邵一鳴，張濛，張新安，連鴻凱

1.鄭州大學第二附屬醫(yī)院骨科，河南 鄭州 450014； 2.鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院骨科，河南 鄭州 450001； 3.河南省人民醫(yī)院骨科，河南 鄭州 450003

骨關節(jié)炎是一種嚴重影響中老年人生活質量的關節(jié)退行性疾病。其主要特點為關節(jié)軟骨退變、滑膜炎癥和關節(jié)間隙變窄，臨床表現為關節(jié)疼痛腫脹、活動受限及畸形改變[1-3]。據估計，全球約有3億人患有骨關節(jié)炎，這是導致老年人殘疾的主要原因之一[4-5]。因此，早期診斷和治療可以延緩骨關節(jié)炎的進展[6]。目前，臨床治療早期骨關節(jié)炎以口服藥物為主，如糖皮質激素類、非甾體類消炎藥、阿片類鎮(zhèn)痛藥和對乙?；宇愃幬颷7-8]。這些藥物僅僅針對疾病的癥狀，并沒有從根本上改變骨關節(jié)炎的病理狀況，而且還伴有一系列藥物不良反應，如胃腸毒性、肝腎損傷和心血管損傷等[9-10]。因此，尋找一種更安全、更有效治療骨關節(jié)炎的藥物具有重要意義。

槲皮素是一種廣泛分布于植物界的黃酮類化合物，具有抗氧化應激、抗炎、免疫調節(jié)等多種作用[11]。研究表明，槲皮素可以通過抑制IRAK1/NLRP3信號通路進一步抑制白細胞介素-1β誘導的炎癥反應和細胞凋亡，減輕大鼠關節(jié)軟骨的退化和侵蝕[12]。但由于槲皮素治療骨關節(jié)炎的療效受多種途徑調節(jié)，機制較為復雜，常用的藥理學方法難以對其進行系統(tǒng)分析。網絡藥理學可以通過高通量篩選、網絡可視化、網絡拓撲分析等方法揭示成分、靶點和疾病之間復雜的網絡關系，準確預測和分析其潛在的作用機制[13]。因此，本研究旨在利用生物信息學分析和分子對接技術闡明和驗證槲皮素治療骨關節(jié)炎的分子作用機制，為其臨床應用和基礎研究提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 槲皮素結構及靶點的獲取使用中藥系統(tǒng)藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP，https：//tcmsp-e.com/)獲取槲皮素的結構及其靶點信息，并通過UniProt 數據庫(https：//www.uniprot.org/)將靶點轉換為相對應的人源基因名。

1.2 骨關節(jié)炎疾病靶點獲取使用基因表達綜合數據庫(gene expression omnibus，GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載與骨關節(jié)炎相關的高通量測序數據。在數據庫中以"osteoarthritis"為關鍵詞檢索，篩選得到編號為GSE82107的全基因組測序數據。該數據中含有17個樣本，其中包括7例正常膝關節(jié)滑膜組織標本和10例終末期骨關節(jié)炎患者膝關節(jié)滑膜組織標本。上述所有測序數據集均基于GPL570平臺的GEO數據庫下載。利用R軟件的"limma"包進行兩組之間的差異性分析，設置|log2(FC)|>1，校正后P值<0.05，篩選出數據中具有差異表達的基因，差異分析結果以火山圖及熱圖的形式進行可視化展示。此外，在GeneCards數據庫(https：//www.genecards.org/)中以"osteoarthritis"為關鍵詞進行檢索，將其檢索所得的疾病靶點作為補充。

1.3 槲皮素治療骨關節(jié)炎的潛在作用靶點預測使用在線軟件VRNNY2.1(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)對上述所得的槲皮素靶點和骨關節(jié)炎疾病靶點進行映射，得到兩者的交集靶點，并繪制韋恩圖。

1.4 蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡的構建及核心靶點的篩選通過STRING在線數據庫(http：//string-db.org/)對交集靶點進行分析，在中置信度(0.700)處設置所需的最低相互作用分數，并隱藏游離靶點，構建靶點PPI網絡，導出PPI數據。將上述數據導入 Cytoscape 3.8.2 軟件(http：//www.cytoscape.org)，對該PPI網絡進行拓撲分析和核心靶點篩選，其中核心靶點的篩選條件為該網絡中的節(jié)點度、中介中心性及接近中心均大于其平均值。

1.5 “槲皮素-交集靶點-骨關節(jié)炎”對應關系網絡構建為了更加清晰地呈現槲皮素與骨關節(jié)炎之間的對應關系，使用Cytoscape 3.8.2 軟件繪制“槲皮素-交集靶點-骨關節(jié)炎”網絡圖。

1.6 富集分析將1.4篩選到的核心靶點提交至Metascape在線數據庫(https：//metascape.org/)，進行基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析、京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，其中KEGG分析中設置P<0.05，得到槲皮素治療骨關節(jié)炎相關的生物學功能和信號通路。

