崔亞男 張 曼 張朋磊 劉 兵 郝 西 臧秀旺
(河南省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所,450002,河南鄭州)
花生(Arachis hypogaea L.)是我國重要的經(jīng)濟和油料作物,也是我國食用蛋白和食用植物油的重要來源[1-2]?;ㄉ且环N喜溫作物,在我國黃淮海流域早春播種的花生遇到低溫天氣時易出現(xiàn)出苗不齊和苗弱小的現(xiàn)象。種子在發(fā)芽過程中,根據(jù)吸水速率、發(fā)芽時間及后期生長可分為3個階段,分別為吸脹階段、吸水變慢并達到頂峰時期以及發(fā)芽后期,其中吸脹階段對低溫脅迫最為敏感[3-4]。喜溫農(nóng)作物種子若在吸脹期遇到0℃~12℃低溫,常發(fā)生吸脹冷害[5],此時的種子活力降低,出苗率和成苗率下降。種子吸脹冷害在多種農(nóng)作物上發(fā)生,已成為全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中亟待解決的重要問題之一[6]。因此,研究花生種子萌芽期抗寒的調(diào)控技術(shù)和耐寒生理機制,對指導花生及其他農(nóng)作物的生產(chǎn)具有深遠意義。
過氧化氫(H2O2)是植物體內(nèi)各種生理代謝的副產(chǎn)品,當植物受到非生物和生物脅迫時,它的含量迅速升高,過量H2O2會對細胞產(chǎn)生毒害作用,而適宜濃度的H2O2可作為信號物質(zhì)調(diào)控植物體內(nèi)一系列的生理生化反應以及減輕逆境帶來的傷害[7-8]。朱利君等[9]研究發(fā)現(xiàn),用0.3% H2O2對黃瓜浸種可介導抗氧化酶系統(tǒng),調(diào)控脫落酸(ABA)和赤霉素(GA)的含量來緩解鹽脅迫對種子萌發(fā)的抑制作用。張曼等[10]研究發(fā)現(xiàn),利用0.05% H2O2浸種能誘導油菜種子抗寒基因的表達和提高酶活性,達到促進種子萌發(fā)的作用。耶興元等[11]研究表明,H2O2通過調(diào)控抗氧化酶系統(tǒng)增強草莓苗的抗冷性。張美華[12]研究表明,H2O2通過調(diào)控玉米的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可減弱低溫對玉米萌發(fā)的影響。然而H2O2浸種對花生的萌芽及調(diào)控萌芽期的生理機制的影響研究仍不完善。
本研究以當前河南省主推花生品種豫花9326和豫花37為材料,研究H2O2浸種對吸脹冷害下花生品種的露白率、發(fā)芽勢和發(fā)芽率等發(fā)芽相關(guān)指標和膜脂過氧化產(chǎn)物、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及內(nèi)源激素含量的影響,探究H2O2浸種對吸脹冷害下花生種子萌發(fā)的影響和促進種子萌發(fā)的生理機制,為研發(fā)花生萌芽期耐寒性的調(diào)控技術(shù)提供理論依據(jù)。
試驗以高油花生品種豫花9326和高油酸花生品種豫花37為材料,材料均由河南省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所提供。豫花9326的基本性狀為普通大果型、直立疏枝、連續(xù)開花、籽仁含油量56.67%、油酸含量36.6%;豫花37的基本性狀為珍珠豆型、直立疏枝、連續(xù)開花、籽仁含油量55.96%、油酸含量77.0%。
采用智能人工氣候箱(寧波萊福科技有限公司,型號:FPG3型)進行萌發(fā)試驗。根據(jù)前期預試驗結(jié)果(未發(fā)表),H2O2浸種濃度選用50mmol/L,低溫(5℃)浸種48h是參照唐月異等[13]的試驗方法略加改動。試驗設(shè)置2個處理,分別為低溫(5℃)滅菌水浸種(CK)和低溫50mmol/L H2O2浸種(A1),每個處理重復3次。
1.2.1 種子消毒與浸種 每個重復挑選大小一致、飽滿的種子30粒,稱重記錄,種子用0.5%次氯酸鈉消毒5min,期間不斷攪拌,消毒后的種子用無菌水沖洗3遍。在5℃黑暗條件下,將消毒后的種子分別在滅菌水和50mmol/L H2O2中浸泡48h。
1.2.2 種子萌發(fā) 浸種結(jié)束后,將種子放入鋪有2層無菌水浸濕濾紙的培養(yǎng)皿中,25℃黑暗條件下培養(yǎng)6d,期間每天調(diào)查萌發(fā)和發(fā)芽數(shù),計算第4天的發(fā)芽勢和第6天的發(fā)芽率,并注意觀察補充滅菌水。
1.3.1 種子浸出液電導率 浸種結(jié)束后,用電導率儀[梅特勒-拖利多儀器(上海)有限公司,型號:S230]測定各處理種子浸出液電導率。電導率的計算公式如下:電導率[μS/(cm·g)]=(處理液測定值-空白對照測定值)/種子干重。
