王強，何超，胡城，李莉，向萍

1.石首市人民醫(yī)院，湖北 石首 434400； 2.荊州市職業(yè)技術學院附屬醫(yī)院，湖北 荊州 434020

肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae，KP)是最常見的革蘭氏陰性病原體之一，可引起支氣管肺炎和支氣管炎，且常出現(xiàn)強耐藥性[1-2]?？死撞窝滓蚱洳∏閲乐?、并發(fā)癥發(fā)生率高、死亡率高而成為主要的公共衛(wèi)生威脅，即使采用抗菌藥物治療后，其死亡率也高達50%[3-5]。羽扇豆醇是一種三萜類化合物，主要存在于橄欖、杧果等水果中[6]。研究發(fā)現(xiàn)，羽扇豆醇具有抗炎和抗腫瘤等生物學作用[7-9]。但是，關于羽扇豆醇對肺部感染肺炎克雷伯菌大鼠的保護作用機制研究甚少。因此，本研究基于核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號通路探討羽扇豆醇對肺炎克雷伯菌大鼠肺損傷的影響，以期為羽扇豆醇應用于臨床治療肺炎克雷伯菌大鼠肺損傷提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物45只SPF級健康成年雄性SD大鼠，6～8月齡，體質(zhì)量280～320 g，購自武漢貝賽模式生物科技有限公司，許可證號：SYXK(鄂)2021-0119。動物飼養(yǎng)于室溫23 ℃，濕度55%的環(huán)境中，可自由飲水，12 h晝夜交替照明。本研究動物實驗遵從國家有關實驗動物保護規(guī)范和管理條例。

1.2 藥物與試劑羽扇豆醇(美國Sigma公司，貨號：L5632，純度：99%)；半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)抗體、Caspase-9抗體、 B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)抗體、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)抗體、p65抗體、p-P65抗體(英國Abcam公司，貨號：ab13847、ab185719、ab32503、ab196495、ab16502、ab194726)；HRP標記的小鼠抗兔二抗、γ-干擾素(interferon gamma，IFN-γ)抗體、白細胞介素-4(interleukin-6，IL-4)抗體、CD4抗體(美國Santa Cruz公司，貨號：sc-2357、sc-52556 FITC、sc-53084 FITC、sc-13573 PE)；抗IgG-FITC抗體、PE-anti-IgG1抗體(美國Sigma公司，貨號：F1763、FCMAB230P)；蛋白Marker、PierceTMBCA定量試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司，貨號：26616、23227)；PVDF膜(美國Millipore公司，貨號：IPVH00010)；RIPA裂解液(強)、極超敏ECL化學發(fā)光試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，貨號：P0013B、P0018FS)；誘導型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)試劑盒、巨噬細胞趨化蛋白-1(macrophage chemoattractant protein 1，MCP-1)測試盒、IL-10測試盒(南京建成生物工程研究所，貨號：H372-1、H115、H009)；TUNEL反應試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司，貨號：G001-1)。

1.3 儀器Olympus DP71型顯微鏡(日本Olympus公司)；Microfuge22R型高速低溫離心機(美國Beckman公司，離心半徑13.5 cm)；MedGraphics 1085D型肺功能儀器(美國麥加菲公司)；Varioskan Flash型多功能酶標儀 (美國 Thermo Fisher Scientific公司)；AMA440N型高壓滅菌鍋(英國Astell公司)；MINI4型電泳槽、170-3940型電轉(zhuǎn)儀(美國 Bio-Rad公司)；GDS-800型凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP公司)。