1.7 分子對接在Pubchem在線數據庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載槲皮素的2D結構，使用OpenBabel軟件轉化為mol2格式。隨后從蛋白質數據庫(protein data bank，PDB，https：//www.rcsb.org/)下載PPI網絡中度值靠前的靶點的配體PDB格式文件，采用PyMOL軟件去除其中的水分子和配體分子，在SwissDock網站(http：//www.swissdock.ch/)分別上傳以上得到的結構文件進行分子對接。

2 結果

2.1 槲皮素的結構及相關靶點通過TCMSP數據庫檢索得到140個槲皮素對應靶點。槲皮素相關信息詳見表1。

表1 槲皮素的結構及信息

2.2 骨關節(jié)炎疾病靶點的獲取對編號為GSE82107的數據進行差異性分析后，得到1 745個與骨關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展有顯著影響的基因，其中上調基因369個，下調基因1 376個，分析結果見圖1。同時，在GeneCards數據庫中獲得骨關節(jié)炎相關基因3 211個，兩者合并去重后共得到骨關節(jié)炎相關靶點4 746個。最后映射出槲皮素治療骨關節(jié)炎的潛在作用靶點104個，見圖2。

圖1 GSE82107差異性分析的熱圖及火山圖

2.3 交集靶點PPI網絡的構建及核心靶點的篩選使用STRING在線數據庫構建交集靶點PPI網絡，網絡中包含100個節(jié)點和719條邊。以“節(jié)點度值”“中介中心性”和“接近中心性”3個主要參數篩選關鍵基因，篩選閾值為節(jié)點度值≥ 14.38，中介中心性≥0.013，接近中心性≥0.447，篩選后剩余26個節(jié)點和287條邊。篩選過程見圖3。

圖2 槲皮素-骨關節(jié)炎交集靶點韋恩圖

2.4 “槲皮素-交集靶點-骨關節(jié)炎”網絡構建采用Cytoscape 3.8.2軟件構建 “槲皮素-交集靶點-骨關節(jié)炎”對應關系網絡，見圖4。網絡圖中黑色節(jié)點代表靶點，紅色節(jié)點代表“槲皮素”，藍色節(jié)點代表“骨關節(jié)炎”，線條代表槲皮素、骨關節(jié)炎與靶點具有對應關系。

2.5 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析為了進一步系統(tǒng)地闡明槲皮素治療骨關節(jié)炎的機制，采用Metascape數據庫對26個核心靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。選取P值排列前10位的結果分別以氣泡圖進行可視化展示。GO功能富集分析獲得了928個結果，其中包括生物學過程(biological process，BP)863個、細胞組成(cellular component，CC)26個、分子功能(molecular function，MF)39個。GO功能富集分析表明，生物過程主要集中于對腫瘤壞死因子、脂多糖、凋亡信號通路等調節(jié)；細胞成分主要集中在膜筏、質膜蛋白復合物、轉錄調節(jié)因子復合體中；分子功能主要表現為細胞因子受體結合、蛋白激酶結合和腫瘤壞死因子受體超家族結合等，見圖5。KEGG通路富集分析得到111條相關通路，主要包括癌癥相關通路、PI3K/AKT信號通路、凋亡、NF-κB信號通路等，詳見圖6。

圖3 槲皮素治療骨關節(jié)炎的PPI網絡拓撲分析圖

圖4 槲皮素-交集靶標-骨關節(jié)炎網絡圖

圖5 GO功能富集分析

圖6 KEGG通路富集分析

2.6 分子對接結果一般認為，配體與受體結合穩(wěn)定時的結合能越低，發(fā)生作用的可能性越大；當結合能≤-5.0 kcal·mol-1時，兩者具有良好的親和力。分子對接結果顯示：槲皮素與關鍵靶點之間的結合能均<-5.0 kcal·mol-1，與腫瘤壞死因子、MYC、AKT1的結合能分別為-7.36、-6.96、-7.31 kcal·mol-1。由此表明，槲皮素與治療骨關節(jié)炎的關鍵作用靶點具有較好的結合活性，見圖7。

圖7 槲皮素與腫瘤壞死因子、MYC、AKT1的分子對接模式圖

3 討論

在天然化合物中，黃酮類化合物已成為治療多種疾病的潛在候選藥物。槲皮素是一種存在于多種水果和植物中的黃酮類多酚化合物，具有預防和治療心血管疾病、神經退行性疾病以及癌癥等作用[14]。研究表明，槲皮素可以通過抑制SIRT1/AMPK介導的內質網應激進一步抑制大鼠軟骨細胞氧化應激誘導的細胞凋亡，達到減輕關節(jié)軟骨退變的效果[15]。另外，槲皮素還可以通過抑制軟骨細胞的炎癥和凋亡調節(jié)滑膜巨噬細胞向M2巨噬細胞的極化，為軟骨細胞創(chuàng)造有利環(huán)境，促進軟骨修復，從而發(fā)揮軟骨保護作用[16]。但是由于槲皮素通過多途徑、多靶點的特點作用于骨關節(jié)炎，更多的作用機制還有待于進一步研究發(fā)現。

