韓靜，蔣暢，張繼州，鄒俊,2，胡娟,3

栝樓桂枝湯是張仲景的《金匱要略》中治療外感熱病引起的痙攣及內(nèi)傷雜病中出現(xiàn)的抽搐、發(fā)痙、手足蠕動等癥的經(jīng)典方。方藥由天花粉30 g、桂枝9 g、白芍9 g、甘草6 g、生姜9 g和大棗12枚組成，具有調(diào)和陰陽氣血、柔潤筋脈、養(yǎng)陰生津的功效。在臨床實踐中，該方用于治療腦卒中后肢體痙攣，取得了顯著的療效[1-2]。該方在福建省第二人民醫(yī)院使用已有十余年，臨床療效確切，已開發(fā)為院內(nèi)制劑 (閩2013S0001)[3]，主治腦卒中后痙攣性偏癱、脊髓損傷后、下肢靜脈曲張、帕金森病、小兒抽搐癥、甲狀腺功能亢進癥、癲癇等出現(xiàn)肢體肌肉痙攣或震顫癥狀者。臨床報道，栝樓桂枝湯不僅對腦卒中后肢體痙攣具有較好的療效，也可用于治療癲癇患者[4-5]，改善癥狀并降低腦電圖評分。

中醫(yī)理論認為，不同疾病在其發(fā)展過程中，由于出現(xiàn)了相同的病機，可以辨證為同一證候，在治療上可用同樣的方法，即中藥復(fù)方具有“異病同治”的功能，其基礎(chǔ)是“證同治亦同”，“證”是治療的關(guān)鍵。栝樓桂枝湯在中醫(yī)臨床實踐中用于解除神經(jīng)系統(tǒng)痙攣癥狀，所對的證是“痙證”。腦卒中后遺癥患者中醫(yī)證候表現(xiàn)為陰血虧虛、脈絡(luò)受阻、筋脈失養(yǎng)，導(dǎo)致肢體痙攣拘急[6]，采用栝樓桂枝湯主治。《金匱要略》中所述痙病“痙為病，胸滿口噤，臥不著席，腳攣急，必齘齒”，與癲癇大發(fā)作全身骨骼肌持續(xù)收縮、項背強直、角弓反張基本相符[7]，栝樓桂枝湯治療癲癇的療效亦在臨床中得到證實。由此可見，栝樓桂枝湯具有“異病同治”的特性。

栝樓桂枝湯解痙作用的分子機制尚不明確，近年來，很多研究對栝樓桂枝湯干預(yù)腦缺血損傷的機制進行了探討，發(fā)現(xiàn)該方對腦缺血損傷的細胞模型和動物模型的保護作用機制主要包括抗炎、抗凋亡、調(diào)節(jié)興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)、促進神經(jīng)發(fā)生及軸突重塑等[8-11]。然而，中藥復(fù)方藥味眾多，成分復(fù)雜，作用靶標廣泛，作為一個主要作用為緩解肢體肌肉痙攣或震顫癥狀的中藥復(fù)方，上述研究尚不足以說明該方解痙作用的主要機制，若能從“異病同治”的角度對該方的解痙作用機制進行探討，可在一定程度上縮小該方可能的作用靶標范圍，對其解痙作用的核心機制有更清晰的認識。

近年來，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)成為中藥復(fù)方作用機制預(yù)測的新興方法，其核心是以“網(wǎng)絡(luò)靶標”為切入點，將方藥與病證映射于生物分子網(wǎng)絡(luò)，以網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ)建立方藥與病證的關(guān)聯(lián)機制[12]，通過網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)分析預(yù)測中藥作用的核心靶標及核心化合物。為了揭示栝樓桂枝湯解痙作用的核心藥效機制，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法探究該方“異病同治”腦卒中和癲癇的網(wǎng)絡(luò)靶標，以期明確栝樓桂枝湯解痙作用的中心靶標通路，為后續(xù)藥物的進一步開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 栝樓桂枝湯的中藥成分及靶標的收集 以栝樓桂枝湯各單味中藥的拼音名為檢索詞，從中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫(the encyclopedia of traditional Chinese medicine，ETCM)(http://www.tcmip.cn/ETCM/)中查詢各單味藥包含的化合物及其靶標信息[13]。查詢2020版《中國藥典》中各單味藥的成分信息予以補充，并從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)獲取相應(yīng)補充成分的靶標[14]。最后在Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)中將所有靶標蛋白轉(zhuǎn)換成標準基因名，建立數(shù)據(jù)集。