2 方法

2.1 克雷伯菌肺炎大鼠模型建立、動物分組與給藥大鼠適應性喂養(yǎng)后隨機分為對照組、模型組、羽扇豆醇低劑量組、羽扇豆醇中劑量組及羽扇豆醇高劑量組，每組各9只。除對照組外，其余組大鼠參照文獻方法建立克雷伯菌肺炎大鼠模型[10]，具體如下：大鼠經(jīng)腹腔注射80 mg·kg-1氯胺酮麻醉，頸部消毒、備皮后，無菌操作，暴露大鼠上段氣管，用 1 mL 注射器刺入氣管并滴入濃度為1.2×109CFU·mL-1的菌液0.15 mL；對照組滴入相同體積的生理鹽水。接種后立即豎立大鼠固定臺，使大鼠保持直立位約20 s，以保證接種菌液因重力作用而入肺。觀察造模后大鼠的臨床表現(xiàn)，若體溫升高，活動度及進食明顯下降，體質(zhì)量減輕，有明顯的呼吸喘鳴聲等則表明造模成功。所有大鼠均造模成功，第6天進行藥物干預，羽扇豆醇低、中、高劑量組分別用10 mg·kg-1、20 mg·kg-1、50 mg·kg-1的羽扇豆醇腹腔注射給藥，一次性給藥劑量為1 mL，連續(xù)給藥7 d。

2.2 大鼠肺功能的檢測采用肺功能儀器測量各組大鼠的靜息通氣量、氣道阻力改變和肺容積變換，并做好記錄。

2.3 HE染色觀察肺組織病理損傷取部分肺臟組織放入4%多聚甲醛溶液進行固定，24 h后脫水，石蠟包埋、切片；然后HE染色：將切片分別置于二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ及不同純度(100%、95%、90%、80%、70%)的酒精中各10分鐘，自來水沖洗；蘇木精染色、伊紅染色；由低到高濃度酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片；光學顯微鏡拍照，觀察其形態(tài)特征。

2.4 TUNEL染色檢測肺組織細胞凋亡首先對包埋的大鼠肺組織進行脫蠟、復水及抗原修復，然后使用TUNEL反應試劑盒，將配好的反應液滴于標本上，置于濕盒中，37 ℃孵育1 h。用PBS洗3次，每次 15 min，滴加合適濃度的ToPro熒光探針反應 15 min，然后再用PBS清洗3次，每次15 min。最后用中性樹脂封片，顯微鏡下拍照記錄。

2.5 流式細胞儀檢測外周血輔助性T細胞1(helper T cell 1,Th1)和Th2的水平取1 mL抗凝混勻全血加入等量淋巴細胞分離液，各組均離心后分離外周血單個核細胞，隨后加入紅細胞裂解液將殘余紅細胞裂解，離心取沉淀，制成1×106mL-1的細胞懸液200 μL，并等量分到測定管與對照管中，測定管加入CD4抗PE抗體10 μL進行胞外染色，然后加10倍稀釋的FACS溶血素2 mL進行溶血及破膜，最后分別加入IFN-γ抗體、IL-4抗體各 10 μL，對照管加入IgG-FITC抗體和PE-anti-IgG1抗體，混勻后室溫避光30 min。每管加1%多聚甲醛500 μL，采用流式細胞儀進行檢測。

2.6 ELISA檢測外周血清iNOS、MCP-1、IL-10的含量嚴格按照大鼠iNOS、MCP-1、IL-10 ELISA試劑盒說明書操作步驟進行操作測定大鼠血清iNOS、MCP-1、IL-10的含量。

2.7 Western Blot檢測凋亡及NF-κB相關蛋白的表達水平取適量肺臟組織，按13體積比加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液進行勻漿，12 000 r·min-1離心10 min，取上清，根據(jù) BCA 試劑盒說明書測蛋白濃度。勻漿上清液與上樣緩沖液11配比，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗(稀釋比例為11 000) 4 ℃ 孵育過夜，二抗(稀釋比例為1500)室溫孵育1 h，TBST漂洗，ECL發(fā)光劑顯影，采用 BIO-RAD Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，用Image J2x 軟件對各抗體條帶灰度值進行統(tǒng)計。