筆者從PPI網絡中篩選到了腫瘤壞死因子、AKT1、MYC、CCND1、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)等26個槲皮素治療骨關節(jié)炎的核心靶點。腫瘤壞死因子-α是一種由包括巨噬細胞在內的多種細胞產生的炎癥細胞因子。在骨關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤壞死因子-α通過抑制蛋白多糖的合成和刺激基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)的產生引起關節(jié)軟骨不穩(wěn)，從而導致關節(jié)軟骨的降解[17]。腫瘤壞死因子-α還可以刺激促炎和促代謝介質的合成，如MMP-1、MMP-3、白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)、IL-8等，這些介質均在引起關節(jié)炎癥、降解軟骨基質蛋白過程中發(fā)揮重要作用[18]。當阻斷腫瘤壞死因子-α受體時可明顯抑制軟骨中一氧化氮的產生，而一氧化氮是滑膜組織中潛在的凋亡介質。此外，腫瘤壞死因子-α還可以直接或間接激活TLR信號級聯(lián)反應引起細胞凋亡[19-20]。MYC基因是一組致癌基因，其家族成員包括C-myc、N-myc和L-myc。研究發(fā)現，C-myc基因沉默可以促進細胞增殖并抑制IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞中的細胞凋亡和細胞因子表達[21]。EGFB在健康的關節(jié)軟骨中高度表達，它可以促進關節(jié)中滑液的分泌，保持軟骨表面潤滑以及提高關節(jié)軟骨機械強度。EGFR活性的降低會導致關節(jié)軟骨在發(fā)育過程中產生結構、功能和機械方面的損害，并在骨關節(jié)炎的病理過程中顯著加速軟骨退化[22]。

通過對核心靶點的GO功能富集分析，發(fā)現槲皮素治療骨關節(jié)炎的潛在靶點與骨和軟骨細胞的增殖修復、細胞凋亡以及炎癥機制的形成等生物學過程密切相關。軟骨細胞凋亡可能是調控軟骨退變的有效靶點。因為，軟骨細胞活力的喪失是人類骨關節(jié)炎的一個重要標志[23]。炎癥在骨關節(jié)炎的發(fā)病機制中也起著核心作用。關節(jié)軟骨、軟骨下骨、滑膜組織、韌帶和半月板都參與了骨關節(jié)炎炎癥網絡的形成[24]。因此，炎癥通路的靶向治療可能為未來骨關節(jié)炎的臨床治療提供新思路。

KEGG通路富集分析結果顯示，槲皮素治療骨關節(jié)炎的關鍵通路為PI3K/AKT信號通路、凋亡和NF-κB信號通路。PI3K/AKT是一條非常重要且相當復雜的信號通路，它在許多細胞穩(wěn)態(tài)過程中都發(fā)揮重要作用，包括細胞周期、細胞存活、炎癥、新陳代謝和凋亡等[25-26]。同時，PI3K/AKT信號通路也是軟骨細胞存活和凋亡的重要調節(jié)因子[27]。大量研究表明，多種生長因子和生物活性物質可通過激活PI3K/AKT信號通路減少軟骨細胞凋亡，從而發(fā)揮骨關節(jié)炎保護作用，如胰島素樣生長因子-1、血小板衍生生長因子BB、委陵菜酸等[28-29]。NF-κB信號通路不僅參與調控軟骨正常發(fā)育和病理破壞，而且是骨關節(jié)炎相關炎癥介質的主要調節(jié)因子，其主要由IKB激酶介導的IkBa降解和RelA磷酸化所激活[30-31]。活化的PI3K/AKT還可以參與NF-κB p65的磷酸化和核轉位，促進炎癥介質的產生[32]。由此可見，槲皮素可以通過以上關鍵通路及靶點調節(jié)骨關節(jié)炎過程中的炎癥、免疫、凋亡等達到防治骨關節(jié)炎的效果。

最后，本研究通過分子對接技術驗證了槲皮素與腫瘤壞死因子、AKT1、MYC之間的結合能力。結果顯示，槲皮素可分別與腫瘤壞死因子、AKT1、MYC形成穩(wěn)定的對接模型，這進一步證實了之前的推測結果。

綜上所述，本研究采用生物信息學方法對槲皮素治療骨關節(jié)炎的作用機制進行了綜合分析，結果提示槲皮素對骨關節(jié)炎的治療作用是通過“多靶點、多途徑”的特點在抗炎、抑制軟骨細胞凋亡方面發(fā)揮協(xié)同作用。這與現有的研究結果相互吻合，為今后槲皮素的藥理機制分析提供了數據支持，但本研究結果還需要后續(xù)進一步的實驗研究加以驗證。