黃引，蔡國偉，鐘瑩，肖穎，秦飛，賴燁才*，林順權(quán)（1.廣州白云山醫(yī)藥集團股份有限公司白云山制藥總廠，廣州 510515；2.廣東省化學藥原料與制劑關(guān)鍵技術(shù)研究企業(yè)重點實驗室，廣州 510515；.廣州牌牌生物科技有限公司，廣州 51050）

鹽酸美金剛（memantine hydrochloride），化學名為1-氨基-3，5-二甲基金剛烷鹽酸鹽，是一類新的通過阻斷

N

-甲基-

D

-天門冬氨酸（NMDA）受體作用于谷氨酸能系統(tǒng)從而治療阿爾茨海默病的藥物。鹽酸美金剛可抑制興奮性神經(jīng)傳遞遞質(zhì)谷氨酸的過度釋放，減輕鈣離子過多所致的神經(jīng)元細胞中毒、損傷和死亡，從而改善阿爾茨海默病患者的癥狀，具有耐受性良好、用藥安全的特點。隨著仿制藥一致性評價工作的開展，國內(nèi)對藥品雜質(zhì)研究的重視程度越來越高，對于雜質(zhì)控制與評價的先進理念、關(guān)鍵技術(shù)的需求也越來越大，藥品儲存過程中降解雜質(zhì)會隨著儲存時間的延長而增加，有效控制降解雜質(zhì)是亟需解決的問題。鹽酸美金剛片在長期儲存過程中，與輔料微晶纖維素會發(fā)生美拉德反應，產(chǎn)生降解雜質(zhì)

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸，化學名為（3，5-二甲基-1-金剛烷）氨基乙酸，分子式為CHNO，化學結(jié)構(gòu)見圖1。制劑中輔料硬脂酸鎂的存在，會使pH 升高從而促進美拉德反應，使

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸的含量增高。同時，在本文中影響因素試驗堿性破壞條件下，

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸含量明顯增高，進一步證明堿性條件對美拉德反應有促進作用。

圖1 N-（二甲基金剛烷）甘氨酸的化學結(jié)構(gòu)式Fig 1 Chemical formula of N-（dimethyl-monosane）glycine

為了更好地控制藥品質(zhì)量，保證用藥安全，建立快速有效的檢測方法對雜質(zhì)

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸進行嚴格控制至關(guān)重要。鹽酸美金剛及其相關(guān)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)式和紫外吸收全波長掃描光譜圖均顯示無特征吸收和末端吸收，因此無法采用紫外-可見光檢測器對雜質(zhì)進行定量；另外，TLC法存在分離能力差、重現(xiàn)性差、靈敏度低等缺點，目前鹽酸美金剛含量測定及雜質(zhì)的定量檢測多采用氣相色譜（GC）法。前期研究發(fā)現(xiàn)，GC 法對于降解雜質(zhì)

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸并不適用，推測此雜質(zhì)在GC 中容易發(fā)生高溫降解而影響檢測。進口注冊標準中以0.1%三氟乙酸水溶液作為流動相，梯度洗脫30 min，單離子模式（SIM）同時對美金剛?cè)樘羌雍衔锖?p>N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸進行檢測。因本文研究的鹽酸美金剛片工藝中未涉及乳糖的使用，無需對美金剛?cè)樘羌雍衔镞M行研究控制；同時為減少長期使用三氟乙酸對質(zhì)譜儀造成的損傷，擬采用甲酸水溶液替換三氟乙酸水溶液并在質(zhì)譜多反應監(jiān)測模式（MRM）下等度洗脫（運行時間10 min），對目標雜質(zhì)

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸進行快速、準確的定量控制。最低本文建立了一種高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）分析方法對鹽酸美金剛片中

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸進行定量檢測，并對方法進行了驗證，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent1260-AB Sciex 4000 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent 公司）；Sartorius CPA 225D 型分析天平（德國Sartorius 公司）；Merck Millipore Milli-Q 實驗室超純水系統(tǒng)（德國Merck Millipore公司）。

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸對照品（TRC，批號：6-NSR-122-1，含量：98%）；鹽酸美金剛片（廣州醫(yī)藥集團股份有限公司白云山制藥總廠，批號：01171202、01171203、01171204，規(guī)格：10 mg）；甲醇、甲酸（美國Merck 公司，色譜純）；水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 液相色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱Phenomenex Luna C（150 mm×4.6 mm，5 μm）；以0.1%（

V

/

V

）甲酸水溶液-甲醇（30∶70）為流動相，等度洗脫；流速：0.5 mL·min；柱溫：30℃；進樣量：10 μL，運行時間：10 min。2.1.2 質(zhì)譜條件 采用三重四極桿質(zhì)譜檢測器，電噴霧離子源（ESI）；電噴霧電壓為3500 V；離子源溫度為500℃；以高純氮氣為干燥氣；二級碰撞能（CE）為2 V；正離子模式下選擇質(zhì)荷比為（

m

/

z

）238.1/163.3 的離子對進行定性定量檢測，質(zhì)譜圖見圖2，裂解途徑見圖3。

圖2 全掃描質(zhì)譜圖（A）和離子對提取質(zhì)譜圖（B）Fig 2 Full scan mass spectrogram（A）and ion-pair extraction mass spectrogram（B）