3 結(jié)果

3.1 羽扇豆醇對大鼠肺功能的影響與對照組比較，模型組靜息通氣量、氣道阻力改變及肺容積變換均明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，羽扇豆醇中、高劑量組靜息通氣量、肺容積變換及氣道阻力改變明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 不同組大鼠的肺功能比較

3.2 羽扇豆醇對大鼠肺組織病理學的影響對照組肺臟胸膜完整，間質(zhì)無水腫，無炎性細胞浸潤，無充血，結(jié)構(gòu)正常；模型組肺臟間質(zhì)嚴重水腫，肺泡內(nèi)出現(xiàn)大量炎性細胞和纖維素樣物質(zhì)沉積，組織局灶性壞死，肺泡壁明顯增厚；與模型組比較，羽扇豆醇中、高劑量組肺組織病變程度明顯減輕。見圖1。

圖1 不同組大鼠肺組織形態(tài)學變化(HE染色，×400)

3.3 羽扇豆醇對大鼠肺組織細胞凋亡的影響與對照組比較，模型組肺組織細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，羽扇豆醇中、高劑量組肺組織細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。 見圖2。

注：A：肺組織細胞凋亡TUNEL染色圖(×400)；B：肺組織細胞凋亡量化結(jié)果比較。與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖2 不同組大鼠肺組織細胞凋亡率比較

3.4 羽扇豆醇對大鼠肺組織凋亡相關蛋白表達的影響與對照組比較，模型組Cleaved Caspase-3/Caspase-3、Cleaved Caspase-9/Caspase-9、Bax/Bcl-2的水平均明顯升高 (P<0.05)。與模型組比較，羽扇豆醇中、高劑量Cleaved Caspase-3/Caspase-3、Cleaved Caspase-9/Caspase-9、Bax/Bcl-2的水平均明顯降低 (P<0.05)。見圖3。

注：A：凋亡相關蛋白條帶；B：凋亡相關蛋白量化結(jié)果比較。與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖3 不同組大鼠肺組織細胞凋亡相關蛋白表達水平比較

3.5 羽扇豆醇對大鼠外周血中Th1和Th2水平的影響與對照組比較，模型組Th1 (CD4+IFN-γ+) 水平明顯升高 (P<0.05)。與模型組比較，羽扇豆醇中、高劑量組Th1 (CD4+IFN-γ+)水平均明顯降低 (P<0.05)；Th2 (CD4+IL-4+) 水平均明顯升高 (P<0.05)。見圖4。

注：A：流式細胞儀檢測Th1、Th2的水平；B、C：Th1、Th2水平比較。與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖4 不同組大鼠外周血中Th1、Th2水平比較

3.6 羽扇豆醇對大鼠血清中iNOS、MCP-1、IL-10 含量的影響與對照組比較，模型組iNOS、MCP-1含量均明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，羽扇豆醇中、高劑量組iNOS、MCP-1含量均明顯降低(P<0.05)，IL-10含量明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 不同組大鼠血清中iNOS、MCP-1、IL-10的含量比較

3.7 羽扇豆醇對NF-κB活化的影響與對照組比較，模型組P65磷酸化水平明顯升高 (P<0.05)。與模型組比較，羽扇豆醇中、高劑量組P65磷酸化水平均明顯降低 (P<0.05)。見圖5。

