張偉杰，詹家奇，朱炳旺，張偉生，涂文劭，鄭曉春

隨著人口老齡化趨勢的發(fā)展，其相關(guān)內(nèi)分泌疾病——老年糖尿病(diabetes mellitus,DM)的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，成為嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量、增加家庭和社會負(fù)擔(dān)的重要代謝紊亂性疾病。研究發(fā)現(xiàn)，DM代謝異?？梢l(fā)全身各系統(tǒng)嚴(yán)重的并發(fā)癥，除了直接損傷周圍神經(jīng)外，血糖波動異?？赡茉黾覦M患者罹患認(rèn)知功能障礙的風(fēng)險[1-2]，該類患者臨床早期多表現(xiàn)為記憶和學(xué)習(xí)能力下降[3]，尤其在老年患者中已成為一個不容忽視的醫(yī)學(xué)和社會問題。但其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確，也缺乏有效的預(yù)防和治療方法。

近年，研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-451抑制劑可通過增強(qiáng)腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)的活性，從而抑制糖氧剝奪所誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞程序性壞死[4]，通過靶向上調(diào)miRNA-451的表達(dá)可加重帕金森病(Parkinson’s disease，PD)小鼠認(rèn)知功能障礙的發(fā)生和發(fā)展[5]。而老年DM患者學(xué)習(xí)記憶功能障礙發(fā)展至晚期更易發(fā)生阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)或PD。據(jù)此，筆者推斷miRNA-451的表達(dá)水平與老年DM相關(guān)學(xué)習(xí)記憶功能障礙的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。

本研究擬通過建立老年DM大鼠模型，探討miRNA-451的表達(dá)水平與老年DM相關(guān)學(xué)習(xí)記憶功能障礙嚴(yán)重程度之間的關(guān)系，以期為進(jìn)一步揭示老年DM相關(guān)學(xué)習(xí)記憶功能障礙發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選擇18～20月齡的雄性SD清潔級大鼠40只，體質(zhì)量(375±75)g，由福建醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供[動物許可證號：SYXK(閩)2016-0010]。大鼠12 h/12 h晝夜適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，采用電刺激方法，篩選出反應(yīng)靈敏的大鼠，測定空腹血糖，以空腹血糖為4～6 mmol/L作為入選標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑 鏈脲菌素(streptozotocin，STZ)、檸檬酸和檸檬酸鈉(廈門泰京生物技術(shù)有限公司)；生物化學(xué)制品磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)(廈門鷺隆生物科技發(fā)展有限公司)；miRNA Purification Kit試劑盒(中國康為世紀(jì)公司)。

1.1.3 儀器和設(shè)備 Morris水迷宮(KW-MWM，南京卡爾文生物科技有限公司)；動物行為視頻跟蹤分析系統(tǒng)(上海吉量軟件科技有限公司)；Biosystems 7500實(shí)時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)系統(tǒng)及SDS軟件2.1版(Applied Biosystem，美國Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建老年DM大鼠模型 采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)(含10%豬油、20%蔗糖、2.5%膽固醇、1%膽酸鹽)1個月誘導(dǎo)胰島素抵抗，期間自由飲水，1個月后禁食禁飲24 h，向腹腔內(nèi)注射用檸檬酸-檸檬酸鈉溶液溶解稀釋的STZ 35 mg/kg，注射后12 h恢復(fù)原飲食方案，3 d后測定空腹尾靜脈血糖濃度，超過≥16.7 mmol/L 即為建模成功。