1.2 疾病靶標的預(yù)測 以“Stroke，Ischemic Stroke”“Cerebral Infarction”“Brain Ischemia”“Hemorrhagic Stroke”和“Epilepsy”為關(guān)鍵詞，從DisGeNet(http://www.disgenet.org/)和MalaCards數(shù)據(jù)庫(https://www.malacards.org/)中分別檢索與腦卒中和癲癇相關(guān)的基因，建立腦卒中和癲癇疾病靶標數(shù)據(jù)集。

1.3 栝樓桂枝湯“異病同治”腦卒中和癲癇的靶標預(yù)測及靶標網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用Venny 2.1工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)，將栝樓桂枝湯成分對應(yīng)的靶標與腦卒中和癲癇相關(guān)基因繪制韋恩圖，獲得中藥復(fù)方與疾病的交叉靶點，這些靶點可能是該復(fù)方治療腦卒中和癲癇的相同潛在作用靶點。進一步采用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)對交集靶標進行蛋白相互作用分析，設(shè)置信度≥0.4為篩選標準，并將存在相互作用的靶標蛋白輸入Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建“靶標網(wǎng)絡(luò)”。

1.4 基因功能及通路富集分析 采用DAVID 6.8在線工具(https://david.ncifcrf.gov/)對上述治療靶標進行基因本體論注釋(gene ontology，GO)，并進行富集分析，同時進行京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，分類富集參數(shù)選擇“Medium”。繼而在Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建“成分—靶標—通路”網(wǎng)絡(luò)并進行網(wǎng)絡(luò)分析，獲得栝樓桂枝湯治療腦卒中和癲癇異病同治的關(guān)鍵化合物和關(guān)鍵靶標及通路。

1.5 分子對接驗證 選取1.4中分析獲得的核心靶標及對其有調(diào)控作用的化合物進行分子對接驗證。在PDB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org)下載核心靶標蛋白質(zhì)pdb格式的3D結(jié)構(gòu)文件，通過PyMol(Ver.2.4)軟件對受體蛋白進行去水分子及加氫處理。在PubChem數(shù)據(jù)庫下載候選化合物的SDF格式結(jié)構(gòu)文件，采用Chem 3D軟件繪制三維結(jié)構(gòu)，MM2力場優(yōu)化構(gòu)象后，保存為mol2格式文件，在AutoDockTools軟件中轉(zhuǎn)化為PDBQT 格式；采用AutoDock Vina(Ver.1.1.2)進行受體蛋白質(zhì)與配體化合物的分子對接驗證。

2 結(jié) 果

2.1 栝樓桂枝湯主要成分及對應(yīng)靶標 栝樓桂枝湯由6味中藥組成，各藥材包含的主要成分經(jīng)去重后共378個，相應(yīng)的潛在靶標經(jīng)去重后共886個(表1)。

表1 栝樓桂枝湯“成分—靶標”基本信息Tab.1 “Compound-target”basic information of Gualou Guizhi Decoction

2.2 栝樓桂枝湯治療腦卒中和癲癇的共同靶標預(yù)測 在DisGeNet和MalaCards數(shù)據(jù)庫中檢索腦卒中和癲癇相關(guān)基因，分別獲得腦卒中相關(guān)基因1 093個、癲癇相關(guān)基因1 239個，二者與栝樓桂枝湯的 886個靶標共存在45個交集靶標(圖1)。

圖1 栝樓桂枝湯與腦卒中和癲癇靶標的韋恩圖Fig.1 Veen diagram of compound targets of Gualou Guizhi Decoction,stroke-related targets,and epilepsy-related targets

2.3 GO富集和KEGG通路富集分析 GO富集分析結(jié)果包括生物學(xué)過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和細胞組分(cellular component,CC)。栝樓桂枝湯治療腦卒中和癲癇的45個共同靶標經(jīng)DAVID在線工具分析，富集在16個聚類。聚類富集分數(shù)最高的簇如圖2A所示，涉及的生物學(xué)過程主要有：離子型谷氨酸受體信號通路、化學(xué)突觸傳遞、興奮性突觸后電位、N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptors，NMDAR)活性的調(diào)節(jié)等；涉及的分子功能主要有谷氨酸門控離子通道活性、離子型谷氨酸受體活性、NMDA谷氨酸受體活性等；細胞組分主要位于突觸后膜、NMDA選擇性谷氨酸受體復(fù)合物、突觸后致密區(qū)和樹突棘等。