1.3.2 種子發(fā)芽相關(guān)指標 將胚根突破種皮視為露白,胚根≥2mm視為發(fā)芽。計算各處理的露白率、發(fā)芽勢、發(fā)芽率以及發(fā)芽指數(shù)。相關(guān)公式如下:露白率(%)=(露白種子數(shù)/種子總數(shù))×100,發(fā)芽勢(%)=(第4天的發(fā)芽數(shù)/種子總數(shù))×100,發(fā)芽率(%)=(第6天的發(fā)芽數(shù)/種子總數(shù))×100,發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt),其中Gt為第t天種子的發(fā)芽數(shù),Dt為發(fā)芽天數(shù)。
1.3.3 生理指標及激素含量 為進一步探究H2O2浸種促進吸脹冷害下花生種子萌發(fā)的生理機制,在萌發(fā)的第0、4、6天測定了豫花9326種子的丙二醛(MDA)、可溶性糖、可溶性蛋白及內(nèi)源激素含量。在發(fā)芽的第0、4、6天,挑選各處理長勢均勻的種子分別放入液氮中快速冷凍,然后放-80℃超低溫冰箱保存,采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司試劑盒(微量法)測定MDA、可溶性糖、可溶性蛋白、ABA及GA含量。
利用Microsoft Excel 2007和SPSS 25.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計、分析和作圖。利用最小顯著差異法(LSD)進行差異顯著性分析。
由圖1可知,與CK處理相比,A1處理降低了2個花生品種的電導率,豫花9326降低幅度更大。豫花9326和豫花37處理組的電導率分別為2.67和4.57μS/(cm·g),較對照組分別降低了47.67%和23.67%,差異均達到了顯著水平(P<0.05)。
由表1可知,萌發(fā)第3天CK處理下豫花9326和豫花37的露白率分別為75.76%和66.67%,A1處理分別為96.97%和85.71%,比CK處理分別提高了28.00%和28.56%,差異均達到了顯著水平(P<0.05)。萌發(fā)第6天豫花9326的CK和A1處理露白率分別為89.39%和96.97%,A1處理比CK處理提高了8.48%,豫花37的CK和A1處理露白率均為92.06%。由此可知,H2O2浸種能提高吸脹冷害下2個花生品種的露白率。
由表2可知,與CK處理相比,A1處理的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均有所提高。其中豫花9326的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)分別提高了31.25%、18.52%和50.53%。與CK處理相比,A1處理下豫花37的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)分別增加了14.58%、3.64%和36.13%。經(jīng)方差分析,豫花9326的對照組和處理組,發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)的差異均達到了極顯著水平(P<0.01),發(fā)芽率的差異達到了顯著水平(P<0.05);豫花37發(fā)芽勢和發(fā)芽率差異均不顯著(P>0.05),發(fā)芽指數(shù)差異達到了顯著水平(P<0.05)。綜上可知,H2O2浸種處理可提高吸脹冷害下豫花9326和豫花37的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)。
表2 H2O2浸種對花生種子發(fā)芽特性的影響Table 2 Effects of H2O2soaking treatments on the germination characteristics of peanut seed
根據(jù)電導率值、萌發(fā)率、發(fā)芽勢、發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)可以得出,在吸脹冷害下,H2O2浸種處理能提高種子的發(fā)芽能力,其中豫花9326更能響應H2O2這種促進發(fā)芽作用。
由圖2可知,隨萌發(fā)時間延長,CK處理的MDA含量不斷增加,與第0天相比,第4和6天的MDA含量均顯著提高,其中第6天的MDA含量增加了44.27%。A1處理下MDA含量呈先增加后降低的趨勢,與CK處理相比,A1處理第0、4、6天MDA的含量分別降低了0.22%(P>0.05)、7.05%(P<0.05)和32.55%(P<0.05)。根據(jù)以上試驗結(jié)果可知,在萌發(fā)的過程中,A1處理的MDA含量均低于CK處理。
