shuō)明書和實(shí)驗(yàn)室規(guī)范操作。

1.3 觀察指標(biāo)

統(tǒng)計(jì)突變類型，對(duì)比兩組11個(gè)肺癌驅(qū)動(dòng)基因（EGFR、ALK、HER2、BRAF、MET、KRAS、NRAS、PIK3CA、RET、ROS1、TP53）突變情況。分析試驗(yàn)組及對(duì)照組基因突變陽(yáng)性率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果的數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

在本次試驗(yàn)檢測(cè)到34種突變類型。臨床意義不明的變異或者良性變異有15種突變類型，具體如下。

2.1 兩組EGFR基因突變比較

試驗(yàn)組中EGFR突變者共有6例，其中1例患者的兩對(duì)基因具有雙位點(diǎn)突變，因此EGFR共有7對(duì)突變位點(diǎn)。EGFR的19號(hào)外顯子Glu746Ala750del缺失突變，21號(hào)外顯子Arg868Leu錯(cuò)義突變的突變率分別為10.00%（3/30）、6.67%（2/30），其他位點(diǎn)突變率為3.33%（1/30）。30例患者中，試驗(yàn)組EGFR基因突變有6例，對(duì)照組EGFR基因突變有2例，兩組EGFR基因突變率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表 1。

表1 兩組EGFR基因突變比較（例）

2.2 兩組KRAS基因突變比較

試驗(yàn)組30例患者中KRAS基因突變有6例，對(duì)照組30例患者中KRAS基因突變有1例，試驗(yàn)組KRAS基因突變率高于對(duì)照組（P＜0.05），見表2。

表2 兩組KRAS基因突變比較（例）

2.3 兩組TP53基因突變比較

TP53的5號(hào)外顯子Val173GIn錯(cuò)義突變、8號(hào)外顯子Arg273Leu錯(cuò)義突變、9號(hào)外顯子Lys320Ter無(wú)義突變的突變率均為6.67% （2/30），其他位點(diǎn)突變率均為3.33%（1/30）。TP53突變?cè)谠囼?yàn)組中有雙突變位點(diǎn)，而對(duì)照組沒有雙突變位點(diǎn)。試驗(yàn)組TP53突變者共有9例，其中3例患者具有雙位點(diǎn)突變。對(duì)照組有2對(duì)單位點(diǎn)突變，試驗(yàn)組TP53基因突變率高于對(duì)照組（P＜0.05），見表3。

表3 兩組TP53基因突變比較（例）

2.4 其他基因突變情況

RET基因：試驗(yàn)組30例患者中RET基因突變有1例，對(duì)照組RET基因突變有1例，兩組RET基因突變率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.000，P＞0.05）；MET基因：試驗(yàn)組30例患者中MET基因突變有1例，對(duì)照組MET基因突變有1例，兩組MET基因突變率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.000，P＞0.05）；ALK基因：試驗(yàn)組和對(duì)照組患者中ALK基因突變均有1例，兩組ALK基因突變率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.000，P＞0.05）。其他5種基因突變不明顯。

2.5 試驗(yàn)組基因突變陽(yáng)性率

試驗(yàn)組中，30例肺癌患者中11個(gè)驅(qū)動(dòng)基因突變聯(lián)合檢測(cè)總體突變陽(yáng)性率為80.00%（24/30）。Ⅰ類突變陽(yáng)性率為23.33%，其中EGFR基因突變的陽(yáng)性率最高，占比20.00%，Ⅲ B類突變陽(yáng)性率為30.00%，TP53突變9例，Ⅳ類突變陽(yáng)性率為20.00%，KRAS突變6例，見表4。

表4 試驗(yàn)組基因突變陽(yáng)性率[例（%）]

2.6 對(duì)照組基因突變陽(yáng)性率

對(duì)照組中，8例樣本發(fā)生基因突變。11個(gè)驅(qū)動(dòng)基因突變陽(yáng)性率為26.67%（8/30）。Ⅰ類突變陽(yáng)性率為10.00%，其中EGFR基因突變的陽(yáng)性率最高，為6.67%。Ⅲ B類突變陽(yáng)性率為6.67%，即TP53突變2例。Ⅳ類突變陽(yáng)性率為3.33%，KRAS突變1例，見表5。

表5 對(duì)照組基因突變陽(yáng)性率[例（%）]