圖3 N-（二甲基金剛烷）甘氨酸的裂解途徑Fig 3 Fragmentation pathway of N-（dimethyl-monosane）glycine

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液 取

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸對照品適量，精密稱定，用甲醇-水（50∶50）溶解并定量稀釋制成1 μg·mL的對照品儲備液。精密量取對照品儲備液適量，用甲醇-水（50∶50）分別稀釋制成質(zhì)量濃度為0.01、0.03、0.10、0.20、0.30、0.50、0.70 和1.00 μg·mL的標準曲線系列對照品溶液。2.2.2 系統(tǒng)適用性溶液 稱取適量的

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸對照品，用甲醇-水（50∶50）溶解并定量稀釋成1 μg·mL的溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.2.3 供試品溶液 取本品1 片，置100 mL 量瓶中，用甲醇-水（50∶50）溶解并定量稀釋制成0.1 mg·mL的溶液，作為供試品溶液。

2.2.4 破壞試驗用溶液

① 空白輔料：取空白輔料適量，精密稱定，置100 mL 量瓶中，用甲醇-水（50∶50）溶解并定量稀釋至刻度，作為空白輔料溶液。

② 酸破壞：取本品1 片，置100 mL 量瓶中，用適量甲醇-水（50∶50）溶解，加入0.1 mol·L鹽酸溶液1 mL，于80 ℃水浴加熱2 h，用0.1 mol·L氫氧化鈉溶液中和，用甲醇-水（50∶50）稀釋至刻度，作為酸破壞供試品溶液。

③ 堿破壞：取本品1 片，置100 mL 量瓶中，用適量甲醇-水（50∶50）溶解，加入0.1 mol·L氫氧化鈉溶液1 mL，于80 ℃水浴加熱2 h，用0.1 mol·L鹽酸溶液中和，用甲醇-水（50∶50）稀釋至刻度，作為堿破壞供試品溶液。

④ 高溫破壞：取本品1 片，置100 mL 量瓶中，用適量甲醇-水（50∶50）溶解，置80℃水浴中加熱2 h 后冷卻至室溫，用甲醇-水（50∶50）稀釋至刻度，作為高溫破壞供試品溶液。

⑤ 氧化破壞：取本品1 片，置100 mL 量瓶中，用適量甲醇-水（50∶50）溶解，加入30%過氧化氫溶液1 mL，置80 ℃水浴中加熱2 h 后冷卻至室溫，用甲醇-水（50∶50）稀釋至刻度，作為氧化破壞供試品溶液。

⑥ 光照破壞：取本品1 片，置蒸發(fā)皿內(nèi)，用適量甲醇-水（50∶50）溶解，于254 nm 紫外波長下照射2 h 后，將溶液移至100 mL 量瓶中，用甲醇-水（50∶50）稀釋至刻度，作為光照破壞供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性要求

取系統(tǒng)適用性溶液連續(xù)進樣6 次，

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸峰面積的

RSD

不得大于10.0%，保留時間的

RSD

不得大于2.0%。

2.4 測定法

本文所有色譜圖均由Analyst 軟件1.6.3 版本采集積分產(chǎn)生。標準曲線由MultiQuant 3.0.2 軟件采用二次回歸擬合方程

y

＝a

x

＋b

x

＋c 繪制，其中

y

為對照品溶液中

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸的峰面積，

x

為

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸的質(zhì)量濃度，相關(guān)系數(shù)

r

應不小于0.998。在結(jié)果解析方程中，取系列對照品溶液質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與峰面積成正相關(guān)的值作為

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸的質(zhì)量濃度，計算出其相對于鹽酸美金剛的含量。

2.5 系統(tǒng)適用性

取系統(tǒng)適用性溶液連續(xù)進樣6 次，記錄

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸的峰面積和保留時間，并計算相應

RSD

值，結(jié)果

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸峰面積

RSD

為2.3%，保留時間

RSD

為0.1%，表明系統(tǒng)適用性良好。

2.6 專屬性試驗

按照“2.1”項下色譜條件，分別測定“2.2.4”項下的酸、堿、高溫、氧化及光照破壞條件下的各供試品溶液，結(jié)果空白溶液及空白輔料對檢測無干擾，

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸峰面積在堿破壞的條件下有明顯增加，在酸、高溫、氧化和光照破壞條件下無明顯增加，并且已破壞樣品溶液經(jīng)本檢測方法檢測均只顯