KEGG通路富集分析顯示，45個潛在作用靶標涉及的通路主要富集在2個聚類，聚類富集分數(shù)最高的簇包含14條通路，主要有肌萎縮性側(cè)索硬化癥、cAMP信號通路、Rap1信號通路、Ras信號通路、阿爾茨海默病、谷氨酸能突觸、長時程增強、苯丙胺成癮、多巴胺能突觸、鈣離子信號通路等(圖2B)。

2.4 “成分—靶標—通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 采用Cytoscape 構(gòu)建的栝樓桂枝湯治療腦卒中和癲癇的“異病同治”的“成分—靶標—通路”網(wǎng)絡(luò)見圖3，共有191個節(jié)點、627條邊。45個“異病同治”靶標由復(fù)方中132個成分靶向，平均連接度值為19.37，高于平均值的靶標有19個(表2)。對網(wǎng)絡(luò)中的成分分析顯示，靶向疾病靶標的栝樓桂枝湯化學(xué)成分的平均連接度值為2.23，高于平均值的成分有36個(表3)，大部分來自天花粉、桂枝、白芍、甘草和大棗。

表3 栝樓桂枝湯“成分—靶標—通路”網(wǎng)絡(luò)中的核心成分Tab.3 Main active compounds of Gualou Guizhi Decoction in the “compound-target-pathway”network

A：GO分析；B：KEGG通路分析。圖2 栝樓桂枝湯治療腦卒中和癲癇靶標的GO分析和KEGG通路分析Fig.2 Gene ontology and KEGG pathway analysis of the targets of Gualou Guizhi Decoction in the treatment of stroke and epilepsy

紫色：成分；黃色：靶點；紅色：通路；節(jié)點：連接度的數(shù)量。圖3 栝樓桂枝湯治療腦卒中和癲癇的“成分—靶標—通路”圖Fig.3 Compound-target-pathway interaction network of Gualou Guizhi Decoction in treating stroke and epilepsy

表2 栝樓桂枝湯“異病同治”的核心靶標Tab.2 Core targets of Gualou Guizhi Decoction in the effects of “treating different diseases with the same method”

進一步分析KEGG顯著富集的14條通路及落在這些通路上的靶標構(gòu)成的 “靶標—通路”網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，每個靶標平均出現(xiàn)在3.78條通路中，而GRIN2A、GRIN2B、GRIN1、CALM1、GRIA2和AKT1等靶標所在通路數(shù)量均高于平均值，分別為14、13、13、10、9和4條。從“核心靶標—成分—草藥”網(wǎng)絡(luò)可見(圖4)，它們主要由來自天花粉、桂枝、白芍、甘草和大棗的β-谷甾醇、兒茶素、熊竹素、齊墩果酸、3’，7-二羥基-4’，6-二甲氧基異黃酮、皂苷元、亞油酸、棕櫚酸、亞麻酸、13-甲基十四烷酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、溴酸、L-α-氨基-δ-羥基戊酸、豆甾醇、樺木酸和去甾醇等23個成分所調(diào)控。

2.5 分子對接結(jié)果 核心靶標GRIN2A、GRIN2B和GRIN1均由β-谷甾醇、齊墩果酸、豆甾醇、L-高絲氨酸、樺木酸、去甾醇和溴酸所調(diào)節(jié)(圖4)，選取β-谷甾醇、齊墩果酸和豆甾醇3個活性報道較多的化合物分別與3個靶標進行分子對接。3個靶標分子與β-谷甾醇、齊墩果酸和豆甾醇的結(jié)合能大多小于-29.31 kJ/mol，其中β-谷甾醇和豆甾醇與GRIN1靶點的結(jié)合能較為相似，結(jié)合中心坐標略有差別；齊墩果酸和豆甾醇在與GRIN2A靶點的結(jié)合過程中雖具有較為相似的結(jié)合模式，但在結(jié)合能上存在差異(表4，圖5)。

紫色：成分；黃色：靶點；綠色：草藥。圖4 栝樓桂枝湯“異病同治”的“核心靶標—成分—草藥”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Core target-compound-herb interaction network of Gualou Guizhi Decoction in the effects of “treating different diseases with the same method”

表4 栝樓桂枝湯“異病同治”核心靶標—化合物結(jié)合能Tab.4 Binding degree of main active components to core targets of Gualou Guizhi Decoction in the effects of “treating different diseases with the same method”