圖2 H2O2浸種對花生種子MDA含量的影響Fig.2 Effects of H2O2soaking treatments on MDA content of peanut seed
如圖3a所示,在種子萌發(fā)第0天,即低溫浸種結(jié)束時,A1處理的可溶性糖含量顯著高于CK處理(P<0.05)。隨著萌發(fā)時間的延長,CK處理和A1處理可溶性糖含量均有所增加,但A1處理均高于CK處理。在萌發(fā)的第0、4、6天,與CK處理相比,A1處理可溶性糖含量分別提高了48.27%、53.42%和52.29%,差異均達到顯著水平(P<0.05)。
在種子萌發(fā)期間,豫花9326種子A1處理的可溶性蛋白含量高于CK處理(圖3b)。在萌發(fā)的第0、4、6天,與CK處理相比,A1處理種子的可溶性蛋白分別提高了59.66%、13.04%和43.76%,差異均達到了顯著水平(P<0.05)。
圖3 H2O2浸種對花生種子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響Fig.3 Effects of H2O2soaking treatments on osmotic regulating substances content of peanut seed
如圖4a所示,在萌發(fā)的第0、4、6天,CK處理ABA含量呈增加的趨勢,A1處理ABA含量表現(xiàn)出先降低后增加的趨勢。低溫浸種結(jié)束,即萌發(fā)第0天時,A1處理的ABA含量比CK處理提高了42.75%,顯著高于對照(P<0.05)。在萌發(fā)的第4、6天,與對照組相比,處理組的ABA含量分別降低了38.61%和16.32%,差異均達到了顯著水平(P<0.05)。
圖4 H2O2浸種對花生種子內(nèi)源激素含量的影響Fig.4 Effects of H2O2soaking treatments on endogenous hormones content of peanut seed
如圖4b所示,隨萌發(fā)時間延長,CK和A1處理的GA含量均呈現(xiàn)出增加的趨勢,但CK均低于A1處理。在萌發(fā)的第0、4、6天,相比CK,A1處理GA含量分別提高了176.09%、15.55%和32.02%,差異均達到了顯著水平(P<0.05)。
如圖4c所示,在種子萌發(fā)過程中,CK和A1處理下GA/ABA均呈現(xiàn)逐漸增長的趨勢。與CK處理相比,在萌發(fā)的第0、4、6天,A1處理的GA/ABA分別提高了92.44%、60.57%和53.76%,差異均達到了顯著水平(P<0.05)。
低溫脅迫是影響花生發(fā)芽及出苗的關(guān)鍵因素,因此研究花生品種耐低溫發(fā)芽的調(diào)控技術(shù)顯得尤為重要。一些研究[14-15]表明,H2O2能提高低溫脅迫下花生的萌發(fā)能力。本研究選用高油酸品種豫花37和高油品種豫花9326為試驗材料,發(fā)現(xiàn)H2O2可以提高2個花生品種在低溫脅迫下的發(fā)芽水平,然而H2O2緩解豫花9326吸脹冷害的效果比豫花37更顯著,可能是由于豫花37在種子萌芽階段對H2O2的敏感性較低。
當種子在萌發(fā)過程的吸脹階段受到低溫脅迫時,首先會破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)和機能。低溫使膜的形態(tài)發(fā)生了變化,膜脂發(fā)生凝固,膜從柔軟的液晶態(tài)變?yōu)槟z態(tài),質(zhì)膜出現(xiàn)裂縫,細胞透性增大,離子滲漏,破壞了原來正常的離子平衡[16]。在許多生理生化指標中,相對電導率最能直接反映膜系統(tǒng)的損傷程度[17],通常相對電導率越高,表明細胞膜透性越強,受傷害程度越大,植物抗寒能力越小[18]。在本研究中,當?shù)蜏亟N結(jié)束時,H2O2浸種處理的豫花9326和豫花37電導率分別比對照降低了47.67%和23.67%。Yu等[19]利用200mmol/L H2O2處理預冷的綠豆幼苗,相對電導率從86%降低到21%,與本試驗結(jié)果類似,但是所選H2O2濃度不同,這可能與所選作物不同或是種子和幼苗對H2O2敏感度不同有關(guān)。由此可知,H2O2預處理能降低電導率,減輕低溫對細胞膜的破壞。此外,在低溫脅迫下種子會產(chǎn)生過剩的自由基,引發(fā)或加劇膜脂過氧化作用。而膜脂過氧化的最終產(chǎn)物MDA會嚴重損傷生物膜。因此在植物抗寒生理研究中,MDA是鑒定細胞膜是否被破壞的標志物質(zhì)[14,18]。在本研究中,低溫浸種結(jié)束后的萌發(fā)過程中,無菌水浸種處理的MDA含量逐漸升高,而H2O2浸種處理的MDA含量逐漸降低。余燕等[15]研究表明,1% H2O2浸種能降低花生種子的MDA含量,從而提高種子的耐寒性,與本試驗的研究結(jié)果一致,說明H2O2浸種預處理能降低MDA含量和減弱低溫對細胞膜脂化程度,但是所選H2O2濃度的不同可能與花生品種或低溫處理方式不同有關(guān)。