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸峰，表明鹽酸美金剛片經(jīng)酸、堿、高溫、氧化和光照破壞后，均無其他雜質(zhì)干擾，方法專屬性強，見圖4。

圖4 專屬性試驗色譜圖Fig 4 Chromatograms of specificity test

2.7 線性關(guān)系考察

按照“2.2.1”項下方法配制一系列線性溶液，取各線性溶液10 μL 進樣，記錄峰面積。結(jié)果顯示

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸的擬合方程為

y

＝ －0.5200

x

＋6993

x

－2626，

r

＝0.9998，其在0.0102 ～0.102 00 μg·mL與峰面積呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

2.8 檢測限與定量限

精密稱取

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸對照品適量，用甲醇-水（50∶50）溶解并定量稀釋制成一定濃度的樣品溶液，按“2.1”項下條件測定。信噪比（

S

/

N

）約為3 作為檢測限，

S

/

N

約為10 作為定量限，結(jié)果

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸的檢測限為3.2 pg，定量限為14.7 pg。

2.9 加樣回收試驗

將鹽酸美金剛片劑1 片置于100 mL 量瓶中，用甲醇-水（50∶50）適量溶解，再精密加入

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸對照品溶液（102 μg·mL）250 μL，用甲醇-水（50∶50）稀釋至刻度，搖勻，作為50%限度測試溶液。同法配制100%和150%限度測試溶液。每個濃度配制3 份，分別按“2.1”項下條件測定，計算回收率。結(jié)果顯示，

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸的加樣回收率在92.5%～105.7%，

RSD

＜6.5%，符合方法學要求，見表1。

表1 加樣回收率結(jié)果
Tab 1 Recovery of standard addition

限度測試溶液加入量/（μg·mL－1）實測量/（μg·mL－1）回收率/%平均回收率/%RSD/%50%0.2550.2925102.0103.81.8 0.2550.3020105.7 0.2550.2971103.8 100%0.5100.5377 99.1 99.03.9 0.5100.5172 95.1 0.5100.5564102.8 150%0.7650.8158102.4 99.7 6.3 0.7650.8297104.2 0.7650.7403 92.5

2.10 重復性

取同一批樣品，按“2.2.3”項下方法配制6份供試品溶液，測定其中

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸的含量，結(jié)果

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸的含量

RSD

為2.9%，保留時間

RSD

為0.30%，表明方法重復性好。

2.11 耐用性

通過改變流動相流速、柱溫來評估測定條件有微小變動時，對測定結(jié)果的影響，結(jié)果在各個色譜條件參數(shù)下，測得的6 份待測樣品中

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸含量

RSD

均≤10.0%，符合要求，見表2。

表2 耐用性結(jié)果
Tab 2 Durability test

系統(tǒng)適用性峰面積RSD（n ＝6）/%參數(shù)含量/%RSD/%保留時間RSD（n ＝6）/%標準曲線柱溫/℃280.0278.22.50.20y ＝－0.0466x2 ＋6272x ＋4485，r ＝0.9998 300.0312.30.14y ＝－0.5200x2 ＋6993x－2626，r ＝0.9998 320.0271.00.24y ＝－0.2971x2 ＋6597x ＋2404，r ＝0.9997流速/（mL·min－1） 0.4860.0318.82.10.060y ＝－1.2271x2 ＋7535x－3015，r ＝0.9999 0.5000.0322.30.14y ＝－0.5200x2 ＋6993x－2626，r ＝0.9998 0.5150.0274.10.30y ＝0.0777x2 ＋5888x ＋3434，r ＝0.9998

2.12 樣品檢測結(jié)果

取鹽酸美金剛片3 批0 d 樣品和3 批30℃長期試驗樣品（36 個月），按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下條件測定，結(jié)果3 批0 d樣品中

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸均未檢出，3 批30℃長期試驗樣品中

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸含量均為0.2%，樣品中

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸含量均符合限度要求（＜0.5%），結(jié)果見表3。

表3 -(二甲基金剛烷)甘氨酸的含量測定結(jié)果
Tab 3 Content of -(dimethyl-monosane) glycine

批號含量/%01171202（0 d）0 01171203（0 d）0 01171204（0 d）0 01171202（30℃，36 個月） 0.2 01171203（30℃，36 個月） 0.2 01171204（30℃，36 個月） 0.2

3 總結(jié)

降解雜質(zhì)

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸在放置過程中會隨著時間的延長而增加，目前針對此雜質(zhì)定量研究的文獻報道較少，僅有鹽酸美金剛片的進口藥品注冊標準對此雜質(zhì)進行了定量控制。本研究采用HPLC-MS 法對

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸進行定量檢測，有效解決了因目標物紫外吸收弱而無法使用液相色譜法、因易發(fā)生高溫降解而無法使用氣相色譜法檢測的難題。該方法可操作性強、靈敏度高、檢測時間短，可應用于鹽酸美金剛產(chǎn)品中

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸雜質(zhì)的檢測與控制。