藍色虛線：氫鍵；灰色虛線：疏水相互作用；黃色虛線：離子相互作用。圖5 化合物—靶點最優(yōu)結(jié)合模式圖Fig.5 Molecular docking diagram between compounds and core targets

3 討 論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法由清華大學(xué)的李梢教授首次提出[15-16]，由于其與中醫(yī)藥認識疾病的整體觀、系統(tǒng)論的觀點極為契合，近年來在中醫(yī)藥領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過構(gòu)建栝樓桂枝湯“異病同治”腦卒中和癲癇的“中藥—活性化合物—靶標”網(wǎng)絡(luò)，進行網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)分析，并結(jié)合分子對接驗證，探討該方解痙作用的關(guān)鍵靶標及通路，加深對其分子機制的認識。

腦卒中和癲癇的發(fā)病機制均十分復(fù)雜，發(fā)病均起于腦部損傷。雖發(fā)病機制不同，但二者發(fā)病后的肢體痙攣癥狀具有一定相似性，推測可能具有相似的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。本研究在DisGeNet和MalaCards數(shù)據(jù)庫中獲得腦卒中和癲癇的相關(guān)靶標分別為1 093和1 239個，共同靶標206個，這是2種疾病可“異病同治”的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

在這些靶標中，有45個為栝樓桂枝湯化學(xué)成分所調(diào)節(jié)，說明栝樓桂枝湯可通過這些靶標發(fā)揮“異病同治”腦卒中和癲癇的作用。GO注釋和KEGG通路分析結(jié)果顯示，這些靶標的分子功能主要富集于對離子型谷氨酸受體通路的調(diào)節(jié)；細胞定位主要位于突觸后膜、谷氨酸受體復(fù)合物等組分；涉及的信號通路主要聚集于神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的通路，如谷氨酸能突觸、長時程增強、多巴胺能突觸、鈣離子信號通路等。這些結(jié)果顯示栝樓桂枝湯具有顯著的神經(jīng)系統(tǒng)藥理活性。

對“靶標—通路”網(wǎng)絡(luò)的分析顯示，GRIN2A、GRIN2B、GRIN1、GRIA2、CALM1和AKT1等靶標出現(xiàn)在高于平均值的通路中，同時也是“成分—靶標—通路”網(wǎng)絡(luò)的核心靶標，表明這些靶標可被栝樓桂枝湯中多味中藥的多個成分共同調(diào)控，在靶標網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用。具體來看，GRIN2A、GRIN2B、GRIN1和GRIA2是離子型谷氨酸受體通路(GO:0035235)的主要組成部分，離子型谷氨酸受體包括NMDAR和α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionate receptors，AMPAR)。GRIN2A、GRIN2B和GRIN1編碼功能型NMDAR的組成亞基，GRIA2是AMPAR的組成亞基。谷氨酸受體通路在腦卒中和癲癇的發(fā)病中均為關(guān)鍵通路[17]。腦缺血后，細胞外谷氨酸蓄積，導(dǎo)致谷氨酸受體過度激活，從而引起細胞內(nèi)鈣超載和興奮性神經(jīng)元損傷。通過靶向谷氨酸受體功能調(diào)節(jié)抵消這種影響是腦缺血治療研究領(lǐng)域的重要方向。離子型谷氨酸受體在癲癇的發(fā)作中起重要作用[18]。谷氨酸受體激動劑被證實在嚙齒類動物模型中可引起癲癇發(fā)作，已有很多研究試圖采用谷氨酸受體拮抗劑治療癲癇發(fā)作，但結(jié)果并不一致。GRIN1是NMDAR的專有亞基，功能與NMDAR一致，其拮抗劑在體內(nèi)顯示出對缺血性神經(jīng)元損傷的強大神經(jīng)保護作用[19]。而GRIN2亞基賦予NMDAR獨特的離子通道特性和細胞內(nèi)運輸途徑，通過膜轉(zhuǎn)運方式調(diào)節(jié)突觸處NMDAR的數(shù)量，并與細胞內(nèi)其他各種調(diào)節(jié)蛋白亞基發(fā)生特異性相互作用，從而控制生理病理進程[20]。CALM1鈣調(diào)蛋白通過鈣結(jié)合介導(dǎo)對大量酶、離子通道、水通道蛋白和其他蛋白質(zhì)的控制。CAML1 mRNA的表達在缺血性腦卒中患者中顯著增高[21]。