1.2.2 分組 符合入選標(biāo)準(zhǔn)的老年大鼠連續(xù)進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練3 d，每日4次。Morris水迷宮訓(xùn)練結(jié)束后，將老年大鼠隨機(jī)分為兩組：(1)對照組(C組)10只，采用普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，喂養(yǎng)1周稱取體質(zhì)量并記錄，而后禁食禁飲24 h，根據(jù)體質(zhì)量向腹腔內(nèi)注射與實(shí)驗(yàn)組相同濃度的等容量檸檬酸-檸檬酸鈉溶液，注射完畢后繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)3 d。(2)實(shí)驗(yàn)組(T組)30只，均為建模成功的老年DM大鼠，根據(jù)成模后高血糖持續(xù)時間進(jìn)一步隨機(jī)分為3個亞組，即T1(1周)、T2(3周)和T3(6周)亞組，每個亞組10只，分別繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)1、3和6周。

1.3 測定指標(biāo)

1.3.1 Morris水迷宮測試評估學(xué)習(xí)記憶能力 Morris水迷宮直徑150 cm，高度60 cm，水深40 cm。水中加入適量牛奶，使水池呈現(xiàn)不透明的乳白色。將直徑12 cm的圓柱形實(shí)驗(yàn)平臺置于任一象限的中間水面下1 cm，水溫保持在23～25 ℃。將大鼠面朝池壁分別從4個入水點(diǎn)放入水池，記錄大鼠從入水到找到并站上水下隱蔽平臺所需的時間，作為潛伏期。大鼠找到平臺后，讓其在平臺上站立10 s。若大鼠入水后120 s仍未找到平臺，則由實(shí)驗(yàn)員將其輕輕從水中引導(dǎo)上平臺，并停留10 s，然后進(jìn)行下一次訓(xùn)練。每只大鼠從4個入水點(diǎn)分別放入水池為一次訓(xùn)練，2次訓(xùn)練間隔30 s。連續(xù)訓(xùn)練3 d，每日4次。大鼠Morris水迷宮測試采用動物行為視頻跟蹤分析系統(tǒng)記錄和分析：(1)定位航行實(shí)驗(yàn)，將各組大鼠從同一入水點(diǎn)放入水池，觀察和記錄大鼠尋找到平臺的路線圖和所需時間，即為潛伏期時間。(2)空間探索實(shí)驗(yàn)，定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，撤去平臺，將各組大鼠從同一入水點(diǎn)放入水池中，觀察和記錄120 s內(nèi)的運(yùn)動軌跡和穿越原平臺位置的次數(shù)。

1.3.2 miRNA提取 每組大鼠完成Morris水迷宮測試后處死取腦脊液(cerebrospinal fluid,CSF)0.1 mL凍存。選用miRNA Purification Kit試劑盒提取miRNA。室溫下解凍CSF樣品，取200 μL CSF樣品，加入5倍體積TRIzon Reagent反復(fù)吹打，使蛋白核酸復(fù)合物完全分離，離心5 min，取上層無水相于離心管中，加入1/3無水乙醇，過柱，洗柱2次。向吸附柱RS中加入700 μL Buffer RWT，離心后棄廢液，重新向吸附柱RS中加入500 μL Buffer RWT，離心后棄廢液，重復(fù)2次，向得到的吸附柱中間部位加入30～50 μL RNase-Free Water，離心后收集miRNA液，-80 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 熒光實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測 根據(jù)miRNA cDNA Sythesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行RT-PCR檢測。采用RT-PCR儀擴(kuò)增目的基因片段，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min→95 ℃變性10 s→56 ℃復(fù)性1 min，共40個循環(huán)。設(shè)計(jì)miRNA-451的反轉(zhuǎn)錄引物和RT-PCR擴(kuò)增序列(5’-3’)(PCR檢測時上下游引物成對)引物如下，miRNA-451相對表達(dá)量用2-△△Ct表示。每個樣本獨(dú)立實(shí)驗(yàn)3次。

內(nèi)參U6：

反轉(zhuǎn)錄引物：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’

RT-PCR引物：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’

miRNA-451：

反轉(zhuǎn)錄引物：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACTCAC-3’

RT-PCR引物：5’-AACATTCAACCTGTCGGTGAGT-3’