3 討論

隨著全球生物醫(yī)藥技術(shù)的迅速發(fā)展，以肺癌為代表的惡性腫瘤的診治進(jìn)入了大數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)的精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代[4]。因此，對(duì)sMPLC、肺內(nèi)轉(zhuǎn)移癌的鑒別診斷對(duì)疾病分期、管理具有重要意義。二代高通量測(cè)序技術(shù)具有檢測(cè)通量大、信息全面和敏感度高等優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)對(duì)標(biāo)本的大規(guī)模檢測(cè)，進(jìn)而快速得到個(gè)體化全景式基因信息譜圖，為惡性腫瘤的精準(zhǔn)化診治提供支撐[5-6]。

此次為進(jìn)一步探討二代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)sMPLC的診斷價(jià)值，特針對(duì)30例sMPLC患者手術(shù)標(biāo)本及30例肺內(nèi)轉(zhuǎn)移癌患者手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行研究，觀察11個(gè)肺癌驅(qū)動(dòng)基因突變情況。新近研究表明，在22個(gè)腫瘤樣本的二代測(cè)序檢測(cè)中，TP53、EGFR、KRAS的突變頻率較高[7-8]。本研究結(jié)果與其基本一致，此次研究經(jīng)二代高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)，兩組TP53、EGFR和KRAS突變頻率較高，但對(duì)照組EGFR基因突變2對(duì)均為單位點(diǎn)突變，KRAS基因突變只有1對(duì)。而試驗(yàn)組中，EGFR突變共有6例，其中1例兩對(duì)基因是雙位點(diǎn)突變，試驗(yàn)組KRAS基因突變率高于對(duì)照組（P＜0.05）；試驗(yàn)組TP53突變者共9例，其中3例是雙位點(diǎn)突變，TP53共記12對(duì)突變位點(diǎn)，試驗(yàn)組TP53基因突變率高于對(duì)照組（P＜0.05）；KRAS基因突變6例，試驗(yàn)組TP53、EGFR及KRAS基因突變占總例數(shù)的70.00%。提示，二代高通量測(cè)序技術(shù)在sMPLC、肺內(nèi)轉(zhuǎn)移癌中有較高應(yīng)用價(jià)值。分析原因可知，TP53是17號(hào)染色體基因，其突變情況與多種癌癥相關(guān)，TP53的選擇性剪接和交替啟動(dòng)子的使用會(huì)使多數(shù)轉(zhuǎn)錄體變異[9-10]。EGFR作為信號(hào)傳導(dǎo)的受體，多分布于哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞及成纖維等細(xì)胞表面，其信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖與分化過(guò)程發(fā)揮重要作用，其細(xì)胞定位或表達(dá)異常，常與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)相關(guān)[11]。KRAS參與著細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞，但當(dāng)其突變時(shí)，就會(huì)造成該基因永久活化，從而無(wú)法正常產(chǎn)生RAS蛋白，造成細(xì)胞增殖失控進(jìn)而導(dǎo)致癌變[12]。此次研究結(jié)果顯示，兩組RET、MET及ALK基因突變均有1對(duì)，另5種基因突變不明顯。因此，二代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)于檢測(cè)sMPLC中TP53、EGFR及KRAS基因突變較敏感。試驗(yàn)組中，30例患者中11個(gè)驅(qū)動(dòng)基因突變聯(lián)合檢測(cè)總體突變陽(yáng)性率為80.00%，對(duì)照組中，8例樣本發(fā)生基因突變。11個(gè)驅(qū)動(dòng)基因突變陽(yáng)性率為26.67%。高通量測(cè)序技術(shù)能檢測(cè)更多的突變位點(diǎn)和具有更高的敏感度。高通量測(cè)序技術(shù)能檢測(cè)所有的突變位點(diǎn)（包括已知和未知突變類型），且結(jié)合UMI技術(shù)和增加測(cè)序深度能提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。肺癌驅(qū)動(dòng)基因變異多數(shù)發(fā)生在熱點(diǎn)區(qū)域，高通量測(cè)序技術(shù)能較為全面地檢出肺癌驅(qū)動(dòng)基因中具有顯著臨床意義和潛在臨床意義的突變位點(diǎn)，提供臨床意義不明的變異和可能是良性變異信息，進(jìn)一步讓更多患者從靶向治療中獲益，需要檢測(cè)多個(gè)驅(qū)動(dòng)基因時(shí)，推薦使用高通量測(cè)序技術(shù)。但由于目前相關(guān)研究數(shù)據(jù)與此次研究樣本量較少，可能與其他研究存在較大差異，具有一定局限性。

綜上所述，采用二代高通量測(cè)序技術(shù)，可以更加全面的檢測(cè)出sMPLC、肺內(nèi)轉(zhuǎn)移癌的癌變基因差異，并且能提供可能的良性變異信息，提高預(yù)防和診斷肺癌基因突變的準(zhǔn)確性和效率。