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖5 不同組大鼠肺組織凋亡相關蛋白表達比較

4 討論

在克雷伯菌肺炎模型中，病原體抵達下呼吸道，滋生繁殖，引起肺泡毛細血管充血、水腫、肺泡內(nèi)纖維蛋白滲出及細胞浸潤等炎性癥狀，產(chǎn)生大量炎癥因子，加重體內(nèi)炎癥反應[11]。研究發(fā)現(xiàn)，肺部感染肺炎克雷伯菌后會出現(xiàn)大面積的炎癥反應，肺泡實質(zhì)和血管周圍有明顯的炎癥浸潤，肺泡壁增厚、水腫[12-13]。雖然，目前尚無關于羽扇豆醇對克雷伯菌肺炎作用的報道，但有學者研究發(fā)現(xiàn)羽扇豆醇能調(diào)節(jié)iNOS及IL-6、IL-1β等因子水平，緩解機體炎癥，減輕組織損傷[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，羽扇豆醇處理后，肺部感染肺炎克雷伯菌大鼠的靜息通氣量、肺容積變換及氣道阻力改變均明顯升高，肺組織病變程度減輕，表明羽扇豆醇可改善克雷伯菌肺炎大鼠肺損傷。

細胞凋亡是由細胞內(nèi)凋亡相關基因直接調(diào)控，Bax、Bcl-2、caspase-9和caspase-3均在細胞凋亡過程中起著關鍵作用[15-16]。已有研究發(fā)現(xiàn)，在羽扇豆醇預處理的肝細胞中，Bax/Bcl-2的水平及Caspase-3和Caspase-9的蛋白表達水平降低，證實了羽扇豆醇體外調(diào)控細胞凋亡的作用[17]。同樣，研究發(fā)現(xiàn)，羽扇豆醇可通過增強線粒體抗氧化應激抑制高糖誘導的髓核細胞凋亡，上調(diào)Bcl-2的表達，而下調(diào)Bax、caspase 9、caspase 3的表達[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型大鼠給予羽扇豆醇處理后細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3/Caspase-3、Cleaved Caspase-9/Caspase-9、Bax/Bcl-2的水平均明顯降低，表明羽扇豆醇可抑制肺組織細胞凋亡，從而發(fā)揮肺保護作用，與已有的相關研究結(jié)果一致。

肺炎克雷伯菌感染可引起炎癥細胞流入肺實質(zhì)，并伴有促炎細胞因子和化學因子的釋放，造成中性粒細胞聚集[19-20]。有研究發(fā)現(xiàn)，羽扇豆醇可誘導iNOS和NLRP3的mRNA表達水平下調(diào)，起到抗炎的作用[6，21]。而MCP-1可進一步干擾免疫系統(tǒng)的平衡，觸發(fā)其他免疫細胞的浸潤，加重炎癥的嚴重程度[22]。Wang等報道羽扇豆醇可下調(diào)MCP-1的表達，上調(diào)抗炎因子IL-10的表達，從而減輕炎癥[23]。Thl、Th2作為CD4+T的兩個亞組，分泌不同的細胞因子，Thl細胞主要分泌IFN-γ，Th2主要分泌IL-4和IL-10[24]。有研究證實，羽扇豆醇處理后增加了Th2/Th1細胞因子的分泌比率，表明羽扇豆醇可能具有抗炎作用[25-26]。與前人研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)羽扇豆醇處理后Th1 (CD4+IFN-γ+)水平和 iNOS、MCP-1含量降低；Th2 (CD4+IL-4+) 水平和IL-10含量升高，表明羽扇豆醇可減輕肺部炎癥，改善肺部感染肺炎克雷伯菌所引起的肺損傷。

NF-κB是調(diào)節(jié)炎癥最重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，激活的NF-κB可轉(zhuǎn)移到細胞核并與促炎基因啟動子結(jié)合，導致基因表達和炎癥反應增強，從而導致炎癥損傷[27-28]。研究發(fā)現(xiàn)，羽扇豆醇對NF-κB信號通路具有抑制作用，IκBα磷酸化減弱[29-30]。與前人研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)，羽扇豆醇處理后P65磷酸化水平降低，表明羽扇豆醇可有效抑制 NF-κB 的活化。

綜上所述，羽扇豆醇可抑制NF-κB的活化，改善肺部感染肺炎克雷伯菌大鼠肺損傷，并減輕炎性反應，為羽扇豆醇應用于肺炎的臨床防治提供理論依據(jù)。