2 結(jié) 果

2.1 Morris水迷宮測試前大鼠血糖水平比較 與C組比較，T組各亞組的血糖均升高，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；T組各亞組組內(nèi)比較，差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。表明老年DM大鼠建模成功且血糖濃度穩(wěn)定，具有可比性。

2.2 大鼠Morris水迷宮測試結(jié)果、運(yùn)動軌跡及CSF中miRNA-451相對表達(dá)量比較 與C組比較，T組各亞組逃避潛伏期時間顯著延長、穿越原平臺次數(shù)顯著減少、miRNA-451相對表達(dá)量顯著增加，組間比較差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；T組各亞組組內(nèi)比較，隨著DM持續(xù)時間的延長，各亞組逃避潛伏期時間顯著延長、穿越原平臺次數(shù)顯著減少、miRNA-451相對表達(dá)量顯著增加，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。具體見表1及圖1。各組大鼠Morris水迷宮運(yùn)動軌跡見圖2。

表1 各組大鼠空腹血糖、Morris水迷宮測試結(jié)果及CSF中miRNA-451相對表達(dá)量比較Tab.1 Comparisons of fasting blood glucose,Morris water maze test results and relative expression of miRNA-451 in CSF in each group

A：逃避潛伏期時間；B：穿越原平臺次數(shù)。與C組比較，☆：P<0.05；與T1組比較，▲：P<0.05；與T2組比較，#：P<0.05。圖1 Morris水迷宮測試結(jié)果Fig.1 Test results of Morris water maze

圖2 各組大鼠Morris水迷宮運(yùn)動軌跡Fig.2 Morris water maze motion trajectory of rats in each group

2.3 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果 CSF中miRNA-451表達(dá)水平與Morris水迷宮測試成績中的逃避潛伏期的相關(guān)系數(shù)r值為0.997(>0.8)，兩者顯著正相關(guān)(P=0.003)；與穿越原平臺次數(shù)相關(guān)系數(shù)r值為-0.975(<-0.8)，兩者顯著負(fù)相關(guān)(P=0.025)。

3 討 論

研究表明，與DM患者認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)的年齡為60～80歲[6]。此年齡段患者常伴有其他基礎(chǔ)疾病，導(dǎo)致臨床癥狀隱匿，診斷較為困難。因此，通過尋找靈敏度和特異度較高的指標(biāo)來診斷該類患者的早期認(rèn)知功能障礙及嚴(yán)重程度，是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

miRNA是由21～23個核苷酸組成的單鏈非編碼RNA，存在于機(jī)體各種體液中，包括CSF、唾液和血液等，可與mRNA結(jié)合沉默基因的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。既往研究證明，血清miRNA可作為疾病相關(guān)的診斷和預(yù)后標(biāo)記物，如AD診斷標(biāo)準(zhǔn)和血管損傷生物標(biāo)志物相組合可增加AD的敏感性和特異性[7]。miRNA-451是一種多功能的miRNA，目前證實(shí)其在很多方面均具有重要作用，例如血液系統(tǒng)疾病、神經(jīng)發(fā)育、心血管疾病等方面[5]。大量研究數(shù)據(jù)顯示，巨噬細(xì)胞移動抑制因子(macrophagemigration inhibitor factor，MIF)可能是miRNA-451一個重要的靶標(biāo)基因[8]。miRNA-451通過靶向負(fù)性調(diào)控MIF基因的表達(dá)，抑制腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移能力以及血管形成能力，從而造成血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)的損傷，導(dǎo)致BBB滲透性增加。臨床影像學(xué)研究表明，PD患者基底節(jié)區(qū)BBB滲透性增加[9]。