前期研究顯示，栝樓桂枝湯可降低腦缺血大鼠腦脊液中谷氨酸水平，并下調(diào)腦組織AMPAR亞基和NMDA谷氨酸受體的蛋白質(zhì)表達[8,22]，作用于谷氨酸受體，干擾Ca2+與鈣調(diào)蛋白的結(jié)合[23]。本研究分子對接驗證顯示，栝樓桂枝湯主要活性化合物齊墩果酸、β-谷甾醇、豆甾醇與NMDAR亞基GRIN1、GRIN2A和GRIN2B均有結(jié)合。分子對接的結(jié)合緊密程度由結(jié)合能體現(xiàn)，結(jié)合能數(shù)值越小，表明兩者之間的結(jié)合越緊密。本研究靶標分子與主要活性化合物的結(jié)合能大多小于-29.31 kJ/mol，表明受體蛋白質(zhì)與配體分子之間有較好的結(jié)合。這些結(jié)果與前期研究報道相互印證?；仡櫸墨I可發(fā)現(xiàn)，齊墩果酸是五環(huán)三萜類化合物，具有顯著的神經(jīng)系統(tǒng)藥理活性，對腦缺血再灌注大鼠具有顯著神經(jīng)保護作用，可減少腦缺血所致的神經(jīng)細胞凋亡[24]；還有研究發(fā)現(xiàn)，齊墩果酸可延長癲癇發(fā)作潛伏時間，通過抗炎抗氧化起神經(jīng)保護作用[25]，通過維持海馬突觸可塑性改善Aβ誘導(dǎo)的AD大鼠記憶喪失[26]，減弱NMDAR拮抗劑MK-801誘導(dǎo)的小鼠精神分裂癥樣行為[27]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，含有β-谷甾醇和豆甾醇的藥用植物Aloysiatriphylla可通過NMDAR發(fā)揮抗焦慮作用[28]。本研究AutoDock可視化分析顯示，NMDAR亞基與齊墩果酸和β-谷甾醇等化合物之間有緊密的化學(xué)鍵連接，說明栝樓桂枝湯可通過這些成分作用于NMDAR，發(fā)揮抗痙攣作用。

此外，本研究結(jié)果還顯示，在“化合物—靶標—通路”網(wǎng)絡(luò)中高于平均度值的靶標有19個，均是能被栝樓桂枝湯中多味中藥和多個成分共同調(diào)控的重要靶標。其中GRIN2A、GRIN2B、GRIN1、GRIA2、APP、CNR1和CALM1為神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)靶標，AKT1、IL-6、IL-1β、TLR4和PI3CG參與炎癥反應(yīng)，ESR1、ALDH2、INS、ALB和PLA2G1B為內(nèi)分泌及代謝相關(guān)靶標。已有報道栝樓桂枝湯可調(diào)節(jié)癲癇患者血清IL-6和IL-1β的表達水平[29]，但目前尚未見栝樓桂枝湯對APP、CNR1、TLR4及內(nèi)分泌代謝相關(guān)靶標調(diào)節(jié)的直接報道。這些研究結(jié)果表明，栝樓桂枝湯作為一個中藥復(fù)方，其作用是多靶點、多方向的，除了能調(diào)節(jié)離子型谷氨酸受體通路，還可能通過其他機制發(fā)揮解痙作用，值得進一步深入研究。

綜上，本研究網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果表明，栝樓桂枝湯具有神經(jīng)系統(tǒng)藥理活性，作用于離子型谷氨酸受體活性調(diào)節(jié)通路中的GRIN2A、GRIN2B、GRIN1、CALM1和GRIA2等靶標是該方“異病同治”腦卒中后肢體痙攣和癲癇的關(guān)鍵分子機制。該方主要成分β-谷甾醇、齊墩果酸、豆甾醇等化合物是其發(fā)揮解痙作用的活性物質(zhì)。除此之外，栝樓桂枝湯還可參與調(diào)節(jié)一氧化氮生物合成通路、炎癥及內(nèi)分泌代謝相關(guān)通路等，從多靶點對疾病網(wǎng)絡(luò)進行調(diào)節(jié)。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析方法，為栝樓桂枝湯解痙作用的機制研究提供了新的思路。然而，本研究作為一項網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測研究，尚存在一定局限性。本研究所獲取的中藥復(fù)方成分靶標來自數(shù)據(jù)庫預(yù)測，后續(xù)還將開展基礎(chǔ)實驗佐證，據(jù)此對其確切機制進行進一步的深入探索。