低溫脅迫下植物能通過滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)保持細胞的滲透勢平衡,維持細胞原有的正常生理代謝活動,其中最主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)是可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)[20]。在辣椒[21]、菜豆[22]和油菜[8]等作物的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn),低溫能誘導可溶性糖和可溶性蛋白的積累。通過增加內(nèi)源滲透調(diào)解物質(zhì)的方式,增加細胞內(nèi)溶質(zhì)含量,提高細胞內(nèi)滲透勢,提供生物合成所需能量,增加細胞內(nèi)的結(jié)合水,降低凝固點,防止細胞被凍傷,從而增強抗寒性[18,23-24]。在前人[1]有關(guān)花生的研究中發(fā)現(xiàn),低溫脅迫條件下的種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)等指標與可溶性糖和可溶性蛋白含量呈正相關(guān)。與此同時,H2O2也能影響可溶性糖和可溶性蛋白含量。任艷芳等[25]利用H2O2提高鹽脅迫下小白菜種子內(nèi)可溶性糖和可溶性蛋白的含量,以緩解鹽脅迫對小白菜萌發(fā)的抑制作用。上述研究與本試驗研究結(jié)果相似。在本研究中,低溫浸種結(jié)束和萌發(fā)階段,H2O2浸種處理的種子可溶性糖和可溶性蛋白含量、增長量均顯著高于對照。由此可推測,H2O2處理可通過調(diào)控花生種子內(nèi)可溶性糖和可溶性蛋白的含量,達到提高種子萌發(fā)期耐寒性的作用。
種子的萌發(fā)過程受多種激素的調(diào)控,其中ABA對萌發(fā)有抑制作用,而與其拮抗的激素GA有打破休眠和促進胚根突破種皮的作用[26-29]。研究[30-31]認為,種子的休眠與萌發(fā)主要受GA和ABA的動態(tài)平衡調(diào)控,種子中GA/ABA的比值升高促使種子由休眠向萌發(fā)階段轉(zhuǎn)變,而GA/ABA比例下降使種子進入休眠狀態(tài)。此外ABA和GA還是植物對不同逆境產(chǎn)生響應的激素信號分子,可以廣泛參與各種生理過程的調(diào)節(jié)[32]。在夏軍等[33]的研究中,低溫可誘導海島棉種子內(nèi)源激素GA的合成和GA/ABA升高,抑制ABA合成,進而有助于內(nèi)源抑制物質(zhì)的降低,促進海島棉對低溫環(huán)境的適應能力和促進種子萌發(fā)。此外,在前人[34-35]的研究中發(fā)現(xiàn),在低溫脅迫下,通過使用外源物質(zhì),進而可起到誘導種子降低ABA生成量,提高GA含量和GA/ABA的作用,從而達到提高植株抗寒性的效果。在本研究中,當?shù)蜏亟N結(jié)束后,在萌發(fā)的過程中,ABA的含量呈現(xiàn)出先降低后增加的趨勢,而GA含量和GA/ABA呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢,這和前人研究的結(jié)果不太一致,可能與低溫處理方式的不同或者是所選植物不同有關(guān)。由此推測,在5℃低溫浸種時,H2O2促進花生種子ABA合成,降低GA含量,使種子維持休眠狀態(tài),減弱生理代謝活動,降低能量消耗,增強種子的耐低溫脅迫能力;而在低溫浸種結(jié)束后的常溫萌發(fā)過程中,H2O2促使GA含量增加與ABA含量減少,從而維持種子正常的生理代謝活動,加快種子萌發(fā)。
經(jīng)吸脹冷害后種子發(fā)芽受到抑制,而H2O2浸種能減弱低溫對種子萌發(fā)的抑制作用。H2O2處理可通過降低花生種子電導率和MDA含量以維持細胞膜的完整性,提高可溶性糖和可溶性蛋白的含量維持細胞滲透平衡,調(diào)控內(nèi)源激素ABA和GA含量,激活種子的抗寒生理過程,從而提高花生種子萌發(fā)期的抗寒性。