本研究結(jié)果顯示，隨著老年DM大鼠高血糖持續(xù)時間的延長，其水迷宮潛伏期時間逐漸延長，目標(biāo)象限穿越次數(shù)逐漸減少，表明維持長期高血糖狀態(tài)下，老年DM大鼠的學(xué)習(xí)記憶力開始下降并逐漸加重。既往研究發(fā)現(xiàn)，DM前期的人群，大約42%在4 a 內(nèi)發(fā)生認(rèn)知功能下降，大約54%在8 a內(nèi)發(fā)生血管性癡呆[10]，表明隨著DM病程的進(jìn)展，其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)認(rèn)知功能的損害程度逐漸加重，本研究結(jié)果與之一致。為進(jìn)一步探索其發(fā)病機(jī)制，本研究通過收集和分析DM持續(xù)過程的不同時間點(diǎn)CSF中miRNA-451 表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，其增加的程度與老年DM大鼠學(xué)習(xí)記憶功能損害的嚴(yán)重程度變化趨勢相關(guān)，進(jìn)一步采用Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，兩者之間成顯著正相關(guān)關(guān)系，表明長期高血糖狀態(tài)可誘發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)miRNA-451表達(dá)水平增加，進(jìn)而導(dǎo)致認(rèn)知功能下降。推測與長期高血糖誘發(fā)miRNA-451表達(dá)升高，并通過抑制MIF的表達(dá)抑制細(xì)胞增殖、遷移和血管生成，從而導(dǎo)致老年DM大鼠BBB損傷有關(guān)，這可能是引起老年DM相關(guān)血管性認(rèn)知功能損害的重要機(jī)制。

MIF是集細(xì)胞因子、生長因子、激素和酶特性于一身的多效能蛋白分子，能夠阻止巨噬細(xì)胞從毛細(xì)血管中促炎遷移，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)行使重要的作用。陳嘉寧等[11]研究顯示，通過下調(diào)miRNA-451表達(dá)，增加MIF的表達(dá)對PD模型小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)多巴胺能神經(jīng)元和海馬區(qū)細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用，這種保護(hù)作用可有效改善PD小鼠認(rèn)知功能障礙。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著DM病程的進(jìn)展，C、T1、T2和T3 4組大鼠CSF中miRNA-451的表達(dá)水平逐漸上升，大鼠的認(rèn)知功能障礙程度逐漸加重，表明隨著DM持續(xù)時間的增加，miRNA水平的上升在一定程度上抑制MIF的表達(dá)，造成DM大鼠神經(jīng)系統(tǒng)多巴胺能神經(jīng)元和海馬區(qū)細(xì)胞的損傷。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MIF被活化后可通過激活下游IL-8、VCAM-1和ICAM-1等細(xì)胞因子的表達(dá)升高調(diào)節(jié)血管新生[12]。在促進(jìn)新生微血管生成方面，MIF呈劑量依賴性上調(diào)21個內(nèi)皮細(xì)胞血管生成基因，特別是VEGF165和Smadl基因的表達(dá)，這是MIF參與大血管病變、DM相關(guān)的微血管病變、血管新生等過程的重要機(jī)制[13]，這些調(diào)節(jié)機(jī)制與老年DM相關(guān)認(rèn)知障礙中關(guān)于腦微血管損傷導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶功能障礙的理論依據(jù)一致。因此，可推測，在miRNA-451參與DM患者早期認(rèn)知功能障礙損傷的機(jī)制中，miRNA-451表達(dá)的動態(tài)變化在預(yù)測老年DM相關(guān)學(xué)習(xí)記憶功能障礙的發(fā)生和發(fā)展中具有重要的臨床意義。但本實(shí)驗(yàn)未進(jìn)一步探討miRNA-451下游分子的變化情況，將在今后進(jìn)一步研究。另外，該結(jié)論是否也適用于老年DM患者，需在今后臨床工作中進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，隨DM持續(xù)時間的延長，老年DM大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能障礙逐漸加重，其嚴(yán)重程度與CSF中miRNA-451表達(dá)水平的升高程度成正相關(guān)。miRNA-451可能通過抑制MIF的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖、遷移和血管生成等機(jī)制導(dǎo)致老年DM大鼠BBB損傷，從而引起老年DM相關(guān)血管性認(rèn)知功能損害。